一种检测蓝藻dna损伤的定量pcr试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学和实验方法领域，更具体设及一种定量检测蓝藻细胞质粒 DNA拷贝数和蓝藻DNA损伤的实时巧光定量聚合酶链式反应(Real Time Polymerase化ain Reaction ,Real Time PCR)试剂盒，同时还设及一种蓝藻DNA实时巧光定量PCR试剂盒的用 途。
【背景技术】
[0002] 在分子生物学中，实时巧光定量PCR(real-time quantitative PCR)作为一种给 未知模板进行定量分析的方法，由于其定量准确、灵敏度高、特异性强和重现性好等优点已 经成为一种重要工具，被广泛应用于起始模板的测定、基因型的分析、烙解曲线分析等方面 的研究。
[0003] 研究表明，细胞内的质粒拷贝数与细胞的生长过程相关（Canspu扣E，Azzoni AR, Prazeres DM,Monteiro GA, Mergulh吕OFJ.Mol Biotechnol.2007,37(2) :120-126.)0细 胞质粒的拷贝数与质粒的存在与否和细胞所处的环境和化合物暴露情况密切相关 (Pickett MA,Everson JS,Pead PJ,Clarke IN.Microbiology .2005,151(Pt 3):893-903)。对原核生物细菌中大肠杆菌化scherichia coli)的质粒拷贝数研究的较多，衣原体 的不同种（Chlamydia trachomatis和Qilamydo地iIa pneumoniae(N16))的质粒拷贝数也 有研究。真核生物中中国仓鼠卵巢细胞(化inese hamster ova巧(C册）cells)也有相关报 道。目前尚缺乏对原核生物蓝藻细胞的质粒拷贝数进行定量的方法。对蓝藻质粒拷贝数的 定量，可W评价蓝藻细胞的生理状态，可W检测蓝藻细胞对环境胁迫的响应，从而检测环 境中的危险因素。
[0004] 作为一种灵敏度检测方法，定量PCR已用于检测环境模式生物鎌科硬骨鱼侧边底 鎌（Fundulus heteroclitus)的DNA损伤（Jung D,化O Y,Meyer JN,Di Giulio RT.Comp Biochem 陆ysiol C Toxicol Pharmacol.2009,149(2): 182-6.)。通过对超螺旋的质粒DNA 和癌细胞中的线粒体DNA进行实时巧光定量PCR，表明了模板DNA的构象能够影响该方法对 其的扩增效率（化en J，Kadlubar FF，Chen JZ.Nucleic Acids Res.2007,35(4) :1377-88.)。在实时巧光定量PCR过程中，松弛结构(开环和/或线性)的DNA较超螺旋结构的DNA更 容易得到巧光信号；同时，在开环结构DNA上的链断裂能够引起该方法的灵敏响应(化en J， Kadlubar FF'Chen JZ.Nucleic Acids Res.2007,35(4):1377-88.;Chan SW,Nguyen PN, Ayele D,Qievalier S,Aprikian A,Qien JZ.Mu1:at Res.2011,716(1-2):40-50.)。利用该 方法已成功运用于男性尿液中少量前列腺细胞的线粒体DNA损伤的早期检测（畑an SW， Nguyen PN,Ayele D,Qievalier S,Aprikian A,Qien JZ.Mutat Res.2011,716(1-2):40-50 .)。目前尚缺乏利用定量PCR方法对蓝藻细胞DNA损伤的方法。对蓝藻细胞DNA损伤的检 测，可W灵敏评估蓝藻细胞对环境胁迫的响应，在蓝藻水华预警中具有实际的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在于提供了一种通过定量检测蓝藻细胞质粒和蓝藻细胞DNA损伤 的实时定量PC时式剂盒，用于评价蓝藻细胞的生理状态，和蓝藻细胞对环境胁迫的响应。该 试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪。本发明能够检测蓝藻细 胞的质粒拷贝数水平，判断蓝藻细胞正常与否，W及蓝藻细胞的DNA损伤程度，在蓝藻细胞 对环境胁迫的响应方面有良好的应用前景。
[0006] 本发明的另一目的是在于提供了一种检测蓝藻DNA损伤的定量PC时式剂盒在蓝藻 细胞的质粒拷贝数定量和DNA损伤检测中的应用，该试剂盒的灵敏度和特异性高，检测方法 简便、快速，实验结果可靠。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施：
