专利名称：花生油体蛋白基因启动子在驱动外源基因在转基因植物种子中特异表达上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因启动子，特别是涉及花生油体蛋白^w/eo >^7.S基 因启动子在驱动外源基因在转基因植物种子中特异表达上的应用。
背景技术：
启动子(Promoter)是RNA聚合酶能够识别并与之结合从而起始基因转 录的DNA序列，是重要的顺式作用元件，位于结构基因5、端上游区的DNA 序列，能指导全酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特 异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是 转录调控的中心。
目前，植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子(Constitutive promoter),研究发现在组成型启动子的控制下外源基因的表达存在一些缺陷， 而种子特异性启动子具有显著的组织和发育时期的特异性，可以控制外源基因 在植物种子中高效表达，避免外源基因在植物的其他部位表达，也可避免外源 基因在转基因诉诸植株中非特异表达所造成的能量负荷和物质浪费，减少对植 物的不利影响，同时还发挥了植物种子作为蛋白高效表达和贮存器官的优势。 因此，利用种子特异性启动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要的理论 和实践意义。
种子特异性启动子区别于其它类型启动子的一个显著特点是在该类启动 子上游存在一些特异的调控元件，这些调控元件与调控种子特异性基因的特异表达有关，如RY基序、GCN4基序、E盒、G盒、CAAT盒和B盒等。
随着植物基因工程的发展， 一些种子特异性启动子被克隆，成为转基因技 术中的有利工具，这些种子特异性启动子有的是贮藏蛋白来源的种子特异性启 动子，如1.7S蛋白基因启动子、谷蛋白基因启动子、豆球蛋白基因启动子、 油体蛋白基因启动子、云扁豆蛋白基因启动子、2S清蛋白基因启动子和伴大 豆球蛋白基因启动子等，有的是非贮藏蛋白来源的种子特异性启动子，如USP 基因启动子、棉花酰基载体蛋白硫酯酶基因启动子等。这些启动子都能驱使 GC/S报告基因或外源基因在植物种子中特异和高效表达。
种子贮藏蛋白是包括人类在内的动物界食用蛋白的第一来源，据估计，人 类有50%的食物蛋白直接来源于谷类种子。在种子发育过程中，贮藏蛋白基因 是少数几个在种子中大量表达的基因；种子贮藏蛋白是基因表达的直接产物， 大量积累于种子中；种子发育的生理学和遗传学研究比较深入，这些有利因素 使种子贮藏蛋白基因成为研究基因调控的理想对象，因此，从种子贮藏蛋白基 因中克隆种子特异性启动子是十分有效而简便的方法，并且具有巨大的潜在市 场价值和应用价值。
油体蛋白基因启动子，脂类是植物种子贮藏能量最为有效的形式，贮藏于 油质体中，油质体的1%~4%由油体蛋白(oleosin)组成。Oleosin基因的表达 具有胚胎特异性，对ABA、渗透式及茉莉酸敏感。早期研究发现，来源于拟 南芥的油体蛋白oleosin启动子的-1100~-600和-44 -200区对基因的数量表达 起正调控作用，-600—400区对基因的数量表达起负调控作用，-2500 -1100区 在胚发育早期起调控作用，-400~-200区是^六和山梨酸应答区(Plantetal.， 1994)。后来研究发现，oleosin启动子中ABRE元件与转录激活因子ABI3相互作用，诱导种子特异性表达(Crowe etal.， 2000)。 Junko等(刘晓娜等，种 子特异性启动子研究进展，植物学通报，2007， 24 (2): 218-225)利用水稻 18kDa oleosin启动子驱动亚油酸异构酶基因在转基因水稻中表达，提高了水稻 中亚油酸的含量，并且增强了稻米防癌和抗动脉硬化的功能。可见，oleosin 启动子的功能才刚刚被发发掘出来，还有很大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是基于种子特异性启动子的巨大应用潜力，提供花生油体蛋 白^K /eoW"77.S基因启动子在驱动外源基因在转基因植物种子中特异表达上 的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
