Il-2和mart-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因；所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接IL-2基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原和人白细胞介素-2，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。
【专利说明】IL-2和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
【技术领域】 [0001]本发明涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]黑色素瘤(Melanoma),又称恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma,MM),是来源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发生于皮肤体表，亦可见于脉络膜、软脑膜及消化道等，其恶性程度高，是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。近年来,黑色素瘤的发病率及相应的死亡率在迅速增长，且发病年龄愈来愈早，严重威胁着人类的健康。
[0003]黑色素瘤的传统治疗,是包括手术、化疗、免疫治疗等在内的综合治疗。目前唯一有效的治疗方法是在肿瘤厚度小于I毫米时通过手术切除肿瘤，但由于黑色素瘤的高度侵袭转移性和对多种化疗药物的耐药性，导致其疗效不佳以及预后不良。针对肿瘤患者普遍存在免疫力低下的情况,通过免疫治疗来诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应，以抑制肿瘤的生长、转移及复发。近年来，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。其中，基因疫苗是通过特定载体将具有治疗作用的基因导入细胞的治疗方法；然而，基因治疗只能短时间提高某种基因对应蛋白表达水平，其疗效持续时间短，缺乏长期抗肿瘤能力。
[0004]肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，因而不能被T细胞识别，无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，不仅需要肿瘤相关抗原的表达和呈递，还需要增强共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。
[0005]人白细胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2),又名T细胞生长因子(T Cell GrowthFactor，TCRF)。IL-2是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下，由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的在机体免疫反应中具有重要调节作用的一种细胞因子。IL-2是机体免疫调节网络中的核心物质，与其他细胞因子有协同和拮抗作用，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用；其能够刺激NK、CTL、LAK细胞的活化和增殖，也能促使T淋巴细胞、NK细胞产生干扰素、肿瘤坏死因子等，因而能够广泛应用于抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等疾病的治疗。在恶性肿瘤的发病机制中，由于免疫功能低下，肿瘤病人体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞功能低下，不能正常地清除肿瘤细胞，而这些杀伤细胞的活化和增殖均是以IL-2为基础的，此时必须提供外源IL-2，帮助病人完成免疫监视功能，这就是IL-2治疗肿瘤的免疫学基础。IL-2单独使用或者与淋巴因子激活的杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞一起用于转移性黑色素瘤的治疗，取得了不错的临床效果。然而，目前的IL-2基因免疫治疗方法只是局部地提高机体的IL-2蛋白表达水平，其免疫调节作用、抗肿瘤能力较小，而且缺乏免疫治疗的靶向性。
[0006]MART-1 (人黑色素瘤分化抗原)是黑素瘤分化的相关抗原，其参与黑素小体成熟，表达于黑素瘤和黑素瘤细胞系，在多数类固醇肿瘤(包括肾上腺皮质肿瘤)、黑色素细胞病变以及血管周细胞瘤中表达。MART-1有较强的免疫原性，易于被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，产生有效的抗肿瘤免疫应答，被认为是黑素瘤免疫治疗的最佳候选者。
【发明内容】
[0007]基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。
[0008]本发明的另一个目的是，提供所述IL-2和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法。
[0009]本发明的再一个目的是，提供所述IL-2和MART-1双基因共表达重组载体在黑色素瘤免疫治疗中的应用。
[0010]IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有IL_2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因；所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
[0011]在其中一个实施例中，所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为PIRES2-1L-2-MART-1重组载体；其中，IL-2基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
`[0012]在其中一个实施例中，所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为PIRES2-MART-1-1L-2重组载体；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
[0013]本发明所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤:
[0014]I)获得含有特异性酶切位点的IL-2基因片段或MART-1基因片段；
[0015]2)将步骤I)得到的IL-2基因片段或MART-1基因片段连接于载体，构建含有IL-2基因或MART-1基因的重组载体；
[0016]3)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或IL-2基因片段；
[0017]4)将步骤3)得到的MART-1基因片段或IL_2基因片段连接于步骤2)得到的重组载体，构建所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体。
[0018]在其中一个实施例中，所述的pIRES2-1L-2-MART-l重组载体的制备方法，包括以下步骤:
[0019]A)获得含有特异性酶切位点的IL-2基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的IL-2特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位点的IL-2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0020]B)构建pIRES2-1L-2-EGFP重组载体:用限制性内切酶EcoR 1、BamH I分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤A)得到的IL-2基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-1L-2-EGFP重组载体；
[0021]C)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0022]D)构建pIRES2-1L-2-MART-l重组载体:用限制性内切酶BstX 1、Not I酶切步骤B)得到的pIRES2-1L-2-EGFP重组载体，将步骤C)得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-1L-2-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-1L-2-MART-1 重组载体。
[0023]在其中一个实施例中，步骤A)所述的IL-2特异性引物为:
[0024]IL-2 上游引物:5’ -CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3’，
[0025]IL-2 下游引物:5 ’ -CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3 ’。
[0026]在其中一个实施例中，步骤C)所述的MART-1特异性引物包括MART-1第一引物对和MART-1第二引物对，所述的MART-1第一引物对由MART-1上游长引物和MART-1下游长引物组成，所述的MART-1第二引物对由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物组成:
[0027]MART-1第一引物对为:
