专利名称：一种运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法
技术领域：
本发明涉及病原体检验技术，具体地说是运用等温扩增反应来检测梅毒螺旋体的技术。
背景技术：
梅毒螺旋体是所致的是一种广泛流行的性病，在中国发病率又有所回升。梅毒螺旋体只感染人类，分获得性梅毒与胎传梅毒。获得性梅毒主要通过性接触传染；胎传梅毒由梅毒螺旋体通过胎盘，从脐带血循环传给胎儿，可引起胎儿全身感染。螺旋体在胎儿内脏及组织中大量繁殖，可引起胎儿死亡或流产。快速、准确的检测梅毒螺旋体对治疗和预防梅毒的蔓延有重大意义。随着分子生物学的发展，检验检疫工作中的微生物鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。最新开发出来的等温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。
发明内容
针对梅毒螺旋体，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用等温扩增技术快速、便捷、低成本的检测方法。本发明提供了更加快速和低成本通过等温扩增方法检测梅毒螺旋体的方法。本发明是通过以下技术方案实现的(I)设计特异性寡核苷酸引物用于等温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；(4)扩增完毕后可通过加入荧光染料SYBR Green观察颜色变化，或通过电泳带形分析检测结果。该方法包括应用该方法检测梅毒螺旋体所使用的引物组和与之配套的等温扩增反应条件。其中引物序列如下该引物序列参照GenBank 中的序列 CP001752 Treponema pallidum subsp.pallidum str. Chicago, complete genome 中 116730 至 117060 喊基。引物SEQ ID NO. I 5’ -CAGCACTCGTCTTCAACTCCTTGGTAGAAGGGAGGGCTSEQ ID NO. 2 5’ -GAGATCTTAGGCAGGATGTTATTCTACAGGGTCAGTAASEQ ID NO. 3 :5’ -TGACAGAGTCTTCTGTGCTCACGSEQ ID NO. 4 :5，-ACACCATTCGCACACGCGCAATSEQ ID NO. 5 :5’ -GAGGTGAACTCCGTATT
SEQ ID NO. 6 :5’ -AATGACCTGCACTGCGTG。本发明用特异性的引物组扩增梅毒螺旋体，反应后目测结果和电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。本发明中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶 5U/ pLIjuL
Bst酶缓冲液 -5 pL
SEQ ID NO. I ΙΟμηιοΙ/LI μι
SEQ ID NO. 2 10 μ mol/LI μ L
SEQ ID NO. 3 10 μ mol/LO. 5 μ L
SEQ ID NO. 4 10 μ mol/LO. 5 μ L
SEQ ID NO. 5 10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 6 10 μ mol/LO. 2 μ L
DNA样品2 μ L
双蒸水13. 8μ
总体积25 μ L其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比0. 1% Triton X-IOOUOmM dNTP，且pH为8. 8。等温扩增程序为(1)63°C90 分钟；(2) 80 °C2 分钟。等温扩增产物可通过两种方法检测(I)将反应液中加入SYBR Green染料，阳性结果呈绿色，阴性结果为棕黄色。(2)吸取2 μ L反应液在含SYBR Green染料的I %浓度(W/V)的琼脂糖凝胶中电泳，可见阳性结果有呈阶梯状排列的电泳条带，阴性结果则没有。如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定是否存在梅毒螺旋体，需重新检验。 与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于等温扩增的鉴定方法适用于直接从临床样品中扩增靶基因，只需要一次等温扩增反应就能够检测梅毒螺旋体是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法制仅需要简单的设备——一个恒温水域、一个离心机或普通电泳设备即可，大大提高了性价比节约了成本。等温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的病原体。它通过扩增靶基因，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和病原体生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确
图I样品检测结果，样品DNA使用等温扩增梅毒螺旋体检测技术检测，反应物加染料，可目测变色结果。管I为梅毒螺旋体阳性参考品；管2为待测样品；管3为阴性对照。图2样品检测结果，样品DNA使用等温扩增梅毒螺旋体检测技术检测，吸取2 μ L反应液在含SYBR Green染料的I %浓度(W/V)的琼脂糖凝胶中电泳，泳道I为分子量标准，泳道2为梅毒螺旋体阳性参考品；泳道2为待测样品；泳道4为阴性对照。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I 某临床阳性样本，然后进行如下等温扩增技术检测I.取样本，在TE缓冲液中重悬，加入1000 μ I裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20°C保存。2.等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶5U/mLI μ
