专利名称：花生 β-1,3-葡聚糖酶基因及其在提高花生抗病性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及花生3-1，3-葡聚糖酶基因及其在提高花生抗病性中的应用。
背景技术：
花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。花生生产中长期存在叶斑病、锈病、青枯病、黄曲霉病等多种真菌类病害，严重影响着花生的产量和品质。随着生物技术的发展，利用基因工程技术将相关抗性基因导入花生，通过过量表达外源基因使植物抵御病原真菌的侵袭，是当今提高花生抗病性及生产力的有效策略。
植物受病原菌侵染会产生各种水解酶及病程相关蛋白(PR蛋白)，P -I, 3-葡聚糖酶(P-l，3-glucanas，Glu)是PR蛋白中重要的水解酶，可降解病原真菌细胞壁中的主要成分￠-1,3-葡聚糖，从而破环细胞壁新物质的沉积致使病原真菌死亡，在植物抵御真菌病害的防卫反应中发挥着重要作用。正常植物中￠-1, 3-葡聚糖酶表达量极少，虽然在病原真菌及激发子诱导下可诱导表达，但仍不能有效地抵抗病原真菌的侵染。因此人们试图从植物中克隆Glu基因，并通过遗传转化提高转基因植物的抗病性，但关于花生Glu基因的克隆在国内外均未见报道。发明内容
针对现有技术中正常花生中￠-1, 3-葡聚糖酶表达量极少难以有效抵抗病原真菌侵染的现状，本发明提供了花生￠-1,3-葡聚糖酶基因及其在提高花生抗病性中的应用，本发明在花生中克隆Glu基因的全长cDNA序列，并构建过量表达载体转化花生，研究 Glu基因在转基因花生中的表达模式，筛选出过量表达高抗真菌性病害的转基因花生株系。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现
花生￠-1,3-葡聚糖酶基因，其序列表如SEQ ID No: I所示。
该基因第134bp 567bp为一内含子，开放阅读框大小为1047bp，翻译产物含348 个氨基酸，其中信号肽长度27个氨基酸，蛋白质分子量38806. 55道尔顿。
克隆所述Ah-Glu基因的PCR引物为
正向引物5'-AGCTTCAGCTTCACCTCTCG-3'，
反向引物5'-CAACAGCACCTCTTCAAGTG-3'。
克隆所述Ah-Glu基因的PCR扩增体系为总体积25ii L，其中dNTPs 0. 4mmol/L, 上游和下游引物各 0. 4mmol/L，10XPCR buffer 2. 5 y L，Mg2+3. Ommol/L，基因组 DNA 50ng, Taq聚合酶2. 5U，双蒸水13. 5uL0
PCR扩增程序为:94°C预变性4min ;94°C变性lmin，58°C复性lmin，72°C延伸 lmin, 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
本发明还提供了所述的花生￠-1, 3-葡聚糖酶基因的植物表达载体。
所述植物载体为pCAMBIA1301_Glu。
本发明还提供了所述的花生￠-1, 3-葡聚糖酶基因在提高花生抗病性中的应用。 转基因植株对花生黑斑病和褐斑病的抗性增强。
将花生￠-1, 3-葡聚糖酶基因转入花生，对花生转基因植株进行PCR检测的引物为
上游引物5'-CACACCGATACCATCAGAGAT-3'，
下游引物5'-TCACCGAAGGGCATGCCAGTC-3'。
对花生转基因植株进行PCR检测的反应体系为25 iiL，其中dNTPs 0. 25mmol/L，上游和下游引物各 0. 4mmol/L, 10XPCR buffer 2. 5 y L，基因组 DNA50ng，Taq 聚合酶 I. 0U，双蒸水 13. 5 u L0
PCR 反应程序为94°C变性 4min ;94°C变性 50s，56°C退火 50s，72°C延伸 40s，30 个循环；72°C延伸IOmin。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
I、本发明从花生中克隆了 3-1，3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)，测序结果表明该基因开放阅读框大小为1047bp，翻译产物含348个氨基酸，其中信号肽长度27个氨基酸，蛋白质分子量38806. 55道尔顿。
