补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用，本发明的补骨脂种子特异性启动子具有种子特异性，在种子中大量表达，而在烟草的其他组织器官基本不表达，因此利用该启动子驱动外源基因的表达，一方面可以改良作物的种子组分，提高产量，同时也可以通过驱动抗病害基因，提高作物的抗病害能力、此外，由于在转基因烟草的花药中没有检测到GUS活性，因此利用该启动子还保证了转基因的安全性。
【专利说明】补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过以分子生物学、基因组学以及功能基因组学为手段克隆补骨脂种子特异性表达启动子的方法，属于植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】 [0002]首先，种子中含有丰富的碳水化合物，特别是淀粉、蛋白质及脂肪，为作物的生长提供必不可少的营养成分，同时，我们主要的粮食作物和油料作物如小麦、玉米、油菜等的主要食用部位均为种子，因此，对种子的改造是植物基因工程改良的重要目标。种子特异性启动子能够调控外源基因在种子中专一性表达，可按照人们的意愿改进并提高种子中的物质含量，满足日常需要。其次，种子作为植物的繁殖器官，通常成为动物、昆虫和微生物最爱的食物，于是在植物萌发过程中，由于此时物理屏障无法发生作用，对病原微生物等的抑制作用则要依赖种子中抗菌化合物的抗性。因此，通过种子特异性启动子启动外源抗病基因在种子中的特异性表达，既可以抵御昆虫、病原微生物的入侵，提高植物的抗病虫害能力，同时也能保证基因安全。
[0003]目前研究的种子特异性启动子种类繁多，包括种皮特异性启动子、胚乳特异性启动子等，为获得外源基因在种子中特异表达的转基因植物奠定了基础。Baumlein等将USP基因上游637bp片段与GUS基因连接后导入拟南芥，发现在转基因拟南芥中GUS基因在胚特异性表达。Russell连接水稻GluB-1基因启动子和⑶S基因后转入玉米中发现，GluB-1基因启动子能够驱动⑶S基因在胚乳外层特异性表达。Qu等将水稻SBEl基因启动子与⑶S报告基因融合导入水稻后发现SBEl启动子可以控制外源基因在水稻种子盾片中特异性表达。研究种子特异性启动子，发挥其在植物基因工程中的作用，并通过与传统育种技术的结合，对选育高产优质的作物新品种具有重要的意义。
[0004]基于以上背景如何确定补骨脂种子特异性启动子，为利用种子特异性启动子进行作物的改良育种奠定技术基础是本领域亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用，通过基因工程的手段，利用种子特异性启动子来安全有效地提高作物产量以及作物抗病害能力。
[0006]本发明的补骨脂种子特异性启动子，其至少包含SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列。
[0007]在本发明的另一方面，还涉及含有上述补骨脂种子特异性启动子的基因或者是载体。
[0008]在本发明的另一方面，本发明还涉及上述补骨脂种子特异性启动子在制备转基因种子中的应用，优选的，在制备烟草种子中的应用。
[0009]克隆补骨脂种子特异性启动子的方法一染色体步移技术，以及基因特异性表达的鉴定
[0010]具体而言，根据抗菌蛋白Psc-AFP的基因编码序列设计引物，应用染色体步移技术，克隆得到上游未知启动子序列，利用生物信息学的方法(数据库分析:PLACE / PlantCARE)初步分析其可能具有种子特异性启动活性，并构建种子特异性启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体，经农杆菌介导，转入美国烟草，对转基因烟草进行GUS组织化学染色，确证了该启动子的种子特异性。其特征在于:
[0011]1、根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP编码序列的分析，设计TAIL-PCR特异性引物以及简并引物；
[0012]2、设计确定hiTAIL-PCR的反应程序，获得补骨脂种子特异性启动子pPscAFP序列，如SEQID N0.1所示；
[0013]3、生物信息学的方法(数据库分析:PLACE / Plant CARE)分析其可能具有种子特异性启动活性，如SEQID N0.1所示；[0014]4、构建植物表达载体 pBI121_pPscAFP: KUS ;所述的 pBI121_pPscAFP: KUS 是指以pPscAFP为启动子，GUS为报告基因，Nos为终止子，Kan筛选转基因阳性植株的植物表达载体；
[0015]5、通过农杆菌介导法，获得转基因烟草阳性植株，通过⑶S组织化学染色，证实了补骨脂pPscAFP启动子的种子特异性启动活性。
[0016]为了能更清楚地研究Psc-AFP蛋白抗真菌的作用机理，本研究通过染色体步移技术hiTAIL-PCR克隆了序列未知的补骨脂Psc-AFP基因5’上游的启动子区，并将所克隆的启动子序列与⑶S报告基因融合构建植物表达载体pBI121-pPsCAFP::⑶S，利用农杆菌介导的遗传转化体系转化美国烟草。对转基因烟草的根、茎、叶、花、种子分别进行GUS染色，表明pPscAFP启动子在烟草的种子中大量表达，在花瓣中微量表达，而在根、茎、叶、花药等组织器官中没有检测到⑶S活性。因此，该启动子是一个重要的种子特异性启动子，可以做为一种安全、高效的种子特异性启动子应用于基因工程育种领域。
