Cyp3a基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒的制作方法

专利名称：Cyp3a基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒。
背景技术：
CYP(细胞色素P450)为与类固醇激素等的生物物质的代谢、药物以及环境污染物质等的氧化解毒反应相关的氧化酶。CYP形成含有多种分子种的超家族，其中，已知CYP3A4和CYP3A5存在例如影响医药的代谢的多态性(Human Mutation，2004年，Vol. 23，Issue 1，ρ·100-108)。编码CYP3A5的CYP3A5基因位于人的第7染色体。并且，例如已知CYP3A5基因的部分序列(序列号I)中的第401位的碱基(r)存在从腺嘌呤(a)向鸟嘌呤(g)的突变(CYP3A5*3)等(Clin. Pharmacol. Ther.，2006 年，Vol. 80，p. 179-191 等)。由于该碱基的突变而产生剪接异常，CYP3A5的表达大幅降低。另外，编码CYP3A4的CYP3A4基因位于人的第7染色体。并且例如已知CYP3A4基因的部分序列(序列号2)中的第201位的碱基(s)存在从胞嘧啶(c)向鸟嘌呤(g)的突变(CYP3A4*16)等(Clin. Pharmacol. Ther.，2006 年，Vol. 80，ρ· 179-191 等)。由该碱基的突变，CYP3A4的第185位的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)。例如报告了这些突变与免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)等药物代谢的关联(Clin. Pharmacol. Ther.，2006 年，Vol. 80，ρ· 179-191)。因此，通过检测 CYP3A 基因中的这些多态性，例如有可能能够以更高的灵敏度预测耐药性。现在，作为检测基因的多态性的方法，例如，已知有PCR(聚合酶链式反应)-RFLP(限制性片段长度多态性)法等(Genet. Mol. Res.，2010年，第9卷，第I号，P. 34-40)。该方法使用设计为扩增含有检测目标碱基的部分的引物进行PCR，使用因所述特定碱基中的突变的有无而切断与否不同的限制性内切酶切断，之后通过电泳检测有没有被切断的方法。另外，还已知在用PCR法扩增含有突变的区域之后，使用荧光染料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变的方法(參见专利文献2 :日本特开2002-119291)。

发明内容
但是，CYP3A基因的突变中如前所述，存在各种突变。因此，PCR-RFLP法需要在PCR反应之后，提取扩增产物，进行限制性内切酶处理。因此，所述扩增产物有可能混入到之后的反应系统中，并由此有时会得到假阳性和假阴性的結果。另外，在PCR结束之后，用限制性内切酶进行处理，之后再进行电泳， 因此存在到检测为止需要的时间非常长的情況。另夕卜，由于操作复杂，难以自动化。根据这些现状，为了检测CYP3A基因的多态性，期待进ー步的技术开发。本发明的课题为提供一种能够以高灵敏度简便检测CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针，使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明的课题为提供使用了所述多态性检测方法的药效评价方法。而且，本发明的课题为提供使用了所述多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。本发明如下所述。<1> 一种多态性检测用探针，用于检测CYP3A基因的多态性，所述多态性检测用探针是从包括下述PI、ΡΓ、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’的组中选择的ー种荧光标记
寡核苷酸(Pl)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的喊基的喊基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外相对于具有与序列号I相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号I所示的序列中的第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；(Pr )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的喊基的、喊基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，与具有与序列号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号I所示的序列中第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；(P2)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201位 第205位的碱基的碱基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；(P2’ )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201位 第205位的喊基的喊基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；(P3)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；(P3’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；(P4)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；(P4’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；(P5)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；(P5’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号3相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号3所示的序列中第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。<2>根据〈1>所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸识别序列号I中的第401位的碱基的多态性。<3>根据〈1>或〈2>所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位具有用所述荧光染料标记的所述碱基。<4>根据〈1> 〈3>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用所述荧光染料标记的所述碱基。<5>根据〈1> 〈4>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少或增カロ。<6>根据〈1> く 5>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少。〈7>根据〈1> 〈6>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述Pl和ΡΓ荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 30碱基长，所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 30碱基长，所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为12 40碱基长，所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱基长为16 40碱基长，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 40碱基长。〈8>根据く 1> 〈7>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述Pl和ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 20碱基长，所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 20碱基长，所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 30碱基长，所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20 30碱基长，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20 30碱基长。<9>根据〈1> 〈8>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测、用探针是用于分析熔解曲线的探针。〈10>根据〈1> 〈9>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针具有序列号37、序列号38、序列号39、序列号41、序列号43或序列号45所示的碱基序列。<11>根据〈1> 〈9>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，具有序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号44或序列号12所示的碱基序列。〈12> —种多态性检测方法，通过使用〈1> 〈I 1>中任意一项所述的多态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性。<13>根据〈12>所述的多态性检测方法，包括
(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述多态性检测用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体；(II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，来使所述杂交体形成体解离，并测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动；(III)基于所述荧光信号的变动来測定Tm值，该Tm值是杂交体形成体的解离温度；以及(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的CYP3A基因中的多态性的存在。〈14>根据〈13>所述的多态性检测方法，其中，还包括在所述(I)之前或者与(I)同时扩增核酸。<15> ー种药剂的药效评价方法，包括利用〈12>所述的多态性检测方法来检测CYP3A基因的多态性；以及基于检测的多态性的有无来评价对药剂的耐性或者药剂的药效。<16> 一种多态性检测用试剂盒，用于检测CYP3A基因的多态性，所述多态性检测用试剂盒包括〈1> 〈11>中任意一项所述的多态性检测用探针。<17>根据〈16>所述的多态性检测用试剂盒，还包括用于扩增含有与所述多态性检测用探针杂交的序列的区域的引物。根据本发明，能够提供可高灵敏度且简便地检测CYP3A的多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明能够提供使用了该多态性检测方法的药效评价方法。而且，本发明能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。此夕卜，本发明例如不局限于医疗领域，能够应用于生物化学等广泛领域中的CYP3A基因的多态性检測。


图IA和IB是本发明的实施例I涉及的试样的熔解曲线；图2A和2B是本发明的实施例I涉及的试样的熔解曲线；图3A和3B是本发明的实施例I涉及的试样的熔解曲线；图4是本发明的实施例I涉及的试样的熔解曲线；图5A和5B是本发明的实施例I涉及的试样的熔解曲线；图6A和6B是本发明的实施例2涉及的试样的熔解曲线；