花生油体蛋白基因^wfeow'"77.S属于贮藏蛋白基因，其GenBank登录号 为EF695400。本发明人通过对该基因进行研究发现，花生油体蛋白基因 乂/zo/m^77.S上游第524位~第1576位共长1053bp的启动子序列具有指导基 因在植物种子中表达的能力，可驱使外源基因在种子和萌发幼胚组织中特异表 达，同时对该序列的结构进行分析，发现第1442位~第1445位为TATA框， 第1342位~第1345位的区段上有CAAT框，除此之外，该1053bp的序列上 还包含4个E盒、4个RY基序、2个SEF-3基序和2个G盒，其中RY基序 对于启动子的种子特异性具有决定意义(Fujiwara et al., Plant Mol Biol, 24:261-272， 1990; Baumlein et al., Plant J， 2:233-239, 1992; Rerie et al., Plant Cell Biochem Biotech, 1:53-104, 1992)， SEF-3基序和G盒也存在于多种种子特异 启动子中(Williams et al.， Plant Cell, 4:485-496, 1992; Wu et al ., Plant J, 23: 415-421,2000)。本发明的花生油体蛋白^zo/ew/"77.S基因启动子可作为启动子元件，与 其它任何一种外源基因连接，插入植物双元表达载体中，构建重组表达载体。
上述外源基因可以为任意目的基因序列，如同源植物、外源植物、真菌、 藻类、细菌、病毒、动物或人类基因，也可以是人工设计合成的DNA序列， 这些序列可以是一段编码有功能的蛋白质或其一部分的正义序列或一段反义 序列。
上述植物双元表达载体可以为任意一种植物双元表达载体，如pBI101系 列载体、pBI121载体或pCAMBIA系列载体等植物表达载体。
本发明的花生油体蛋白^ o/e仍/w77,S基因启动子，或上述由该启动子序 列与外源基因构建的重组表达载体可转化埃希氏大肠杆菌(&c/^n'c/7/fl co//)、 土壤根癌农杆菌"gro^cfehi/w加we/ac/ms)等微生物制备重组微生物，用于 制备转基因植物或表达外源蛋白。
本发明的花生油体蛋白^^/eow'"77.S基因启动子，或上述由该启动子序 列与外源基因构建的重组表达载体可转化宿主细胞或宿主组织及其后代，以此 来进行植物的品质改良或生产外源蛋白。所述植物宿主细胞或宿主组织是植物 细胞或植物种子本身，或它们的后代。
本发明的花生油体蛋白屈o/e^"77.S基因启动子在植物组织中的表达， 可采用如下步骤
(1) 将含有本发明花生油体蛋白^^few/W7.S基因启动子序列的重组表达 载体转化植物细胞；
2) 使上述植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。 本发明的重组表达载体的构建可采用本领域的常规做法，构建好的重组表达载体可采用任意一种适应于植物细胞或植物的转化方法(如农杆菌介导侵染 法、电击法、基因枪轰击法、花粉管导入法、细胞和原生质体显微注射法等) 将其转入植物细胞或组织中，被转化后的细胞在合适的条件下就可大量增殖或 再生成完整的转基因植株。
本发明的花生油体蛋白^^few/"/7.S基因启动子能有效诱导外源基因特 异地在种子和萌发幼苗组织中表达，因此可用于转基因植物中改良植物的品 质，或改变植物种子发育过程的物质代谢和运输以及种子的生理生化特性，所 述植物包括单子叶植物和双子叶植物；也可以用于生产外源蛋白，如生产人类 食物、动物饲料、化妆品或药品等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1 .对于植物来说种子是重要的繁殖和营养贮存器官，它可以高效地表达和 稳定积累大量的蛋白质等重要的基因产物，本发明的花生油体蛋白 ^zo/eos/w/7.S基因启动子把外源目的基因的表达局限在种子或胚组织中，从而 有效地避免了外源蛋白在成熟的根、茎、叶花等器官中的积累所造成的对植物 生长的影响和能量物质的浪费；
2. 本发明的花生油体蛋白乂to/eos/"77.S基因启动子可以诱导外源目的基 因在种子中特异表达，且表达产物被贮存在成熟种子中，从而大大减少了表达 产物存贮上的物理空间限制，有利于表达产物的高水平累积，同时可以在常规 条件下长期保存，同时因为表达产物被贮存在种子中，其含量和纯度也就相对 较高，这就使得表达产物的回收纯化变得相对简单易行；
3. 本发明的花生油体蛋白^zo/eo^"77.S基因启动子对植物品种的品质改 良、发育与代谢调控和利用转基因植物来生产外源蛋白非常有用，对今后转基因植物具有重大应用前景。
图1为PCR扩增^/w/eow'"77.S基因启动子的电泳图； 其中，M为分子量Marker， 1为PCR扩增产物； 图2为重组表达载体pAM)leosin17.8的构建流程图3为花生油体蛋白屈o/ms/"/7.S基因启动子驱动的( OS报告基因在转 基因拟南芥中的组织特异性表达分析结果其中，l为花后5天种子，2为花后7天种子，3为成熟种子，4为萌发2 天幼苗，5为萌发6天幼苗，6为萌发8天幼苗，7为萌发12天幼苗，8为萌 发18天幼苗，9为成熟叶片，IO为带茎花序和幼嫩角果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，但具体实施例并不对本发 明做任何限定。
实施例l花生基因组DNA的提取 本实施例提取花生基因组DNA，其具体步骤如下