[0017]根据上述方法，已经成功获得转pBI121-pPsCAFP::GUS载体的转基因烟草，通过对各组织器官的GUS活性检测对比发现，该启动子的启动活性在种子中达到最大，在花瓣中只有微量表达，而在根、茎、叶、花药等组织器官基本不表达，证实了 PPscAFP启动子的种子特异性，为植物基因工程育种提供了一种安全、有效的方法。
[0018]本发明的补骨脂种子特异性启动子pPscAFP在转基因植物上的应用:所述转基因植物的制备方法主要包含以下步骤:
[0019]1、将应用hiTAIL-PCR技术获得的pPscAFP启动子序列插入pBI121表达载体中，构建携带有该种子特异性启动子的植物表达载体pBI121-pPsCAFP::⑶S ；
[0020]2、将构建的植物表达载体pBI121-pPscAFP::⑶S转入农杆菌EHA105，获得阳性转化体；
[0021]3、将所述阳性转化体转化美国烟草，获得转基因植株；
[0022]本发明克隆得到的特异性启动子序列是全新的，从未报道过，通过PLACE和PlantCARE分析，该启动子在翻译起始密码子上游存在着多个可能的TATA_box和CAAT-box,同时发现许多重要的顺式作用元件,如光反应元件Box 1、乙烯反应元件ERE、赤霉素反应元件GARE-motif以及种子特异性调控元件RY_element等,如图1及表3所示。
[0023]本发明获得的启动子pPscAFP是克隆得到的全新的、具有较强种子特异性的启动子，有着以下优点:CaMV35S启动子是分子育种中较为广泛使用的组成型启动子，但由于其启动活性不具组织特异性，在各组织器官发育的不同阶段均有表达，随着基因工程安全性受到越来越多的关注，这种组成型强表达启动子已经不能满足转基因发展的需要，并且CaMV35S容易发生基因沉默；本发明克隆得到的启动子pPscAFP具有种子特异性，在种子中大量表达，而在烟草的其他组织器官基本不表达，因此利用该启动子驱动外源基因的表达，一方面可以改良作物的种子组分，提高产量，同时也可以通过驱动抗病害基因，提高作物的抗病害能力、此外，由于在转基因烟草的花药中没有检测到GUS活性，因此利用该启动子还保证了转基因的安全性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1第一次hiTAIL-PCR扩增电泳图
[0025]图2第二次hiTAIL-PCR扩增电泳图
[0026]图 3 为植物表达载体 pBI 121-promoter (pBI121_pPscAFP::⑶S)
[0027]图4为农杆菌阳性转化子的GUS染色，初步表明克隆得到的5’上游序列具有启动子活性:A:pBI121-pPscAFP: KUS的⑶S检测(蓝色)B:空载pBI121_GUS检测(淡蓝色)C:农杆菌EHA105-GUS检测(无色)；
[0028]图5转基 因烟草(从叶盘到生根和成苗的过程)
[0029]图6为转pBI121_pPscAFP: KUS基因烟草的PCR检测；
[0030]图7为转pBI121-pPscAFP::⑶S基因烟草各组织器官的⑶S染色:其中A.根，B.茎，C.叶，D.花，E.雄蕊和雌蕊，F.种子；
【具体实施方式】
[0031]【实施例1】补骨脂叶片总DNA的提取
[0032]利用CTAB法提取补骨脂基因组DNA:
[0033](I)将 4mL CTAB 抽提液(IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1.5M NaCl, 2% CTAB,4%PVP40)以及相应量的(6-巯基乙醇加入IOmL离心管于65°C下预热；
[0034](2)取Ig补骨脂幼叶放入陶瓷研钵中，进行液氮研磨，将研磨好的幼叶加入预热的溶液中，再于65°C中水浴45min，期间颠倒混匀3次；
[0035](3)取出离心管，加入4mL氯仿:异戊醇(24:1)，轻柔颠倒混匀，乳化IOmin ；
[0036](4) 1000Orpm下离心IOmin,取上清液3mL加入等体积_20°C预冷的异丙醇,颠倒混匀，放置15min ；
[0037](5)用移液枪枪头吸取沉淀放入有lmL75%乙醇的EP管中漂洗沉淀；
[0038](6)吸干乙醇再用lmL75%乙醇漂洗一次，最后用无水乙醇再漂洗一次；
[0039](7)室温下干燥，用500 u L TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)溶解沉淀，电泳检测后置于-20°C保存。
[0040]【实施例2】根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP基因编码序列，设计hiTAIL-PCR特异性引物与简并引物，相继进行第一次、第二次h i TA IL-PCR扩增
[0041]根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP基因编码序列SEQ ID4，按照hiTAIL-PCR法实验原理，设计特异性引物和简并引物(如表1)，分两次扩增Psc-AFP基因上游启动子序列，PCR反应程序如表2所示。[0042]表1hiTAIL-PCR 的引物对
[0043]
【权利要求】
1.补骨脂种子特异性启动子，其至少包含SEQID N0.3所示的核苷酸序列。
2.含有上述补骨脂种子特异性启动子的基因或者是载体。
3.上述补骨脂种子特异性启动子或者含有上述补骨脂种子特异性启动子的基因或者是载体在制备转基因种子中的应用，优选的，在制备植物种子中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK103602683SQ201310572147
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】杨星勇, 康丹, 方小艳, 谢成建 申请人:重庆师范大学