专利名称：提供疾患特异性结合分子和靶的方法
技术领域：
本发明涉及识别蛋白的疾患相关表位(包括新表位)的新的特异性结合分子， 特别是人抗体及其片段、衍生物和变体，所述蛋白来自天然的内源蛋白，并且在患者体内以变体形式和/或脱离其正常生理环境普遍存在。另外，本发明涉及包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和筛选治疗各种疾病、特别是神经疾病(诸如阿尔茨海默病、淀粉样蛋白病和￠-淀粉样蛋白病变)的新的结合分子(可以是或可以不是抗体)、靶和药物的方法。
背景技术：
成功产生单克隆抗体依赖于抗原刺激的B细胞与鼠骨髓瘤细胞系的有效和选择性融合，然后选择产生杂交体的稳定的抗体，最初描述于K 0 hler和Milstein，Nature 256 (1975)，495-497。然而，鉴于其非人来源，基于鼠的抗体在人中的治疗效用受限于人抗鼠抗体(HAMA)应答。通过遗传工程可获得用于制备人或类人单克隆抗体的方法。然而，迄今可用的方法具有以下缺点它们不适合用来产生具有在生理的人类免疫应答过程中产生的抗体的特征的抗体。此外，由于在具有正常生理功能的情况下与其他蛋白和/或靶蛋白的交叉反应性，此类抗体可能不够特异。例加，在阿尔茨海默病或帕金森病中，认为还以高亲和力与淀粉样前体蛋白(APP )或a突触核蛋白的生理衍生物交叉反应的抗体表现出与生理靶结构的正常功能相关的副作用。在这方面，不希望的自身免疫病将完全被诱导一一种在采用生理上也存在变体形式的蛋白结构的主动免疫实验的方案设计中几乎不可估算的危险。与靶结构无关的副作用是例如过敏反应，其被预期为系统性施用外源蛋白的不希望的和可怕的副作用。根据近来的发现，在最初来自非人生物(通常来自小鼠)的所谓人源化抗体中也能发生这种情况。另一方面，病理相关抗原的主动免疫具有相当大的患者发展也识别此类蛋白的生理变体的抗体和T细胞应答的危险，并且因此导致危险的和不可控制的自身免疫应答。因此，需要提供特异于疾病涉及的靶并被人体耐受的物质。
发明内容
发明概述
本发明的一个目的是一种用于鉴定、验证和产生诊断上和治疗上有用的结合分子，特别是针对内源蛋白的病理变体的抗体的方法。更具体地，本发明涉及分离疾患相关蛋白特异性结合分子的方法，其包括(a)使获自无症状，或临床上异常稳定，但患有疾病或处于发展疾病危险的患者的样品经受具有预定病理特征的病理改变的细胞或组织的试样；和
(b)鉴定并任选地分离与所述试样结合，但不与可来自健康对象的没有此类病理特征的对应细胞或组织结合的结合分子。已知的事实是，在自身免疫病中，抗体针对自体细胞和由所述细胞表达的蛋白或诸如糖脂的其他化合物，同时避开已知的耐受机制。同样已知的事实是，在内源赘生性发展中，赘生性细胞的细胞和体液免疫可发展，并且因此可影响针对赘生性组织变性的内源免
疫保护机制。本发明利用抗体也可针对内源蛋白的病理生理相关变体，特别是针对新表位的惊人发现，所述新表位是由于病理改变的转录、翻译、或转录后或翻译后修饰、或蛋白酶解加工、或聚集而形成的。此类抗体针对由于其偏离正常生理的新结构通过发展病理效应而变得与病理生理相关的内源蛋白。然而，由于免疫耐受，在此类病理变体中与对新表位的对应免疫应答有关的抗体未正常表现出针对生理功能性蛋白的任何交叉反应，这与自身免疫病中的情况相反。这是因为潜在交叉反应性抗体的形成被已知的耐受机制特异地抑制， 而对病理新表位的免疫应答的发展可逃避耐受。因此，本发明涉及通过与可识别病理结构的相互作用而从临床上预选的人类对象中鉴定诊断上、治疗上和预防上有活性的结合分子，特别是抗体和抗体片段的新方法。