(1) 取5克花生叶于液氮中研磨成粉后转移到30ml离心管中，加入15ml 提取缓冲液[lOOmMTris (pH8.0)， 50mMEDTA (pH8.0)， 500mMNaCl， lOmMp-巯基乙醇]，混匀；
(2) 向上述离心管中加入1 ml 20%的SDS，充分混匀，于65°〇温育10 分钟，然后加入5ml5M的乙酸钾，充分混匀后置于冰上20分钟，25000 x g 离心20分钟；
(3) 离心后取上清至另一干净离心管中，加入IO ml的异丙醇，混匀后于-20。C静置30分钟，20000 x g离心15分钟；
(4) 离心后去上清，DNA沉淀自然风干后溶于750 ^tl TE缓冲液[50 mM Tris (pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)]中得到DNA溶液；
(5) 将上述DNA溶液转移到Eppendorf管中，分别用酚氯仿异戊醇(25
:24 : 1，体积比)和氯仿异戊醇(24 : 1，体积比)各抽提一次；
(6) 将抽提后的上清DNA溶液转移到另一 Eppendorf管，再加入500 pl 异丙醇和75 pl的醋酸钠(pH 5.2)，混匀，于12000 x g离心5分钟，沉淀用 80%的乙醇洗涤，风干后溶于500plTE缓冲液[50mMTris(pH8.0)， 10mM EDTA(pH8.0)]中，即得到花生基因组DNA。
实施例2种子特异性启动子的克隆
本实施例根据已测定的^K /ms/"77.S基因(GenBank登录号EF695400) 序列，设计并合成特异引物Pl和P2扩增花生^^/eos/"/7.S基因的第524位 第1576位共1053bp长的启动子片段，同时扩增时在启动子序列的两端加入 SawH I和&c I位点，其具体步骤如下
1. 引物
特异引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO: l所示，长度为29bp; 特异引物P2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示，长度为26bp。
2. PCR扩增
PCR扩增反应体系，总体系为5(Hi1，其配合和组成可参考PCR提取试剂 盒中的配方5 pl 10xPCR反应缓冲液(10mM)， 1 pl dNTP (各2.5 mM)， 2.5 W特异引物P1 (10mM)， 2.5nl特异P2 (10mM)， 1 pl Ex-Taq DNA聚合酶 (5U/pl)， l[ilDNA模板，37^1去离子水。PCR反应参数为(1)94°C 5min;(2)94。C 30s， 50°C lmin ， 72°C 2min， 30个循环；(3) 72。C10min。
PCR结果如图1所示，扩增得到1053bp的单一条带，山此证明本实施例 克隆得到屈o/^w/"77.S基因上游1053bp启动子片段。
实施例3重组表达载体及重组微生物的制备
报告基因是判断目的基因是否已经成功的导入到受体细胞并且表达的一 类标记基因。转基因植物常用的报告基因主要有P-葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因 (gw)、胭脂碱合成酶基因("os)、章鱼碱合成酶基因(ow)、或绿色荧光蛋 白基因(gfp)等。
本实施例使用应用较为广泛的Gt/S基因作为报告基因，GUS基因编码p-葡萄糖醛酸乙酰转移酶，该酶与X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸)底物 发生作用，产生蓝色沉淀反应，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到 植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。检测容易、迅速并能当量，只需少量的植物 组织即可在短时间内测定完成。
本实施例选择植物双元表达载体pBI101.1 (市售)，将实施例2的PCR 扩增产物(1053bp长的花生油体蛋白屈o/ms/"/7.S基因启动子)用5awH I 和&cl双酶切；对载体pBI101.1进行5awHI和SacI双酶切后，用T4连接 酶将两个双酶切产物连接起来，构建得到重组表达载体，并命名为 pAh01eosin17.8，其构建过程如图2所示。
用pAh01eosinl7.8转化大肠杆菌五.co/z'DH5a (市售)，筛选出阳性克隆； 然后提取质粒转化根癌农杆菌A fwm^^/^wEHA105 (市售)，制备得到含有 本发明启动子的重组微生物。本实施例中所涉及的双酶切反应，T4连接酶连接反应，质粒提取和质粒 转化等操作均釆用本领域的常规操作。
实施例4根癌农杆菌介导的拟南芥转化
由于根癌农杆菌介导转化法操作简便、成本低、转化率高、转化植物稳定， 是目前应用最广泛的转基因方法。
本实施例采用实施例3制备的重组微生物转化拟南芥，其具体操作步骤如
下