[0028]MART-1 上游长引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’，
[0029]MART-1 下游长引物:5’-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ；
[0030]MART-1第二引物对为:
[0031]MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’，
[0032]MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
[0033]在其中一个实施例中，所述的pIRES2-MART-l-1L-2重组载体的制备方法，包括以下步骤:
[0034]a)获得含有特异性酶切位点的MART-1基因片段:从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位点序列的MART-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位点的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0035]b)构建pIRES2-MART-l-EGFP重组载体:用限制性内切酶Xho 1、EcoR II分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-MART-1-EGFP重组载体；
[0036]c)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL-2基因片段混合物，其中的一种IL-2基因片段具有BstXI和Not I酶切粘性末端；
[0037]d)构建pIRES2-MART-l-1L-2重组载体:用限制性内切酶BstX 1、Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重组载体，将步骤c)得到的IL-2基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-MART-1-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-MART-1-1L-2 重组载体。
[0038]在其中一个实施例中，步骤a)所述的MART-1特异性引物为:
[0039]MART-1 上游引物:5，-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3，，
[0040]MART-1 下游引物:5，-CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3 ’。[0041]在其中一个实施例中，步骤c)所述的IL-2特异性引物包括IL-2第一引物对和IL-2第二引物对，所述的IL-2第一引物对由IL-2上游长引物和IL-2下游长引物组成，所述的IL-2第二引物对由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物组成:
[0042]IL-2第一引物对为:
[0043]IL-2 上游长弓丨物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0044]IL-2 下游长引物:5’-GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ；
[0045]IL-2第二引物对为:
[0046]IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0047]IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
[0048]本发明所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体在黑色素瘤基因免疫治疗中的应用。
[0049]在其中一个实施例中，将所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体转染黑色素瘤患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，进行黑色素瘤基因免疫治疗。
[0050]本发明所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接IL-2基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原(MART-1)以及人白细胞介素-2 (IL-2)，可减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源基因序列的引入。其中，MART-1是肿瘤靶向性的相关抗原，IL-2是发挥免疫调节作用的细胞因子，两者联合使用，既可以发挥细胞因子的 的免疫调节作用，又可以靶向性地产生特异性的抗肿瘤效应，从而能够获得更好的黑色素瘤免疫治疗效果。将双基因共表达重组载体转染黑色素瘤患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，MART-1的大量表达，可刺激树突状细胞递呈MART-1多肽与MHC复合物，进而刺激机体免疫系统，产生特异性杀伤性T细胞，靶向性杀伤表达MART-1多肽的肿瘤细胞；而IL-2的大量表达，能进一步增强机体免疫调节能力，并能增强特异性T淋巴细胞的扩增能力和细胞活力，增强活化的T细胞产生干扰素，协同扩大抗肿瘤免疫效应。
[0051]IRES序列是来源于某些病毒和细胞mRNA5’端的一段非翻译区，可以不依赖帽的方式启动远端的mRNA翻译，可在上游启动子的控制下和与之相连的基因共同转录，在同一转录本上翻译出不同的蛋白。IRES连接多基因进行共表达时，多个基因的mRNA在同一条转录子上，但转录后的翻译过程相互独立，上游基因以传统方式进行翻译，下游基因依靠IRES序列以不依赖帽的方式进行翻译，保证了各个基因的独立结构及功能。利用IRES代替内部启动子，不但可使多基因共表达载体大大缩小，而且还克服了传统多基因表达载体中启动子之间的相互抑制现象，避免融合蛋白的产生。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1为实施例一所得的含有特异性酶切位点序列的IL-2基因片段的电泳图，其中，I为IL-2基因，M为标记；
[0053]图2 为 pIRES2-EGFP 质粒图谱；
[0054]图3为实施例二所得的PIRES2-1L-2-EGFP重组载体图谱；
[0055]图4为实施例二所得的pIRES2-1L-2-EGFP重组载体的PCR鉴定电泳图，其中，I为PCR反应产物，M为标记；[0056]图5为实施例二所得的PIRES2-1L-2-EGFP重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，I为酶切反应产物，M为标记；
[0057]图6为实施例三所得的带有限制性内切酶粘性末端的MART-1基因片段的电泳图，其中，I为PCR扩增产物A，2为PCR扩增产物B，M为标记；
[0058]图7为实施例三所述的杂交PCR反应的流程图；
[0059]图8为实施例四所得的PIRES2-1L-2-MART-1重组载体图谱；
[0060]图9为实施例四所得的PIRES2-1L-2-MART-1重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，
I为EcoR I/BamH I双酶切反应产物，2为BamH I/Not I双酶切反应产物，3为EcoR I/NotI双酶切反应产物，M为标记。
[0061]图10为实施例五所得的含有特异性酶切位点序列的MART-1基因片段的电泳图，其中，I为MART-1基因，M为标记；
[0062]图11为实施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重组载体图谱；
[0063]图12为实施例六所得的PIRES2-MART-1-EGFP重组载体的PCR鉴定电泳图，其中，I为PCR反应产物，M为标记；
[0064]图13为实施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，I为酶切反应产物，M为标记；
[0065]图14为实施例七所得的`带有限制性内切酶粘性末端的IL-2基因片段的电泳图，其中，I为PCR扩增产物C，2为PCR扩增产物D，M为标记；
[0066]图15为实施例七所述的杂交PCR反应的流程图；
[0067]图16为实施例八所得的PIRES2-MART-1-1L-2重组载体图谱；
[0068]图17为实施例八所得的PIRES2-MART-1-1L-2重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，
I为Xho I/EcoR I双酶切反应产物，2为EcoR I/Not I双酶切反应产物，3为Xho I/Not I双酶切反应产物，M为标记。
【具体实施方式】
[0069]下述实施例中，所用到的实验技术，例如PCR技术、引物设计技术、载体构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中的常规技术，本领域技术人员可根据现有技术实现(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，科学出版社第三版；或者按照产品说明书进行)。在操作过程中所用到的设备、试剂、载体、菌株等，均为通过市场购买得到的常规产品。
[0070]实施例一:获取含有特异性酶切位点的IL-2基因片段
[0071]1、引物设计
[0072]根据IL-2基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计特异性引物如下:
