品II的扩增曲线，W及根据该 曲线得到的标准曲线。
[0114] 4)结果分析：
[0115] 图3为正常蓝藻细胞anl50基因的扩增曲线，所测Ct值在15~25之间，在标准品的 线性范围之内，定量结果在8X10 7~9X108拷贝/化左右。图4为也〇2暴露下蓝藻anl50基因 的扩增曲线，与正常的蓝藻细胞相比，也化暴露使蓝藻质粒的拷贝数发生变化（明显增加或 减少）。图5为空白对照品的扩增曲线，结果无扩增信号。图6为正常蓝藻细胞CDS: ABB57481.1基因的绝对定量扩增曲线，所测样本的Ct值在14~17之间，在标准品的线性范 围之内，定量结果为CDS:ABB57481.1基因的拷贝数是3 X IO6~5 X IO7拷贝AiL左右。图7为 H202暴露下蓝藻CDS:ABB57481 . 1基因的绝对定量扩增曲线，H202暴露使蓝藻CDS: ABB57481.1基因的拷贝数发生变化。
[0116] 利用本试剂盒检测聚球藻细胞在正常的生理状态下，随着生长时间的延长，质粒 拷贝数（WanlSO基因拷贝数计算)的变化情况。如表1所示。接种第0~6天，随着生长时间的 延长，质粒拷贝数增加，接种第6天的质粒拷贝数最大，为62 ±22个/细胞;在随后的3天内， 质粒拷贝数降低。
[0117] 利用本试剂盒检测也化暴露情况下的聚球藻细胞内质粒拷贝数水平。从表2可W发 现，不同浓度也〇2暴露聚球藻细胞，质粒的拷贝数与对照组相比，发生了变化。具体来说，1~ SmM也化暴露，随着也化暴露浓度的升高，质粒拷贝数减少，且均低于对照组。4~5mM也〇2暴 露蓝藻细胞，质粒拷贝数增加，且均高于对照组。
[0118] 本试剂盒与用传统的OD值检测蓝藻细胞在环境胁迫下的响应相一致，说明本方法 的可靠性，且灵敏度高，重现性好，为评价蓝藻细胞的生理状态和检测蓝藻细胞在环境胁 迫下的响应提供了有力的检测方法。
[0119] 实施例3:
[0120] 一种检测蓝藻DNA损伤的定量PC时式剂盒在检测蓝藻DNA损伤中的应用，其步骤是：
[0121] 1.相对定量PCR检测anl50基因的扩增差异
[0122] 按照定量PCR反应液I组成，配制定量PCR反应体系，取处理组蓝藻总DNA、对照组蓝 藻总DNAW及空白对照品各化L，体系各主要成分如下：
[0123] 定量PCR反应液I 1化UDNA模板化L总体积20化。
[0124] 设置收集SYBR Green巧光信号的巧光检测通道，将反应管放入定量PCR仪(ABI 7900HT)开始扩增，反应程序如表11:
[0125] 表11相对定量PCR反应程序 [01261
[0127] 2.相对定量PCR检测CDS: ABB57481.1基因的扩增差异：
[0128] 按照定量PCR反应液II组成，配制定量PCR反应体系，取处理组蓝藻总DNA、对照组 蓝藻总DNAW及空白对照品各化L，体系各主要成分如下：
[0129] 定量PCR反应液II 1化UDNA模板化L总体积20化。
[0130] 设置收集SYBR Green巧光信号的巧光检测通道，将反应管放入定量PCR仪(ABI 7900HT)开始扩增，反应程序与步骤1.相同。
[0131] 3.结果判断：
[0132] 基线范围的Ct值(循环数）由软件自动选择(如SDS2.4.1，ABI公司），设定阔值超过 无规则扩增曲线的最高值。巧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值有所不同。
[0133] 4.结果分析：
[0134] 图8为蓝藻细胞在也化暴露下anl50基因的相对定量PCR扩增曲线，所测Ct值在14~ 27之间。图9为蓝藻细胞在也化暴露下CDS:ABB57481.1基因的相对定量PCR曲线，所测Ct值在 23~29之间。利用本发明的试剂盒的蓝藻DNA损伤进行检测，蓝藻细胞anl50基因和CDS: ABB57481.1基因的相对扩增差异如表3所示，随着也化暴露浓度的增加，anl50基因和CDS: ABB57481.1基因的相对扩增差异增加，呈现明显的剂量-效应关系。说明该试剂盒提供的检
【主权项】