(O将实施例3得到的含有本发明启动子的根癌农杆菌单菌落接种于5 ml YEB液体培养基(卡那霉素50 (ig/ml，利福平25 pg/ml )， 28。C下180 rpm 振荡培养过夜；
(2) 将上述培养得到的菌液倒入500 ml YEB液体培养基(卡那霉素50 |ag/ml，利福平25iig/ml )， 28°。下180 rpm振荡培养过夜，测定OD值为l.O 左右；
(3) 将上述菌液分装到100ml离心管中，5000rpm离心20min，收集菌体；
(4) 用蔗糖转化液(50g/l蔗糖，200ul/l表面活性剂Silwet L-77)悬浮菌 体，花浸泡法转化野生型拟南芥，每组植物浸泡约lmin;
(5) 用塑料膜覆盖转化后的植物24h保持湿润，转化后的植物在土壤中继 续生长，待成熟后收集种子，种子在筛选培养基上萌发筛选(筛选培养基为含 有50 )Lig/ml卡那霉素和150jig/ml羧苄青霉素的MS平板)，10天后可得到绿 色Tt代植株转入土壤中培养，从1代植物可得到种子并用上述相同筛选培养
基筛选得到T2代转基因植株。实施例5组织化学染色分析
本实施例对实施例4所得到的转基因植株T,代与T2代进行组织化学染色 分析，其具体步骤如下-
取新鲜样品置于X-gluc染色液
中，抽真空15min后37。C保温过夜，用70%乙醇脱色，直到除去叶 绿素，脱色后的样品在光学显微镜下观察拍照或置于70%乙醇中保存。
拟南芥转基因植株T,与T2代不同发育阶段不同部位的染色结果如图3所 示l为花后5天未成熟种子，报告基因尚未表达；2为花后7天种子，可见 GUS开始表达和积累；3为成熟种子，可见GUS表达和积累；4为萌发2天 幼苗，5为萌发6天幼苗，6为萌发8天幼苗，在萌发早期幼苗组织中可见GUS 的积累，随萌发天数增加逐渐减弱；7为萌发12天幼苗，8为萌发18天幼苗， 真叶组织和新生根组织已检测不到报告基因的表达；9为成熟叶片，IO为带茎 花序和幼嫩角果，在成熟组织中GUS不表达。由此可以看出Gt/S报告基因 特异性地在成熟种子和萌发初期幼苗组织中表达，在种子发育初期未见明显的 外源基因表达，在成熟的根、茎、叶、花和角果外壳中也未见外源基因的表达。
本实施例的结果可以说明本发明的花生油体蛋白屈o/e^W7.S基因启动 子(1053bp)能诱导外源基因特异地在种子和萌发幼苗组织中表达。SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120>花生油体蛋CJAholeosin17. 8基因启动子在驱动外源基闲在转基因植物种了-屮特异表达上的应川
〈130〉 <腾 2
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> , <213>人工序列
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〈210〉 2
<211> 26
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<400> 2
tcccccgggt ccct,tttctt ccttat 2权利要求
1、花生油体蛋白Aholeosin17.8基因启动子在驱动外源基因在转基因植物种子中特异表达上的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述应用为用权利要求1所 述花生油体蛋白Jto/ wz>777.S基因启动子、外源基因和植物双元表达载体构 建重组表达载体表达外源基因。
3、 根据权利要求2所述应用，其特征在于所述植物双元表达载体为pBI101 载体、pBI121载体或pCAMBIA载体。
4、 根据权利要求2所述应用，其特征在于所述应用为用权利要求2所述 重组表达载体转化埃希氏大肠杆菌或土壤根癌农杆菌制备重组微生物。
5、 根据权利要求l所述应用，其特征在于所述应用是用权利要求1所述 花生油体蛋白^^/②wV777.S基因启动子转化植物细胞制备转基因细胞系。
6、 根据权利要求l所述应用，其特征在于所述应用是用权利要求1所述 花生油体蛋白^^/eo^"/7.S基因启动子转化植物制备转基因植物体。
全文摘要
本发明公开一种花生油体蛋白Aholeosin17.8基因启动子在驱动外源基因在转基因植物种子中特异表达上的应用，该启动子为花生油体蛋白基因Aholeosin17.8上游第524位～第1576位长1053bp的序列。本发明的启动子可与外源基因连接插入表达载体中构建重组表达载体，转化宿主细胞或宿主组织及其后代，实现植物的品质改良或生产外源蛋白。本发明的启动子诱导外源基因在种子中特异表达，且表达产物被贮存在成熟种子中，有利于表达产物的高水平累积，且可在常规条件下长期保存，也有利于表达产物的纯化回收。
文档编号C12N15/82GK101586117SQ20091003806
公开日2009年11月25日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者傅国花, 李陈龙, 林晓东, 黄上志, 茵 黎 申请人:中山大学