[0073]IL-2上游引物(如序列表中SEQ ID NO: 4所示):
[0074]5，-CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3，(下划线部分为 EcoR I 酶切位点序列)，IL-2下游引物(如序列表中SEQ ID N0:5所示):
[0075]5，-CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3，(下划线部分为 BamH I 酶切位点序列)。[0076]2、获取cDNA模板
[0077]TRIzon法从CIK细胞(Cytokine-1nduced Killer,细胞因子诱导的杀伤细胞)或者人外周血分离的单个核细胞中，提取RNA (TRIzon总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0580)，并反转录成cDNA (反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为RR019A)。
[0078]3、获取含有特异性酶切位点的IL-2基因片段
[0079]以所得到的cDNA为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，通过PCR反应获得IL-2基因片段，其上游含有EcoR I酶切位点序列，下游含有BamH I酶切位点序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图1所示。
[0080]PCR反应体系如下(50 μ L):
[0081]
【权利要求】
1.1L-2和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和IL-2基因; 所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根据权利要求1所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于:所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-1L-2-MART_l重组载体；其中，IL-2基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
3.根据权利要求1所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于:所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-MART-l-1L_2重组载体；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
4.权利要求1所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤: O获得含有特异性酶切位点的IL-2基因片段或MART-1基因片段； 2)将步骤I)得到的IL-2基因片段或MART-1基因片段连接于载体，构建含有IL-2基因或MART-1基因的重组载体； 3)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或IL-2基因片段； 4)将步骤3)得到的MART-1`基因片段或IL-2基因片段连接于步骤2)得到的重组载体，构建所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体。
5.权利要求2所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤: A)获得含有特异性酶切位点的IL-2基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的IL-2特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位点的IL-2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； B)构建pIRES2-1L-2-EGFP重组载体:用限制性内切酶EcoR1、BamH I分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤A)得到的IL-2基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-1L-2-EGFP重组载体； C)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； D)构建pIRES2-1L-2-MART-l重组载体:用限制性内切酶BstX1、Not I酶切步骤B)得到的pIRES2-1L-2-EGFP重组载体，将步骤C)得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-1L-2-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-1L-2-MART-1 重组载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述的IL-2特异性引物为: IL-2 上游引物:5’ -CCGGAATTCATGTACAGGATGCAACTCC-3’， IL-2 下游引物:5’ -CGCGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤C)所述的MART-1特异性引物包括MART-1第一引物对和MART-1第二引物对，所述的MART-1第一引物对由MART-1上游长弓丨物和MART-1下游长弓丨物组成，所述的MART-1第二引物对由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物组成: MART-1第一引物对为: MART-1 上游长引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’， MART-1 下游长引物:5’ -GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ； MART-1第二引物对为: MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’， MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
8.权利要求3所述的IL-2和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤: a)获得含有特异性酶切位点的MART-1基因片段:从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位点序列的MART-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位点的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； b)构建pIRES2-MART-l-EGFP重组载体:用限制性内切酶Xho1、EcoR II分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-MART-1-EGFP重组载体； c)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL-2基因片段混合物，其中的一种IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)构建pIRES2-MART-l-1L-2重组载体:用限制性内切酶BstX1、Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重组载体，将步骤c)得到的IL-2基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-MART-1-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-MART-1-1L-2 重组载体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述的MART-1特异性引物为: MART-1 上游引物:5’ -AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’， MART-1 下游引物:5’ -CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤C)所述的IL-2特异性引物包括IL-2第一引物对和IL-2第二引物对，所述的IL-2第一引物对由IL-2上游长引物和IL-2下游长引物组成，所述的IL-2第二引物对由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物组成: IL-2第一引物对为: IL-2 上游长引物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’， IL-2 下游长引物:5’ -GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ； IL-2第二引物对为: IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
【文档编号】C12N15/66GK103555763SQ201310571900
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】栗炳南, 丰慧根, 左百乐, 林俊堂, 曹毓林 申请人:新乡医学院