2、将该基因连接到pCAMBIA1301质粒上构建植物过量表达载体 pCAMBIA1301-Glu,并通过农杆菌介导法转化花生。RT-PCR结果表明转基因植株Ah-Glu基因表达量明显高于非转基因植株。转基因植株离体叶片接种花生黑斑病菌和大田观察，抗病性均高于非转基因植株。本发明的技术方案将为花生基因工程抗病育种及避免安全性隐患开辟新的途径，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清/E. o
图I是本发明中Ah-Glu基因PCR及RT-PCR结果。M =Maker G ；1 :水对照；2 =DNA 扩增结果；3 :未经水杨酸诱导的RT-PCR ；4 :经水杨酸诱导的RT-PCR。
图2是Ah-Glu蛋白质blast比对结果图。
图3是本发明中所构建的植物表达载体图pCAMBIA1301_Glu。
图4是本发明中植物表达载体pCAMBIA1301_Glu的PCR扩增及双酶切验证。Ml DL 2000maker ；1 :水对照；2 :PCR 扩增结果；3 =XbaI 和 PstI 双酶切结果；M2 DL15000makero
图5是本发明中农杆菌介导的花生遗传转化过程。5-1 :体胚诱导；5_2 :体胚萌发； 5-3 :再生植株。
图6是本发明中图转基因花生的PCR检测。M DL2000Maker ；1 :水对照；2 :质粒； 3 :非转基因植株；4-13 :转基因植株。
图7是本发明中转基因植株的GUS染色检测结果。左侧为非转基因植株，右侧为转基因植株。
图8是本发明中转基因植株Ah-Glu基因RT-PCR扩增结果。M =Marker G ；1 :质粒；2 :水对照；3 :非转基因植株；4-8 :转基因植株。
图9是本发明中转基因植株Ah-Actin内参基因RT-PCR扩增结果。M :Marker DL2000 ；1 :质粒；2 :水对照；3 :非转基因植株；4-8 :转基因植株。
图10是本发明中转基因花生离体叶片接种花生黑斑病菌检测抗病性结果。左侧为非转基因植株叶片，右侧为转基因植株叶片。
图11是本发明中非转基因与转基因花生的田间抗病性比较。左侧为非转基因植株，右侧为转基因植株。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例I
一、实验材料
I.菌种与花生品种
大肠杆菌DH5 a、根癌农杆菌菌株EHA105由青岛农业大学遗传研究室保存，基因克隆材料为花生品种“花育20号”，转基因受体材料为花生品种“花育22号”。
2.植物培养基
花生遗传转化中采用的培养基有3种
(I)体胚诱导培养基(MS-B5，添加 10mg/L 2，4_D)；
(2)体胚萌发培养基(MS-B5，添加4mg/L BAP)；
(3)筛选培养基(MS-B5,添加15mg/L潮霉素)。
二、实验方法
技术领域：
本发明包括以下具体实验步骤
I、花生基因组DNA、mRNA的提取及cDNA序列的获得
利用CTAB法提取花生幼叶基因组DNA。mRNA的提取采用Trizol法用I. 5mmol/ L水杨酸溶液喷施花生叶片进行诱导处理48小时，取0. 3g经水杨酸诱导的花生叶片及对应的未经水杨酸诱导的空白对照，加入ImL Trizol冰浴研磨,室温下放置5min。加入2mL氯仿，剧烈混合3min, 4°C下12000r/min离心15min。上清移至无菌且RNase free的离心管中，加入2倍体积乙醇,_20°C放置IOmin,4°C下12000r/min离心5min。弃上清，以75%乙醇洗漆沉淀两次。稍干后，用无RNase的灭菌水溶解沉淀。cDNA的合成按反转录试剂盒说明书步骤进行。
2、花生3-1，3-葡聚糖酶基因的克隆
根据拟南芥@ -1,3-葡聚糖酶的保守性氨基酸序列(GeneBank AAA32864. I)在 http://www. ncbi. nlm. nih. rovBLAST/站点进行花生EST数据库的TBLASTN检索,获得与之部分相似的花生EST群,利用http://pbil. univ-lyonl. fr/cap3. php上的CAP3软件,进行 EST序列拼接组装为重叠群(contig)，即为预测的花生￠-1, 3-葡聚糖酶基因cDNA序列， 全长 1326bp。
根据该预测序列设计Ah-Glu基因扩增引物
正向引物5'-AGCTTCAGCTTCACCTCTCG-3' (SEQ ID No :3);
反向引物5'-CAACAGCACCTCTTCAAGTG-3' (SEQ ID No :4)。