图7A和7B是本发明的实施例3涉及的试样的熔解曲线；图8A和8B是比较例I涉及的试样的熔解曲线；图9A和9B是比较例2涉及的试样的熔解曲线；图IOA IOC是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；图IlA和IlB是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；
图12A 12C是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；
图13A和13B是本发明的实施例5涉及的试样的熔解曲线；图14是比较例3-1涉及的试样的熔解曲线； 图15是比较例3-2涉及的试样的熔解曲线。
具体实施例方式本发明涉及的CYP3A基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称“多态性检测用探针”)为用于检测CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针，所述多态性检测用探针为从包括所述PI、Pl’、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸。本发明涉及的CYP3A基因多态性检测方法为包括使用至少ー种用于检测所述CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性的方法。本发明涉及的药剂的药效评价方法为包括通过所述CYP3A基因多态性检测方法检测CYP3A基因的多态性、以及基于检测的多态性的有无来评价对药剂的耐性或者药剂的药效的方法。本发明涉及的多态性检测用试剂盒含有用于检测CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针。本发明涉及的“CYP3A基因”已经是公知的。CYP3A5基因的碱基序列是指NCBI的登录号No. NC000007. 13的99245813 99277621的序列。表示CYP3A5基因的部分序列的序列号I为NCBI的dbSNP的登录号No. NG007938的6683 7483的序列。CYP3A4基因的碱基序列是指NCBI的登录号No. NC000007. 13的99354583 99381811的序列。表示CYP3A4基因的部分序列的序列号2为NCBI的dbSNP的登录号No. NG008421的15519 15928的序列，表示CYP3A4基因的部分序列的序列号3为NCBI的dbSNP的登录号No. NT007933. 14的24616172 24616872序列。序列号I 3的碱基序列中，r表不a或g, s表不c或g,w表不a、t或U，V表不g、a或C。CYP3A5基因的野生型中，与序列号I所示的序列中第401位对应的碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基(s)突变成G(鸟嘌呤)。以下，将序列号I的CYP3A5基因的所述多态性称为“CYP3A5*3多态性”。CYP3A4基因的野生型中，与序列号2所示的序列中第201位对应的碱基(s)为C(胞嘧啶)，突变型中，所述碱基(s)突变为G(鸟嘌呤)。以下，将序列号2的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*16多态性”。CYP3A4基因的野生型中，与序列号3所示的序列中的第501位对应的碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基(r)突变为G(鸟嘌呤)。以下，将序列号3的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*1B多态性”。在CYP3A基因中，若所述3处的多态性中至少ー处为前述那样的突变型，则可以判断为例如存在免疫抑制剂tacrolimus等的药物代谢降低的可能性。
本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，由该互补的序列识别的序列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。本发明中，“ Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链核酸DNA的溶液吋，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA (DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单链DNA吋，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约I. 5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。本说明书中“步骤” ー词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与其他的步骤明 确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则包含在本术语之内。另外，本说明书中，使用“ ”表示的数值范围为分别包含“ ”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，意思是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第I 3位”时为以寡核苷酸链的3’末端为第I位起数的。〈CYP3A基因多态性检测用探针>本发明涉及的CYP3A基因的多态性检测用探针为用于检测CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针，该多态性检测用探针为从包括所述P1、ΡΓ、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸。CYP3A5基因的野生型中，与序列号I所示的序列中的第401位对应的碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基ω突变成G(鸟嘌呤)。以下，将序列号I的CYP3A5基因的所述多态性称为“CYP3A5*3多态性”。以下也将检测该多态性的探针称为CYP3A5*3用探针。本发明中，从包括所述Pl和ΡΓ的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸(以下也称为“所述(PD或(ΡΓ )荧光标记寡核苷酸”。)为能够检测序列号I所示的碱基序列的第401位的碱基中的多态性的探针。本发明的所述Pl的荧光标记寡核苷酸具体而言为含有序列号I所示的序列中的第401位 第411位的碱基的序列。在所述Pl荧光标记寡核苷酸中，例如与序列号I所示的碱基序列的第401位的碱基对应的碱基(r)可以为A，也可以为G。(Pl)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的喊基的喊基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号I相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且与序列号I所示的序列中第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。本发明的所述Pl的荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为C (胞B密唳)之外,相对于具有与序列号I相同的碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸除了与序列号I中的第411位的碱基对应的喊基为C(胞卩密唳)之外，相对于具有与序列号I相同的喊基的喊基序列，显不出80%以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如，也可以显示出85%以上的同一性，90%以上的同一性，95%以上的同一性，96%以上的同一性，97%以上的同一性，98%以上的同一性或者99%以上的同一性。另外，所述Pl荧光标记寡核苷酸进一步优选如下其除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第401位的碱基对应的碱基为r(A或G)之外，相对于具有与序列号I相同的碱基的碱基序列具有同一性。这里，“具有与序列号相同的碱基的碱基序列”是指，改变了的所述探针中出现的所述序列号中的序列中的区域。本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸例如在与序列号I的第401位的碱基对应的碱基为突变型的G的情况下，例如可以说在本发明的所述Pl荧光标记寡核苷酸和除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列号I相同的碱基的碱基序列进行比较时其同一性低于80%的情况下，对于含有突变型的CYP3A5基因的试
样核酸的检测灵敏度变低。作为本发明涉及的所述Pl荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号I中的第401位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号I中的第401位的碱基的多态性的功能。因此所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号I的第401位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有针对含有突变型的CYP3A5基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明的所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，还与具有与序列号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。在所述Pr荧光标记寡核苷酸中，例如与序列号I所示的碱基序列的第401位的碱基对应的碱基(r)可以为A，也可以为G。(Pr )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的喊基的喊基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，与具有与序列号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号I所示的序列中第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。所述杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过參照并入本说明书。严谨条件是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mmol/L 约50mmol/L以及镁浓度约1.0mmol/L 约