因此，本发明涉及能识别疾患相关蛋白的表位(包括新表位)的抗体或抗原结合片段和相似的抗原结合分子，所述疾患相关蛋白来自天然的内源蛋白，并且在患者体内以变体形式(例如作为病理蛋白)和/或脱离其正常生理环境普遍存在。此外，本发明涉及包含所述抗体的组合物，以及使用该组合物的免疫治疗和免疫诊断方法。此外，在抗体鉴定中，根据本发明的方法可无需事先假设其分子靶结构的身份，而只是通过其与病理相关结构的结合来执行。除了因此可能鉴定迄今未知的、特定疾患的分子靶结构外，专门针对病理结构的抗体的进一步优势基于它们的药物动力学有效性不受与非疾患组织结合以使抗体的浓度和吸收效应被缓冲因此妨碍治疗有效浓度的确定的方式负面影响的事实。此外，本发明的抗体和结合分子优选特征在于它们分别在体内与疾患相关蛋白的变体形式或与细胞或细胞膜反应，并且在具有病理特征的疾患组织的切片上，但不与或显著更少程度地与同族蛋白的生理变体反应；还参见，例如，实施例2。由于本发明允许在疾患细胞和组织中鉴定和分离分子靶结构，进一步的实施方案分别涉及由本发明的新表位特异抗体结合的抗原和病理蛋白(即疾患相关蛋白)。特别优选的实施方案是证明特征为下文表2和3所述的可变区Vh和/或\ 的任一抗体的免疫结合特征的人抗体或其抗原结合片段。可选地，抗体是人源化、异源、或嵌合人一鼠抗体，后者特别用于动物的诊断方法和研究。包括抗体或其活性片段、或激动剂和同族分子、或可选地(alternately)其拮抗剂的治疗性组合物、此类组合物在使用这些组合物预防、诊断或治疗疾患中的用途方法也包括在本发明中，其中将有效量的组合物施用于需要此类治疗的患者。抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2 片段、或任何其他抗原结合片段。在下文特定的实施方案中，抗体或其片段是人IgG同种型抗体。自然地，本发明分别扩展至产生具有下文限定的特殊和独特特征的抗体的永生化人类B记忆淋巴细胞和B细胞。本发明还涉及编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的至少可变区的多核苷酸。 优选地，所述可变区包括下文表2和3所述的Vh和/或\可变区的至少一个互补决定区 (OTR)。⑶R的对应组在下文表4中给出。相应地，本发明还包括包含所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞，以及它们用于产生特异于指示和/或引起疾病(特别是脑疾病，诸如阿尔茨海默病和帕金森病)的新表位的抗体和等效结合分子的用途。抗体、免疫球蛋白链、其结合片段和与所述抗体结合的抗原可分别用在药物组合物和诊断组合物中用于免疫治疗和诊断。然而前述组合物在制备药剂中的用途是优选的。因此，本发明的特定目的是提供用于治疗或预防特征为中枢神经系统中蛋白的异常积累和/或沉积并且不干扰相应蛋白的天然功能的神经疾病的方法。该方法包括将有效浓度的抗体或抗体衍生物施用于对象，其中抗体与蛋白的病理形式或蛋白沉积物的结合亲和力显著高于与蛋白的正常生理形式的结合亲和力。在优选实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防或减缓对象中与淀粉样蛋白P肽的积累和沉积相关疾患的发病的方法，所述疾患诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征、轻度认知损害、脑淀粉样蛋白血管病、血管性痴呆、多发性梗死性痴呆。该方法包括将有效浓度的抗体或抗体衍生物施用于对象，其中抗体与蛋白的病理形式或蛋白沉积物的结合亲和力高于与蛋白的正常生理形式的结合亲和力。相似的治疗性方法预计用于治疗帕金森病、亨廷顿病、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、囊性纤维化、高雪病(Gaucher’s disease)和类似疾病。根据以下的说明书，本发明的其他实施方案将是明显的。附图简述