以此引物对DNA及cDNA进行扩增，DNA扩增产物I. 5kb，经水杨酸诱导后扩增产物I. lkb，未经水杨酸诱导无扩增产物(如图I所示)。将扩增产物回收、纯化后克隆到 PMD18-T载体上，得到T-Glu重组质粒，送生工上海公司进行测序。测序结果如下SEQ ID No 1所示。
SEQ ID No : I 序列全长 1563bp, ORF :1481bp,内含子434bp (即 134bp 567bp)， 外显子:1047bp，符合GT......AG剪接规律。
cDNA序列如SEQ ID No :2所示,cDNA序列共1129bp ;编码序列为1047bp,编码产生348个氨基酸；编码产生的氨基酸序列如SEQ ID NO : 5所示。
3、花生0 -1,3-葡聚糖酶基因的结构分析及功能预测及同源性分析
利用NCBI网络资源和DNAMAN软件对克隆的Ah-Glu基因编码蛋白结构及理化性质进行分析预测。将预测的蛋白质序列(SEQ ID NO 5),用BLASTP(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)搜索蛋白质数据库，进行同源性搜索和比对，构建蛋白质进化树，如图2所/Jn o
Ah-Glu编码蛋白与其它植物3-1，3-葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列进行比对， 同源性为41% 90%，与大豆的同源性达到90%。
4、植物表达载体的构建
用XbaI, PstI分别双酶切pCAMBIA1301和T-Glu载体，回收目的片段，用T4DNA 连接酶将Glu片段连接到表达载体pCAMBIA1301中Actinp启动子后面，得到重组质粒 pCAMBIA1301-Glu,如图3所示。重组质粒经PCR扩增及XbaI, PstI双酶切，均得到I. Ikb 片段，如图4所示。
5、花生遗传转化研究
利用农杆菌介导法将重组质粒pCAMBIA1301_Glu转化花生胚小叶外植体。首先将花生胚小叶连同胚轴胚根切下并进行表面消毒，无菌水浸泡过夜；将胚小叶从胚轴胚根处分离出来预培养3天；用0D_为0. 6的农杆菌进行侵染，侵染10到15分钟，黑暗共培养 3天；将共培养结束的胚小叶移至添加15mg/L潮霉素筛选剂体胚诱导培养基中诱导体胚4 周；将诱导出的体胚移至添加15mg/L潮霉素筛选剂的体胚萌发培养基培养4个月，即可得到再生小苗，如图5所示。
6、转基因植物分子鉴定及⑶S染色
提取转基因植株基因组DNA，利用⑶S基因进行PCR扩增检测，得到约410bp的目的片段，如图6所示。GUS染色方法剪取叶片放到空离心管中，往离心管里加入GUS染色液，盖上离心管盖，放到37°C 3小时 过夜，将叶片转入70%酒精中脱色2 3次，至阴性对照材料为黄色或白色。染色结果如图7所示。
⑶S基因检测引物为
上游引物5'-CACACCGATACCATCAGAGAT-3' (SEQ ID No 6),
下游引物5'-TCACCGAAGGGCATGCCAGTC-3' (SEQ ID No :7)。
7、转基因植株RT-PCR分析
提取转基因总RNA，反转录为cDNA，利用Ah-Glu基因引物进行RT-PCR扩增检测， 扩增用引物为
正向引物5'-AGCTTCAGCTTCACCTCTCG-3'，
反向引物5'-CAACAGCACCTCTTCAAGTG-3'。
转基因植株均扩增出I. Ikb的片段，非转基因植株未扩增出相应目的片段，如图8 所示。说明导入的外源基因在mRNA水平得到表达。
以花生Actin基因为内参进行RT-PCR扩增检测，非转基因及转基因植株均扩增出相应的380bp片段(如图9)。Ah-Actin扩增引物为
正向引物5'-GTGGCCGTACAACTGGTATTGT-3'，
反向引物5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT-3'。
8、转基因植物的抗病性检测
用沾有吐温的湿布擦拭离体叶片后浸泡在花生黑斑病菌孢子液中，将沾有孢子和菌丝的离体叶片放入湿润的灭菌沙土中，保湿培养3周后，观察转基因植株叶片及非转基因植株叶片染病情况。对嫁接到田间的转基因植株观察其在自然条件下田间抗病情况。结果表明，在离体接菌及田间自然生长情况下，转基因植株的发病程度均比非转基因植株要弱。如图10、图11所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