5.Ommol/L中，进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mmol/L的KCl以及I. 5mmol/L的MgCl2下进行杂交的条件,但是不限于此。此外,严谨条件被id载在 Molecular Cloning 3rd U· Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)中。该文献通过參照并入本说明书。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，来容易地选择上述条件。作为本发明涉及的所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号I中的第401位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号I中的第401位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号I的第401位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A5基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述Pl或者所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸还包括在所述Pi或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述Pi或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或者取代的碱基的数量可以为ー个碱基或者两个碱基以上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基、或者I个碱基 5个碱基。其中，本发明中的所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸还包括取代了所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述Pl或所述ΡΓ的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵敏度的观点来说，可以是位于序列号I所示的序列中的第401 位 第411位的碱基之外的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基或者I个碱基 3个碱基。本发明的所述Pl或所述ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的长度需要是11 50碱基(mer) 0在所述Pl或所述P1’荧光标记寡核苷酸的长度为10个碱基以下或者51个碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另外，本发明的所述Pl或所述ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为15 30个碱基、15 21个碱基或者15 20个碱基。例如，通过使之为所述15 30个碱基的范围，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。另外，通过改变所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是由所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体形成体的解尚温度。下面示出本发明中的所述Pl荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但是本发明不限于此。51 -ttgtctttcartatctcttcc-31 (序列号 37)51 -ttgtctttcagtatctcttcc-31 (序列号 4) (3FL-CYP3A5*3-mt-Fl_21)51 -ttgtctttcaatatctcttcc-31 (序列号 5)在本发明的所述Pl或者所述ΡΓ的荧光标记寡核苷酸中，与序列号I的序列中第411位的碱基对应的碱基需要用荧光染料标记。在所述Pl或所述ΡΓ荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的第411位的碱基可以存在于从3’末端起数第I 3位的任何位置，另外，可以存在于3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进ー步提高，而且能够性良好地获得Pl或者所述Pl ’荧光标记寡核苷酸。在本发明中，从包括所述P2、所述P2’、所述P3、所述P3’、所述P4以及所述P4’的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸(以下，也称为“所述(P2)、(P2’)、(P3)、(P3’)、(P4)或(P4’ )荧光标记寡核苷酸”。)是能够检测序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基的多态性的探针。
CYP3A4基因的野生型中，与序列号2所示的序列中第201位对应的碱基(S)为C(胞嘧啶)，突变型中，所述碱基(s)突变为G(鸟嘌呤)。以下，将序列号2的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*16多态性”。下面也将检测该多态性的探针称为CYP3A4*16用探针。本发明的所述P2的荧光标记寡核苷酸具体是含有序列号2所示的序列中的第201位 第205位的碱基的序列。在所述P2荧光标记寡核苷酸中，例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基对应的碱基(s)可以为C，也可以为G。(P2)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中的第201位 第205位的喊基的喊基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为C(胞喃唳)之外，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有同一'注。具体而言，本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸除了与序列号2中的第205位的碱基对应的喊基为C (胞卩密唳)之外，相对于具有与序列号2相同的喊基的喊基序列显不出80%以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如，也可以显示出85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或者99%以上的同一性。另外，所述P2荧光标记寡核苷酸进一步优选如下除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基对应的碱基为s(C或G)之外,相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有同一'注。本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基对应的碱基为突变型的G的情况下，例如可以说在本发明的所述P2的荧光标记寡核苷酸和除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列号2相同的碱基的碱基序列进行比较时，其同一性低于80%的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变低。作为本发明涉及的所述P2的荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P2’的荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，与具有和序列号2相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。所述P2’的荧光标记寡核苷酸例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基对应的碱基(s)可以为C，也可以为G。所述杂交和严谨条件如前所述。(P2’ )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201位 第205位的喊基的喊基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的喊基对应的喊基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。 作为本发明涉及的所述P2’荧光标记寡核苷酸，例如，可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P2或者所述P2 ’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P2或所述P2 ’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或者取代的位置无特别限定。插入、缺失或者取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基、或者I个碱基 5个碱基。其中，本发明中的所述P2或者所述P2’荧光标记寡核苷酸还包括取代了所述P2 或所述P2’的荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如从检测灵敏度的观点来说，可以为位于序列号2所示的序列中的第201位 第205位的碱基之外的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基、或者I个碱基 3个碱基。本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度需要是5 50个碱基(mer)。在所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度为4个碱基以下或者51个碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另外，本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为10 30个碱基或者10 20个碱基。例如，通过使之为所述10 30碱基的范围，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。另外，通过改变所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体形成体的解离温度。下面示出本发明中的所述P2的荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但是本发明不限于此。5' -gatgtgatcastagc-3'(序列号38)5' -gatgtgatcagtagc-3'(序列号6) (3T-CYP3A4=IiI6-MFl)51 -gatgtgatcactagc-31 (序列号7)在本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列中的第205位的碱基对应的碱基需要用荧光染料标标记。在所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的第205位的碱基可以存在于从3’末端起数第I 3位的位置，另外，可以存在于3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进ー步提高，并且能够生产性良好地地获得P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸。在本发明中，所述P3和P3’的荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为G，也可以为C。本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号2所示的序列中第190位 第201位的碱基的序列互补的序列。所述P3荧光标记寡核苷酸例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可以为G。(P3)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第190位的碱基互补的喊基为C(胞喃唳)之外，具有相对具有序列号2的互补链相同的喊基的喊基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P3的荧光标记寡核苷酸除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列显示出80%以上的同一'注。另外，从检测灵敏度的观点来说,例如可以显示出85%以上的同一性，90%以上的同一性，95%以上的同一性，96%以上的同一性，97%以上的同一性，98%以上的同一'丨生或99%以上的同一'注。另外,所述P3突光标记寡核苷酸进一步优选的是，除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基 互补的碱基为s(C或G)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有同一,I"生。本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说在本发明的所述P3的荧光标记寡核苷酸和与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较时其同一性低于80%的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基 因的试样核酸的检测灵敏度变低。作为本发明涉及的所述P3荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P3’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交。所述P3’荧光标记寡核苷酸例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可以为G。所述杂交和严谨条件如前所述。(P3’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。作为本发明涉及的所述P3’荧光标记寡核苷酸，例如，可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。