1. 一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒，该试剂盒包括:普通PCR反应液I、普通PCR 反应液II、包含聚球藻anl50基因插入序列的标准品I、包含聚球藻的⑶S:ABB57481.1基因 插入序列的标准品Π 、空白对照品、包含聚球藻anl50基因的定量PCR引物的定量PCR反应液 I和包含聚球藻⑶S: ABB57481.1基因的定量PCR引物的定量PCR反应液II，其特征在于:普通 PCR反应液I包含针对聚球藻anl 50基因设计的一对特异性引物，普通PCR反应液II包含针对 聚球藻⑶S:ABB57481.1基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液I包含针对聚球anl50 基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液II中包含针对聚球藻⑶S: ABB57481.1基因设 计的一对特异性引物，其中扩增anl50基因的普通PCR上游引物与该基因的结合位置在其定 量PCR上游引物与该基因结合位置的上游，anl50基因的普通PCR下游引物与该基因的结合 位置在其定量PCR下游引物与该基因结合位置的下游;CDS:ABB57481.1基因的引物设计采 用同样方式； 所述的普通PCR反应液I是由扩增聚球藻anl50基因的引物对，2XTaq PCR Master Mix 和无菌的超纯水组成，anl50基因的普通PCR正向引物为SEQ ID ΝΟ:1，反向引物为SEQ ID NO：2； 所述的普通PCR反应液II是由扩增聚球藻CDS:ABB57481.1的PCR的引物对，2 XTaq PCR Master Mix和无菌的超纯水组成，聚球藻CDS:ABB57481.1的普通PCR正向引物为SEQ ID NO:3,反向引物为SEQ ID N0:4; 所述的定量PCR反应液I是由anl50基因定量PCR引物对、2Xreal time PCR Mix和无菌 水组成，anl50基因的定量PCR正向引物为SEQ ID NO:5,反向引物为SEQ ID NO:6; 所述的定量PCR反应液II是由聚球藻CDS: ABB57481.1基因定量PCR引物对、2 Xreal time PCR Mix和无菌水组成，聚球藻CDS: ABB57481.1基因的定量PCR正向引物为SEQ ID NO:7,反向引物为SEQ ID NO:8; 所述的标准品I是含有聚球藻anl50基因的1401个核苷酸片段，所述的anl50基因的标 准品I为SEQ ID NO: 9，标准品I用Nanodrop进行定量，储存浓度为105拷贝AxL、106拷贝/VL、 1 〇7拷贝ΛΛ、108拷贝/此、109拷贝5个浓度梯度； 所述的标准品Π 是含有聚球藻⑶S:ABB57481.1基因的1414个核苷酸片段，所述的⑶S: ABB57481.1基因的标准品II为SEQ ID NO: 10，标准品II用Nanodrop进行定量，储存浓度为 1 〇4拷贝ΛΛ、105拷贝/此、106拷贝、107拷贝ΛΛ、10 8拷贝ΛΛ 5个浓度梯度； 所述的空白对照品为无菌的超纯水。2. 权利要求1所述的一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒在检测蓝藻质粒拷贝数中 的应用。3. 权利要求1所述的一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒在定量检测蓝藻细胞DNA 损伤中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒及应用，普通PCR反应液I包含针对聚球藻<i>anl50</i>基因设计的一对特异性引物，普通PCR 反应液II包含针对聚球藻CDS: ABB57481.1基因设计的一对引物，定量PCR反应液I包含针对聚球<i>anl50</i>基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液II中包含针对聚球藻CDS: ABB57481.1基因设计的一对引物，其中扩增<i>anl50</i>基因的普通PCR上游引物与该基因的结合位置在其定量PCR上游引物与基因结合位置的上游，<i>anl50</i>基因的普通PCR下游引物基因的结合位置在其定量PCR下游引物与基因结合位置的下游。该试剂盒灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果可靠。适用于蓝藻质粒DNA拷贝数检测和蓝藻DNA损伤的定量检测，对于预测蓝藻水华的爆发和消亡具有实际的应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105695568
【申请号】CN201510881486
【发明人】吴振斌, 陈芝兰, 刘碧云, 周巧红, 贺锋, 徐栋, 田云, 王艳云, 张甬元
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2015年12月3日