Bst酶缓冲液—5μ
SEQ ID NO. I 10 μ mol /LI μ L
SEQ ID NO. 210 μ mol /LI μ L
SEQ ID NO. 310 μ mol/LO. 5 μ L
SEQ TD NO. 410 μ mol/LO. 5 μ L
SEQ ID NO. 510 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 610 μ mol/LO. 2 μ L
DNA样品2 μ L
双蒸水I 3. 8 μ L
总体积25 pL其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比0. 1% Triton X-IOOUOmM dNTP，且pH为8. 8。等温扩增程序为(1)63°C90 分钟；(2) 80 °C2 分钟。等温扩增共进行3管检测，其中DNA样品所加入的分别为管I为梅毒螺旋体阳性参考品；管2为待测样品；管3为阴性对照。3.被检测样品结果观察(I)等温扩增产物加入染料，梅毒螺旋体DNA模板标准品和待测样品DNA的反应物颜色变为绿色，阴性对照为棕黄色没有变化。结果如图I。
(2)等温扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，梅毒螺旋体DNA模板标准品和待测样品DNA有间隔约为200bp的阶梯状电泳条带，无DNA阴性对照没有电泳条带，结果如图2。实验表明待测样品中含有梅毒螺旋体。
权利要求
1.一种运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，其特征在于，包括以下六个引物SEQ ID NO. I 5，-CAGCACTCGTCTTCAACTCCTTGGTAGAAGGGAGGGCTSEQ ID NO. 2 5，-GAGATCTTAGGCAGGATGTTATTCTACAGGGTCAGTAASEQ ID NO. 3 :5’ -TGACAGAGTCTTCTGTGCTCACGSEQ ID NO. 4 :5’ -ACACCATTCGCACACGCGCAATSEQ ID NO. 5 :5’ -GAGGTGAACTCCGTATTSEQ ID NO. 6 :5’ -AATGACCTGCACTGCGTG。
2.根据权利要求I所述的运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst 酶5U/pLΙμΙBst酶缓冲液-5pL SEQ ID NO. I:10 μ mol/LI μ L SEQ ID NO. 210 μ mol/LI μ L SEQ ID NO. 310 μ mol/LO. 5 μ L SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 5 μ L SEQ ID NO. 5ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 6:10 μ mol/L0. 2 μ L DNA样品2 μ L 双蒸水13. 8pL总体积25 μ L 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。
3.—种权利要求I所述的运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，其特征在于，核酸扩增程序为 (1)63°C90 分钟； (2)80 °C 2 分钟。
4.一种权利要求I所述的运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，其特征在于，将反应液中加入SYBR Green染料，阳性结果呈绿色，阴性结果为棕黄色。
5.一种权利要求I所述的运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，其特征在于，吸取2 μ L反应液在含SYBR Green染料的I %浓度(W/V)的琼脂糖凝胶中电泳，可见阳性结果有呈阶梯状排列的电泳条带， 阴性结果则没有。
全文摘要
本发明公开了一种运用核酸恒温扩增技术检测梅毒螺旋体的试剂和检测方法，设计了六个引物组序列，5’-CAGCACTCGTCTTCAACTCCTTGGTAGAAGGGAGGGCT；5’-GAGATCTTAGGCAGGATGTTATTCTACAGGGTCAGTAA；5’-TGACAGAGTCTTCTGTGCTCACG；5’-ACACCATTCGCACACGCGCAAT；5’-GAGGTGAACTCCGTATT；5’-AATGACCTGCACTGCGTG。针对梅毒螺旋体，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用核酸恒温扩增技术快速低成本的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102618639SQ201210065229
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者刘启军, 刘寅, 刘振宇, 刘智勇, 李秀平, 祁军, 詹曦菁 申请人:中华人民共和国天津出入境检验检疫局