本发明中的所述P3或所述P3，荧光标记寡核苷酸还包括在所述P3或所述P3，荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或者取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基、或者I个碱基 5个碱基。其中，本发明中的所述P3或所述P3’的荧光标记寡核苷酸还包括取代了所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵敏度观点来说，可以为 与位于序列号3所示的序列中第190位 第201位的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基或者I个碱基 3个碱基。本发明的所述P3或所述P3 ’荧光标记寡核苷酸的长度需要是12 50碱基(mer)。在所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的长度为11碱基以下或51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另外，本发明的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为12 40碱基或15 30碱基。例如，通过使之为所述12 40碱基的范围，例如有检测灵敏度变高等的倾向。另外通过改变所述P3或所述P3’的荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如，能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温度。下面示出本发明中的所述P3荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但是本发明不限于此。51 -tgtgctastgatcacatcc-31 (序列号 39)51 -tgtgctactgatcacatcc-31 (序列号 8) (3T_CYP3A4*16_MR1)51 -tgtgctagtgatcacatcc-31 (序列号4O)在本发明的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列中第190位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。在所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的与第190位的碱基互补的碱基可以存在于从3’末端起数第I 3位的任何位置，另外，可以存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进ー步提高，并且能够生产性良好地地获得P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸。在本发明中，所述P4和P4’的荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为G，也可以为C。本发明的所述P4的荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号2所示的序列中的第186位 第201位的碱基的序列互补的序列。在所述P4荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可以为G。(P4)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。本发明的所述P4荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第186位的碱基互补的喊基为C(胞喃唳)之外，相对具有序列号2的互补链相同的喊基的喊基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P4的荧光标记寡核苷酸除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列显示出80%以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如可以显示出85%以上的同一性，90%以上的同一性，95%以上的同一性，96%以上的同一性，97%以上的同一性，98% 以上的同一性或99%以上的同一性。另外，所述P4荧光标记寡核苷酸进一步优选如下，除了与序列号2中的第205位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基互补的碱基为s(C或G)之外,相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有同一性。本发明的所述P4荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说在将本发明的所述P4的荧光标记寡核苷酸和与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较时其同一性低于80%的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变低。作为本发明涉及的所述P4荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P4’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，还与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交。所述P4荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可以为G。所述杂交和严谨条件如前所述。(P4’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。作为本发明涉及的所述P4’荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或者取代了碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基、或者I个碱基 5个碱基。其中，本发明中的所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸还包括取代了所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如从检测灵敏度观点来说，可以为与位于序列号2所示的序列中第186位 第201位的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为I个碱基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基或者I个碱基 3个碱基。本发明的所述P4或所述P4’突光标记寡核苷酸的长度需要是16 50碱基(mer)。在所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸的长度为15碱基以下或者51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另外，本发明的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷 酸的长度例如可以为16 40碱基或20 30碱基。例如，通过使之为所述16 40碱基的范围，例如具有例如检测灵敏度变高等的倾向。另外通过改变所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温度。下面示出本发明中的所述P4荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但本发明不限于此。5' -atgatgtgctastgatcacatccatgc-3'(序列号 41)5' -atgatgtgctactgatcacatccatgc-3'(序列号 10) (U0_3TMR4)51 -atgatgtgctagtgatcacatccatgc-31 (序列号 4 51 -gatgtgctastgatcacatccatgc-31 (序列号 43)5' -gatgtgctactgatcacatccatgc-3'(序列号44)51 -gatgtgctagtgatcacatccatgc-31 (序列号 11)在本发明的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列中第186位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。在所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸中，该荧光标记的与第186位的碱基互补的碱基可以存在于从3’末端起数第I 3位的任何位置，另外，可以存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进ー步提高，并且能够生产性良好地地获得P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸。本发明中，从包括所述P5和P5’的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸(以下也称“所述(P5)或(P5’)荧光标记寡核苷酸”。)是能够检测序列号3所示的碱基序列的第501位的碱基中的多态性的探针。(P5)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。(P5’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号3相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号3所示的序列中第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。CYP3A4基因的野生型中，与序列号3所示的序列中第501位对应的碱基(r)为A (腺嘌呤)，而突变型中所述碱基(r)突变为G (鸟嘌呤)。以下，将序列号3的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*1B多态性”。以下也将检测该多态性的探针称为CYP3A4*1B用探针。在本发明中，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸中例如与序列号3所示的碱基序列的第501位的碱基互补的碱基(y)可以为C，也可以为T。