权利要求
1.花生￠-1,3-葡聚糖酶基因其序列表如SEQ ID No:l所示。
2.根据权利要求I所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因，其特征在于该基因第 134bp飞67bp为一内含子，开放阅读框大小为1047bp，翻译产物含348个氨基酸，其中信号肽长度27个氨基酸，蛋白质分子量38806. 55道尔顿。
3.根据权利要求I所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因，其特征在于克隆所述基因的PCR引物为正向引物5’ -AGCTTCAGCTTCACCTCTCG-3’，反向引物5’-CAACAGCACCTCTTCAAGTG-3’。
4.根据权利要求I所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因，其特征在于克隆所述基因的PCR扩增体系为总体积25mL，其中dNTPs 0. 4 mmol/L，上游和下游引物各0. 4 mmol/ L，1(TPCR buffer 2. 5mL，Mg2+3. 0 mmol/L,基因组 DNA 50ng，Taq 聚合酶 2.5U，双蒸水13.5mL ；PCR扩增程序为94°C预变性4min ; 94°C变性lmin，58°C复性lmin，72°C延伸I min，35 个循环；72。(^延伸 I Omin0
5.含有权利要求I所述的花生P-I, 3-葡聚糖酶基因的植物表达载体。
6.根据权利要求5所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因的植物表达载体，其特征在于所述植物载体为pCAMBIA1301-Glu。
7.根据权利要求I所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因在提高花生抗病性中的应用。
8.根据权利要求7所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因在提高花生抗病性中的应用，其特征在于转基因植株对花生黑斑病和褐斑病的抗性增强。
9.根据权利要求7所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因在提高花生抗病性中的应用，其特征在于将花生￠-1, 3-葡聚糖酶基因转入花生，对花生转基因植株进行PCR检测的引物为上游引物5 -CACACCGATACCATCAGAGAT-3 ，下游引物5 -TCACCGAAGGGCATGCCAGTC-3 。
10.根据权利要求9所述的花生￠-1,3-葡聚糖酶基因在提高花生抗病性中的应用，其特征在于对花生转基因植株GUS基因进行PCR检测的反应体系为25 ML，其中dNTPs 0. 25 mmol/L,上游和下游引物各 0. 4 mmol/L, 10'PCR buffer 2. 5 mL,基因组 DNA 50ng, Taq 聚合酶1.0 U，双蒸水13. 5mL;PCR反应程序为94°C变性4 min ； 94°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸40s，30个循环；72°C延伸10 min。
全文摘要
本发明提供了花生β-1,3-葡聚糖酶基因，该基因含有一个434bp的内含子，开放阅读框大小为1047bp，翻译产物含348个氨基酸，其中信号肽长度27个氨基酸，蛋白质分子量38806.55道尔顿。将该基因连接到pCAMBIA1301质粒上构建植物过量表达载体pCAMBIA1301-Glu，并通过农杆菌介导法转化花生。RT-PCR结果表明转基因植株Ah-Glu基因表达量明显高于非转基因植株。转基因植株离体叶片接种花生黑斑病菌和大田观察，抗病性均高于非转基因植株。本发明的技术方案将为花生基因工程抗病育种及避免安全性隐患开辟新的途径，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
文档编号C12N15/82GK102533820SQ201210065250
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者丁霄, 乔利仙, 刘文平, 王晶珊, 隋炯明 申请人:青岛农业大学