[000引一种检测蓝藻D N A损伤的定量P C R试剂盒，该试剂盒，包括：包含聚球藻 (Synechococcus sp.)anl50基因的引物的普通PCR反应液1{多个公司的2XTaq PCR Master Mix均可，如天根生化的2x PCR Reagent化T207)}、包含聚球藻（Synechococcus sp.)CDS:ABB57481.1基因的引物的普通PCR反应液II{多个公司的2Xl'aqPCRMasterMix 均可，如天根生化的2x PCR Reagent化T207)}、空白对照品（无菌的超纯水）、包含聚球藻 (Synechococcus SP. )anl50基因的定量PCR引物的定量PCR反应液I {多个公司的2 X real time PCR Mix均可，如Qiagen的QuantiTect Primer Assay(P;roduct no. 249900)巧日包含 聚球藻（Synechococ州S sp.)CDS:ABB57481.1基因的定量PCR引物的定量PCR反应液II{:多 个公司的2Xreal time PCR Mix均可，如Qiagen的QuantiTect Primer Assay(P;roduct no.249900)}，其特征在于:普通PCR反应液I包含针对聚球藻(Synechococ州S sp. )anl50基 因设计的一对特异性引物，普通PCR反应液II包含针对聚球藻（Synechococcus SP.)CDS: ABB5748 1 . 1基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液I包含针对聚球藻 (Synechococcus sp. )anl50基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液II中包含针对聚 球藻（Synechococ州S sp.)CDS:ABB57481.1基因设计的一对特异性引物。其中扩增anl50基 因的普通PCR上游引物与该基因的结合位置在其定量PCR上游引物与该基因结合位置的上 游，anl50基因的普通PCR下游引物与该基因的结合位置在其定量PCR下游引物与该基因结 合位置的下游。对CDS:ABB57481.1基因用同样的方法设计引物。
[0009]在本发明的一个优选方案中，普通PCR反应液I是由扩增聚球藻（Synechococcus sp.)anl50基因的引物对，2x PCR Reagent化T207,天根生化)和无菌的超纯水组成。在本发 明的一个具体方案中，聚球藻(Synechococ州S sp.)anl50基因的普通PCR正向引物（SEQ ID NO: 1)为5'-CGATTCGCCATGCCGAAGAGG-3'，反向引 物（SEQ ID N0:2)为5'-ACTGTCTCGGCAGCAATTT-3'。
[0010]在本发明的一个优选方案中，普通PCR反应液II是由扩增聚球藻（Synechococcus SP. )CDS: ABB57481.1基因的PCR的引物对，2x PCR Reagent化T207，天根生化)和无菌的超 纯水组成。在本发明的一个具体方案中，聚球藻（Synechococ州S sp. )CDS:ABB57481.1基因 的普通口〇?正向引物（569 10^:3)为5'-〔61(：圳4(：圳6(：1'〔61'刊4〔4-3'，反向引物（569 10 NO:4)为5'-AGCCCTCGTTAGTCCCAGTA-3'。
[0011]在本发明的一个优选方案中，定量PCR反应液I是由anl50基因定量PCR引物对、 QuantiTect Primer Assay(249900，Qiagen)和无菌水组成。在本发明的一个具体方案中， anl50基因的定量PCR正向引物（SEQ ID N0:5)为5'-CATCGCTGGCTT ACAACTG-3'，反向引物 (沈QIDN0:6)为5'-GCTCTGGCTGCTGATACG-3'。
[0012]在本发明的一个优选方案中，定量PCR反应液II是由聚球藻(Synechococcus sp.) CDS:ABB57481.1 基因定量PCR引物对、QuantiTect Primer Assay(249900，Qiagen)和无菌 水组成。在本发明的一个具体方案中，聚球藻（Synechococ州S sp. )CDS:ABB57481.1基因的 定量口〇?正向引物(569 10側:7)为5'-41'口'4〔661'〔6661'