本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的序列互补的序列。在所述P5荧光标记寡核苷酸中，例如与序列号3所示的碱基序列的第501位的碱基互补的碱基(y)可以为C，也可以为T。本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，还相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列具有同一'注。具体而言，本发明的所述P5突光标记寡核苷酸除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列显示出80%以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如也可以显示出85%以上的同一性，90%以上的同一性，95%以上的同一性，96%以上的同一性，97%以上的同一性,98%以上的同一性或99%以上的同一性。另外,所述P5突光标记寡核苷酸进一步优选如下除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第501位的碱基互补的碱基为y(C或T)之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列具有同一'注。本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3的第501位的碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说是在将本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸和与序列号5中的第496位的碱基互补的碱基为C (胞嘧啶)之外具有与序列号5的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较时，在其同一性低于80%的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变低。作为本发明涉及的所述P5荧光标记寡核苷酸例如也可以是识别序列号3中的第501位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号3中的第501位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3的第501位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P5’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外与具有与序列号3相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交。所述P5’荧光标记寡核苷酸中例如与序列号3所示的碱基序列的第501位的碱基互补的碱基(y)可以为C，也可以为T。所述杂交和严谨条件如前所述。作为本发明涉及的所述P5’荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序列号3中的第501位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号3中的第501位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3的第501位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。本发明中的所述P5或所述P5’的荧光标记寡核苷酸还包括所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或者取代了碱基的数量可以为I个碱基或2个碱基以上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基，或者I个碱基 5个碱基。其中，本发明中的所述P5或所述P5 ’荧光标记寡核苷酸还包含取代了所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取代了碱基的荧光标记寡核苷 酸只要显示出与所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵敏度的观点来说，可以为与位于序列号3所示的序列中的第496位 第501位的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为I个碱基或2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基，或者I个碱基 3个碱基。本发明的所述P5或所述P5’突光标记寡核苷酸的长度需要是6 50碱基(mer)。在所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的长度为5碱基以下或者51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另外，本发明的所述P5或者所述P5’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为10 40碱基或20 30碱基。例如，通过使之为所述10 40碱基的范围，例如具有检测灵敏度提高等的倾向。另外，通过改变所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温度。下面示出本发明中的所述P5荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但是本发明不限于此。51 -taaatcgccgctctcxtgccc-31 (序列号 45)51 -taaatcgccgctctcctgccc-31 (序列号 12) (3PB_CYP3A4*1B_R3)51 -taaatcgccgctctcttgccc-31 (序列号 13)本发明的所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸中与序列号3的序列中的第496位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。在所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的与第496位的碱基互补的碱基可以位于从3’末端起数第I 3位的任何位置，另外，可以存在于3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进ー步提高，并且能够生产性良好地获得P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸。关于所述Ρ1、ΡΓ、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’荧光标记寡核苷酸的杂交体形成体的Tm值例如可以使用Meltcalc 99free (http://www. meltcalc. com/)来计算。设定条件无特别限制，例如可以为01igoconc[ μ M]0. 2、Na eq. [mM]50的条件。所述杂交体形成体例如可以是由与检测位点对应的碱基为突变型的所述荧光标记寡核苷酸(突变型荧光标记寡核苷酸)和检测位点为突变型的互补序列或者检测位点为野生型的互补序列形成的杂交体形成体、由与检测位点对应的碱基为野生型的所述荧光标记寡核苷酸(野生型荧光标记寡核苷酸)和检测位点为突变型的互补序列或者检测位点为野生型的互补序列形成的杂交体形成体。所述突变型荧光标记寡核苷酸和突变型互补序列的Tm值与所述突变型荧光标记寡核苷酸和野生型互补序列的Tm值之差例如为3°C以上、4°C以上、5°C以上、30°C以下。另外，所述野生型荧光标记寡核苷酸和野生型互补序列的Tm值与所述野生型荧光标记寡核苷酸和突变型互补序列的Tm值之差例如为3°C以上、4°C以上、5°C以上或者7V以上等，例如30°C以下等。本发明的所述荧光标记寡核苷酸例如可以为与未与互补链杂交时的荧光強度相比，与互补链杂交时的荧光強度减少(淬灭)或増加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以为与未与互补链杂交时的突光强度相比，与互补链杂交时的突光强度减少的突光标记寡核苷酸。利用了这种突光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓QProbe (注册商标)。其中尤其优选如下寡核苷酸其被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并用荧光染料标记使得该末端的C靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这种探针，例如可以根据信号变动而容易地确认杂交和解离。除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，ロ丁平出 Taq-man Probe 法、Hybridization Probe 法、Molecular Beacon 法或MGB Probe法等。作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料市售品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue在波长445 480nm下能够检测，对TAMRA在波长585 700nm下能够检测，对BODIPY FL在波长520 555nm下能够检测。如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3'末端添加有磷酸基。因为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液中。另外，通过在所述探针的3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。所述各荧光标记寡核苷酸能够作为检测CYP3A基因中的多态性、尤其是CYP3A5*3、CYP3A4*16和/或CYP3A4*B1的CYP3A基因多态性检测用探针来使用。另外，所述CYP3A基因多态性检测用探针能够用作后述的用于分析熔解曲线的探针。此外，本发明中的所述荧光标记寡核苷酸例如除使用基于前述的条件用荧光、染料标记的碱基之外，还能够按照已知为寡核苷酸的合成方法的公知的方法，例如特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。〈引物〉在后述的CYP3A基因多态性检测方法中，例如在利用PCR法等扩增法扩增含有作为检测对象的CYP3A基因 多态性的序列时使用引物。本发明中可以使用的引物无特别限制，只要能够扩增含有作为目标的检测对象的CYP3A基因的多态性的位点的核酸即可。所述核酸例如可以为含有与序列号I的第401位的碱基对应的碱基的核酸、含有与序列号2的第201位的碱基对应的碱基的核酸、含有与序列号3的第501位的碱基对应的碱基的核酸等。应用于扩增法中的引物只要能够扩增本发明的多态性检测用探针能够杂交的区域即可，无特别限制，本领域技术人员能够基于序列号I、序列号2和序列号3所示的碱基序列，来适当设计。所述引物的长度和Tm值例如可以设为12 40碱基(mer)和40 70碱基，或者16 30碱基和55 60碱基。另外，引物对的各引物的长度例如可以不相同，但是两个引物的Tm值优选大致相同，或者两个引物的Tm值之差为5°C以内。以下示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的示例。此外，这些仅是例示而已，并不限制本发明。用于检测所述序列号I所示的序列中的第401位的碱基(r)的多态性的引物，优选从包括P6、P6’、P7和P7’的组中选择的至少ー种寡核苷酸。所述杂交和严谨条件如前所述。(P6)相对于含有序列号I所示的碱基序列中的第322位 第344位的碱基的碱基长为23 50的碱基序列，具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(P6’)与含有序列号I所示的碱基序列中的第322位 第344位的碱基的碱基长为23 50的碱基序列的互补链，在严谨条件下杂交的寡核苷酸。(P7)相对于含有序列号I所示的碱基序列中的第446位 第463位的碱基的碱基长为18 50碱基的碱基序列的互补链,具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(P7’)与含有序列号I所示的碱基序列中第446位 第463位的碱基的碱基长为18 50的碱基序列，在严谨条件下杂交的寡核苷酸。所述P6寡核苷酸也可以是相对于含有序列号I所示的碱基序列中的第322位 第344位的碱基的碱基长为23 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号I中的第401位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P6’寡核苷酸也可以是与含有序列号I所示的碱基序列中的第322位 第344位的碱基的碱基长为23 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号I中的第401位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P7寡核苷酸也可以是相对于含有序列号I所示的碱基序列中的第446位 第463位的碱基的碱基长为18 50碱基的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号I中的第401位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P7’寡核苷酸也可以是与含有序列号I所示的碱基序列中第446位 第463位的碱基的碱基长为18 50的碱基序列在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号I中的第401位的碱基的区域的寡核苷酸。以下示出本发明的多态性检测方法中，能够在扩增含有所述序列号I中的第401位的碱基(r)的区域时使用的引物的示例。P6F 引物(序列号 14) (CYP3A5*3F4)5' -cgtatgtaccacccagcttaacg-3'P7R 引物(序列号 I5) (CYP3A5*3R4)5' -cacaggagccacccaagg-J'另外，为了检测所述序列号I中的第401位的碱基(r)的多态性，更优选将所述P6或P6’所示的寡核苷酸、以及P7或P7’所示的寡核苷酸作为ー对引物对使用。用于检测所述序列号2所示的序列中的第201位的碱基(S)的多态性的引物优选从包括下述？8、？8’、？9、？9’、？10和？10’的组中选择的至少ー种寡核苷酸。所述杂交和严 谨条件如前所述。(P8)相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第118位 第137位的碱基的碱基长为20 50的碱基序列具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(P8’)与含有序列号2所示的碱基序列中的第118位 第137位的碱基的碱基长为20 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。(P9)相对于含有序列号2所不的喊基序列中的第22位 第49位的喊基的喊基长为28 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性的寡核苷酸。(P9’)与含有序列号2所示的碱基序列中的第22位 第49位的碱基的碱基长为28 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。(PlO)相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第292位 第312位的碱基的碱基长为21 50碱基的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(P10’ )与含有序列号2所示的碱基序列中的第292位 第312位的碱基的碱基长为21 50的碱基序列在严谨条件下杂交的寡核苷酸。所述P8寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第118位 第137位的碱基的碱基长为20 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P8’寡核苷酸也可以是与含有序列号2所示的碱基序列中的第118位 第137位的碱基的碱基长为20 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P9寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第22位 第49位的碱基的碱基长为28 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P9’寡核苷酸也可以是与含有序列号2所示的碱基序列中的第22位 第49位的碱基的碱基长为28 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。所述PlO寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第292位 第312位的碱基的碱基长为21 50碱基的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一性的寡核苷酸、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P10’寡核苷酸也可以是与含有序列号2所示的碱基序列中的第292位 第312位的碱基的碱基长为21 50的碱基序列在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。以下示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有所述序列号2中的第201位的碱基(s)的区域的引物的示例。P8F引物(序列号16)5' _aggatggtaaaaaggtgctg_3，PlOR引物(序列号17)5， _gagagaaagaatggatccaaa_3，
所述引物例如也可以如后面所述具有添加序列，可以例示为以下的引物。下述序列中，下划线部分的CTAGA和GACGA对应于所述添加序列。P9F 引物(序列号 I8) (CYP3A4*16-F6+CTAGA)5’ -CTAGAggagtgtgatagaaggtgatctagtaga-3>PlOR 引物(序列号 28) (U0-R3+GACGA)5， -GACGAgagagaaagaatggatccaaa-3'另外，为了检测所述序列号2中的第201位的碱基(S)的多态性，更优选将所述P8、P8’、P9或P9’所示的寡核苷酸和PlO或P10’所示的寡核苷酸作为ー对引物对来使用。用于检测所述序列号3所示的序列中的第501位的碱基(r)的多态性的引物，优选从包括下述P11、P11’、P12和P12’的组中选择的至少ー种寡核苷酸。所述杂交和严谨条件如前所述。(Pll)相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第432位 第457位的碱基的碱基长为26 50的碱基序列具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(Pir )与含有序列号3所示的碱基序列中的第432位 第457位的碱基的碱基长为26 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。(P12)相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第508位 第539位的碱基的碱基长为32 50碱基的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一'丨生的寡核苷酸。(Ρ12’ )与含有序列号3所示的碱基序列中的第508位 第539位的碱基的碱基长为32 50的碱基序列在严谨条件下杂交的寡核苷酸。所述Pll寡核苷酸也可以是相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第432位 第457位的碱基的碱基长为26 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷酸。所述Ρ1Γ寡核苷酸也可以是与含有序列号3所示的碱基序列中的第432位 第457位的碱基的碱基长为26 50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷酸。所述Ρ12寡核苷酸也可以是相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第508位 第539位的碱基的碱基长为32 50碱基的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷酸。所述Ρ12’寡核苷酸也可以是与含有序列号3所不的喊基序列中的第508位 第539位的喊基的喊基长为32 50的碱基序列在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷酸。以下示出在本发明的多态性检测方法中，能够用于扩增含有所述序列号3中的第501位的碱基(r)的区域的引物的示例。PllF 引物(序列号 26) (CYP3A4-1B-F1)
5' -ctgtaggtgtggcttgttgggatgaa-3'P12R 引物(序列号 27) (CYP3A4-1B-R1)5' -ggagccattggcataaaatctattaaatcgc-3'另外，为了检测所述序列号3中的第501位的碱基(r)的多态性，优选将所述Pll或Ρ1Γ所示的寡核苷酸和P12或P12’所示的寡核苷酸，作为ー对引物对使用。所述P6、P7、P8、P9、P10、Pll和P12中，所述同一性例如也可以显示出85%以上的同一性，90%以上的同一性，95%以上的同一性，96%以上的同一性，97%以上的同一性，98%以上的同一性或99%以上的同一性。本发明中的引物可以是含有所述寡核苷酸的引物，也可以是由所述寡核苷酸构成的引物。前者的情况下，本发明的引物例如可以在所述寡核苷酸的3’末端和5’末端的至少ー者上具有添加序列。所述添加序列无特别限制，其长度例如为I 20碱基长、3 15碱基长、5 10碱基长等，其GC含量例如为20 80%左右、40 70%左右、40 60%左右。本发明的多态性的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸用作探针的方法即可，无特别限制。下面说明利用了 Tm分析的多态性检测方法，作为将所述荧光标记核苷酸用作探针的多态性检测方法的ー个示例。<多态性检测方法>本发明涉及的CYP3A基因多态性检测方法使用至少ー种所述CYP3A基因多态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性。根据本发明涉及的多态性检测方法，能够通过使用至少ー种所述多态性检测用探针，来简便并高灵敏度地检测CYP3A基因的多态性。本发明的多态性检测方法是检测CYP3A基因中的多态性的方法，能够包括下述步骤(I) (IV)，也可以包括下述步骤(V)。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的结构和条件不限于以下的记载。(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述多态性检测用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体。(II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，来使所述杂交体形成体解离，并测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动。(III)基于所述荧光信号的变动来測定Tm值，该Tm值是杂交体形成体的解离温度。(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的、CYP3A基因中的多态性的存在。(V)基于所述多态性的存在，检测所述试样中的单链核酸中的、具有多态性的单链核酸的丰度比。 另外，在本发明中，除了所述步骤⑴ (IV)或所述步骤⑴ (V)之外，还可以包括在步骤(I)之前或者与步骤(I)同时扩增核酸。此外，在所述(III)中測定Tm值时，例如，不仅测定杂交体形成体的解离温度，还可以包括測定在杂交形成体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。在本发明中，所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。在所述核酸为双链核酸的情况下，例如优选包括在与所述荧光标记寡核苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。在本发明中，试样中包含的作为检测对象的核酸例如可以是生物试样中本来含有的核酸，但优选以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增法扩增含有CYP3A基因的突变了的位点的区域而得到的扩增产物，因为这样能够提高检测精度。所述扩增产物的长度无特别限制，例如可以设为50 1000碱基(mer)或者80 200碱基。另外，试样中的核酸例如可以是源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(ReverseTranscription PCR)合成的 cDNA。在本发明中，本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以为I倍以下。另外，从确保充分的检测信号的观点来说，可以将本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩 增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)可使所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)为10倍以下。另外，可以将所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，设为5倍以下或3倍以下。另夕卜，其下限无特别限制，但是可以设为O. 001倍以上，O. 01倍以上或O. I倍以上。本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的測定可以基于前述那样的原理，通过260nm的吸光度測定来进行，优选測定如下信号所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体的形成状态而变动。因此，优选使用前述的荧光标记寡核苷酸来作为所述多态性检测用探针。所述荧光标记寡核苷酸例如可以是与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度比未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸，或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度増加的荧光标记寡核苷酸。如果是前者那样的探针，例如，在该探针和检测对象序列形成了杂交体(双链核酸DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号増加。另外，如果是后者的探针，例如通过与如检测对象序列形成杂交体(双链核酸DNA)而显示荧光信号，通过加热而探针解离时荧光信号減少(消失)。因此，通过在所述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与所述260nm的吸光度測定同样地，确定熔解的发生以及Tm值。接着，举出具体例来说明检测基于荧光染料的信号的变化的方法，即本发明的多态性检测方法。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的步骤和条件没有任何限制。作为含有进行核酸扩增时的模板的试样，只要是含有核酸尤其是CYP3A基因即可，无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等的体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNAPurification kit ；GE Healthcare Bioscience 公司制造)等。接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。所述多态性检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混 合。所述溶剂无特别限制，例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl2、MgS04、甘油等的溶剤、PCR反应液等目前公知的溶剤。所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中，也可以在扩增处理前添加。在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检测用探针的情况下，例如，如前所述，优选在所述检测用探针的3’末端添加荧光染料，或者添加磷酸基。作为核酸扩增的方法，例如可以为利用聚合酶的方法等。作为其示例，有PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过使用聚合酶的方法进行扩增的情况下，优选在本发明探针存在的情况下进行扩增。根据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说是容易的。由此，在核酸扩增后分析探针的Tm值即可评价多态性，因此在反应结束之后，不需要处理扩增产物。由此，不用担心所述扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。另外，作为使用PCR法的DNA聚合酶，无特别限制，可以使用通常所用的DNA聚合酶。例如可以为 GeneTaq(NIPPON GENE 公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TakaraBio公司制)、Taq聚合酶等。作为聚合酶的使用量无特别限制，例如可以采用通常使用的浓度。例如，在使用Taq聚合酶的情况下，相对于反应溶液量50 μ 1，例如可以为O. OlU IOOU的浓度。由此，具有CYP3A基因多态性的检测灵敏度变高等的倾向。另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。此外，在扩增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA (检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例増加，因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视，能够评价试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变DNA)的拷贝数和丰度比。在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触，来使两者杂交。试样中的单链核酸例如可以通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度无特别限制，可以为所述扩增产物能够解离的温度。所述温度例如为85 95°C。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为I秒 10分，或I秒 5分。另外，解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40 50°C。杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为O. 01 μ mol/L I μ mol/L,或O. I μ mol/L 0· 5 μ mol/L。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围，例如可以为O. 001 μ mol/L 10 μ mol/L,或 O. 001 μ mol/L I μ mol/L。然后，将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体形成体慢慢加热，測定随温度上升的荧光信号的变动。例如，在使用QProbe的情况下，在其与单链DNA杂交的状态下，与解离状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如只要将荧光减少(或淬灭)的杂交体形成体慢慢加热，測定随温度上升的荧光强度的增加即可。測定荧光强度变动时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温 85°C， 或25 70°C。结束温度例如可以为40 105°C。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0. 1°C /秒 20°C /秒，或0. 30C /秒 5°C /秒。接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度増加量(荧光强度增加量/1)最高的点确定为Tm值。此外，在标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光強度的减少量即可。另外，本发明中，如前所述，对杂交体形成体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选的是荧光強度的増加)，但是替代该方法，例如也可以检测杂交体形成时的信号变动。即，检测降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体形成体时的随所述温度下降的突光信号变动。作为具体例，在使用QProbe的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体形成体吋，所述荧光減少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光強度的減少。另ー方面，在使用由于杂交体形成而信号増加的标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光強度小(或淬灭)，但是在由于温度下降而形成杂交体吋，荧光强度増加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的増加。在本发明的多态性检测方法中，所述多态性检测用探针例如可以使用任何ー种，也可以并用两种以上。使用的所述多态性检测用探针的种类，例如可以根据检测目标多态性而适当确定。本发明中，例如，可以仅检测CYP3A5*3多态性，仅检测CYP3A4*16多态性，仅检测CYP3A4*1B多态性，也可以在ー个反应体系中检测任何两种或三种全部的多态性。另夕卜，可以在ー个反应体系中检测所述CYP3A5*3多态性、CYP3A4*16多态性和CYP3A4*1B多态性中的至少任ー个和其他的多态性。在本发明的多态性检测方法中，在并用两种以上所述多态性检测用探针的情况下，例如各探针优选为具有不同的荧光染料的标记探针。所述不同的荧光染料例如可以为检测条件不同的荧光染料。作为在同一体系中检测多个基因多态性的方法，无特别限制。例如，可以预先将能够检测各多态性的各探针混合，添加到试样中，也可以将能够检测各多态性的各探针连续添加到含有单链核酸的试样中。这里，“体系”是指使用含有由荧光标记寡核苷酸和单链核酸杂交的杂交体形成体的试样形成的ー个独立的反应体系。<药效判定方法>本发明的药效判定方法包括通过前述的多态性检测方法检测CYP3A基因的多态性；以及基于所述检测结果来判定对药剂的耐性或者药剂的药效。在所述多态性检测方法中，使用本发明中的多态性检测用探针，高灵敏度并简便地检测CYP3A基因的多态性。因此，基于CYP3A基因中的该多态性，可以高灵敏度并简便地进行药剂的判定。另外，基于多态性的有无、突变序列和正常序列的丰度比，可以判断针对药剂的耐性或药剂的药效。因而，本发明的药效判定方法在基于有无突变、突变序列的丰度比来确定疾病的治疗方针中有用，例如増加药剂施与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。作为所 述判定对象的药剂，例如可以为免疫抑制剂、分子靶向治疗药、抗抑郁药等，尤其可以为免疫抑制剂和分子靶向治疗药。作为所述药剂的具体例，例如可以为tacrolimus等免疫抑制齐 。CYP3A基因与具体药剂的耐性或药剂的药效的判定之间的关系是本领域技术人员已知的，例如可以參见http://www. genemedrx. com/Cytochrome_P450_MetaDo11sm_TabIe. php例如，作为具体实例，可以给出以下的具体药剂药剂适应症/药效作用部位作用机理
胺碘酮K通道阻断奎尼丁
硝苯地平爲药抗Ca脳电位依赖性L型甲通道阻断
他莫昔芬抗肿瘤药与雌激素受体结合
环磷酰胺抗肿瘤药DNA烷基化
紫杉醇抗肿瘤药抑制微小管解聚
依托泊苷抗肿瘤药II型拓扑异构酶阻断
卡马西平精神科药物Na通道阻断
咪唑安定麻酔导入药、镇静药苯ニ氮受体结合
三唑仑睡眠导入药苯ニ氮受体结合
地西泮抗癫痫药物苯ニ氮受体结合
可卡因局部麻酔药Na通道阻断
利多卡因局部麻酔药Na通道阻断
红霉素大环内酯类抗生素阻碍蛋白质合成结合核糖体50亚单位
克拉霉素大环内酯类抗生素阻碍蛋白质合成结合核糖体50亚单位
仙士苗=!ん杭灿由丨花阻断韩调神经磷与FKBP (FK506 binding
麵protein)形成复合体
环孢素A 免疫抑制药结合T議内興调神经磷麵
可待因阿片样物质与阿片受体结合
皮质醇纟与糖皮质激素受体结合
睾酮男性性激素<多态性检测用试剂盒>用于检测本发明的CYP3A基因中的多态性的CYP3A基因多态性检测用试剂盒包括前述的多态性检测用探针。所述多态性检测用试剂盒通过含有能够简便且高灵敏度地检测CYP3A基因中序列号I所示的序列中的第401位的碱基中的多态性、序列号2所示的序列中的第201位的碱基中的多态性和/或序列号3所示序列中第501位的碱基中的多态性的至少ー种所述多态性检测用探针，具有能够更简便地检测例如CYP3A基因的多态性等的倾向。另外，本发明中的多态性检测用试剂盒也可以还包括用于扩增含有作为前述的检测对象的CYP3A基因多态性的序列的引物。由此，本发明中的多态性检测用试剂盒可以高精度地检测CYP3A基因的多态性。此外，对于所述多态性检测用试剂盒中可以包含的所述探针和引物，可以直接适用前述的事项。在包含两种以上的荧光标记寡核苷酸作为所述多态性检测用探针的情况下，各个荧光标记寡核苷酸可以以混合的状态被包含，也可以单独包含各个荧光标记寡核苷酸。另外，在两种以上的本发明的探针以混合的状态被包含在本发明的多态性检测用试剂盒中的情况、以及两种以上的本发明的探针作为単独的试剂被包含但例如在使用时在相同的反应系中进行各荧光标记寡核苷酸与各检测对象序列的Tm分析的情况下，优选两种以上的各探针通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。通过如此改变荧光物质的种类，即使在相同的反应体系中也能够进行针对各个探针的检测。另外，本发明中的检测用试剂盒除了所述探针之外，也可以还含有进行本发明检测方法中的核酸扩增所需要的试剂类。另外，所述探针、所述引物和其他试剂类，可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成混合物。此外，“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。本发明的检测用试剂盒通过包括用于扩增含有多态性位点的序列(与探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测多态性。 另外，本发明的多态性检测用试剂盒优选含有使用说明书。所述使用说明书例如可以是记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测CYP3A基因中的突变的使用说明书，或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。实施例下面说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。[实施例I]在本例中，在野生型的被检核酸和突变型的被检核酸共存的情况下进行Tm分析，并检测了 CYP3A基因的CYP3A5*3多态性和CYP3A4*16多态性。准备稀释血液、精制基因组和质粒作为核酸试样。所述稀释血液如下制备将使用EDTA采血管采集的全血10 μ L和下述表2所示的稀释液170 μ L混合制备混合液，将所述混合液10 μ L和下述表2所示的稀释液270 μ L混合之后，再将其在95°C下加热10分钟。在所述全血中包含的被检核酸中，CYP3A5*3多态性为野生型和突变型的杂合子，CYP3A4*16多态性为野生型的纯合子。所述精制基因组利用常用方法由全血制备。在所述精制基因组中，CYP3A5*3多态性为突变型的纯合子，CYP3A4*16多态性为野生型的纯合子。作为所述质粒，准备了插入有作为CYP3A4基因的部分序列的、序列号2中的碱基编号I 411的寡核苷酸的CYP3A4*16突变型质粒。在所述CYP3A4*16突变型质粒中，序列号2中的碱基编号201的碱基(s)为鸟嘌呤(g)。表2(稀释液1:7O μ I)10mmol /T, Tris-HCL (ρΗ8· O)O. lmmol/L EDTA (ρΗ8· 0)0. 3w/v% SDS(稀释液2:70ul)10mmol/L Tris-HCL(ρΗ8· O)0. lmmol/L EDTA (ρΗ8· 0)以下述所示的比例混合所述核酸试样，制备了下述试样I 4。
(试样)
权利要求
1.一种多态性检测用探针，用于检测CYP3A基因的多态性，所述多态性检测用探针是从包括下述PI、ΡΓ、P2、P2，、P3、P3，、P4、P4，、P5和P5，的组中选择的ー种荧光标记寡核苷酸 (PD荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的碱基的碱基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号I相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号I所示的序列中的第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记； (ΡΓ )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号I所示的序列中第401位 第411位的碱基的碱基长为11 50的序列，其除了与序列号I中的第411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号I相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号I所示的序列中的第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记； (P2)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201位 第205位的碱基的碱基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之夕卜，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记； (P2’ )荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201位 第205位的碱基的碱基长为5 50的序列，其除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记； (P3)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的喊基为胞喃唳之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记； (P3’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第190位 第201位的碱基的碱基长为12 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记； (P4)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的喊基为胞喃唳之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记； (P4’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第186位 第201位的碱基的碱基长为16 50的序列互补的序列，其除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记； (P5)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞喃唳之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且其中与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记； (P5’ )荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496位 第501位的碱基的碱基长为6 50的序列互补的序列，其除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号3相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。
2.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸识别序列号I中的第401位的碱基的多态性。
3.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位具有用所述荧光染料标记的所述碱基。
4.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用所述荧光染料标记的所述碱基。
5.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
6.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少。
7.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中， 所述Pl和ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 30碱基长， 所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 30碱基长， 所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为12 40碱基长， 所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱基长为16 40碱基长， 所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 40碱基长。
8.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中， 所述Pl和ΡΓ的荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 20碱基长， 所述P2和P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10 20碱基长， 所述P3和P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为15 30碱基长， 所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20 30碱基长， 所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20 30碱基长。
9.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针是用于分析熔解曲线的探针。
10.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针具有序列号37、序列号38、序列号39、序列号41、序列号43或序列号45所示的碱基序列。
11.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针具有序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号44或序列号12所示的碱基序列。
12.一种多态性检测方法，通过使用权利要求I所述的多态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性。
13.根据权利要求12所述的多态性检测方法，包括 (I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述多态性检测用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体； (II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，来使所述杂交体形成体解离，并測定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动； (III)基于所述荧光信号的变动来測定Tm值，该Tm值是杂交体形成体的解离温度；以及 (IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的CYP3A基因的多态性的存在。
14.根据权利要求13所述的多态性检测方法，其中，还包括 在所述(I)之前或者与(I)同时扩增核酸。
15.ー种药剂的药效评价方法，包括 利用权利要求12所述的多态性检测方法来检测CYP3A基因的多态性；以及 基于检测的多态性的有无来评价对药剂的耐性或者药剂的药效。
16.一种多态性检测用试剂盒，用于检测CYP3A基因的多态性，所述多态性检测用试剂盒包括权利要求I所述的多态性检测用探针。
17.根据权利要求16所述的多态性检测用试剂盒，还包括 用于扩增含有与所述多态性检测用探针杂交的序列的区域的引物。
全文摘要
本发明提供了CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒。本发明的多态性检测用探针能高灵敏度且简便地检测CYP3A基因多态性。
文档编号C12N15/11GK102676652SQ20121006545
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者井口亚希, 平井光春 申请人:爱科来株式会社