图I:针对￠-淀粉样蛋白的抗体。A:人抗体。B :用针对人￠-淀粉样蛋白的已知抗体的对照染色。患有阿尔茨海默病的临床上异常稳定的患者含有针对￠-淀粉样蛋白斑块的抗体。用来自临床上异常稳定的患者的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与由针对人￠-淀粉样蛋白的已知抗体确认的淀粉样蛋白斑块结合的抗体。图2 :针对神经原纤维缠结的抗体。A:人抗体。B:用针对人tau的已知抗体的对照染色。健康的人类对象含有针对神经原纤维缠结的抗体。用来自健康对象的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与由针对人tau的已知抗体确认的神经原纤维缠结结合的抗体。图3 :针对营养不良性轴突的抗体。A:人抗体。B:用针对人tau的已知抗体的对照染色。健康的人类对象含有针对营养不良性轴突的抗体。用来自健康对象的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与营养不良性轴突结合的抗体。图4 :针对0 -淀粉样蛋白的抗体。该图显示从临床上异常稳定的阿尔茨海默病患者中分离的重组人NI-101.11抗体与脑￠-淀粉样蛋白斑块的特异性结合。获自患有神经病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片用指示浓度的重组人抗体染色。50 pM 浓度的抗体与P-淀粉样蛋白斑块的结合暗示了高亲和力的结合。图5 :线性的合成N-末端A ^多肽不竞争重组人NI-101. 11抗体与P -淀粉样蛋白斑块的结合。代表位置I至16的可达I PM浓度的N-末端A ￠-衍生多肽不能竞争针对脑￠-淀粉样蛋白的重组抗体(0.5 nM)的结合。图6 :重组人NI-101. 11抗体识别单体A P中不存在的构象A P表位。A ^ 1-42原纤维而不是线性的合成A ^ 1-42单体可竞争脑切片上NI-101. 11与P -淀粉样蛋白斑块的结合。图7 :蛋白质印迹上重组人NI-101. 11抗体不与线性、单体的合成A @结合。 单体A ^制品通过非变性PAGE分离。印迹蛋白用针对￠-淀粉样蛋白的人重组抗体和针对N-末端线性A ^序列的对照抗体(6E10)来探测。没有检测到NI-101. 11与单体A ^ 的结合。这一观察暗示该抗体识别构象A ^表位。图8 :人NI-101. 11抗体结合从合成的A ^ 1-42肽制备的人工淀粉样蛋白原纤维。以同样包被密度包被于ELISA板上的合成的A ^原纤维或单体的合成A ^与指示浓度的针对脑￠-淀粉样蛋白的重组人抗体一起孵育。针对脑￠-淀粉样蛋白的人抗体与人工淀粉样蛋白原纤维的结合活性(空心方块)比单体A ^ (实心方块)高100多倍。对照抗体22C4优先与单体A ^ (实心圆圈)结合，而与原纤维(空心圆圈)结合得不太好。这暗示NI-101.11识别也存在于从合成的A ^肽制备的人工淀粉样蛋白原纤维上的构象表位。图9 :重组人NI-101. 11抗体与细胞全长APP或者存在于培养细胞中的任何其生理衍生物没有交叉反应性。与结合细胞表面APP的对照抗体(6E10)相反，NI-101. 11 不与存在于细胞表面的全长APP结合。这些数据说明NI-101. 11与生理的细胞全长APP没有交叉反应性。
图10A-C:通过大小排阻层析NI-101. 11不与单体A P结合。图IOA和IOB 显示NI-101. 11或不相关的对照抗体不与单体FITC-标记的A ^ 1-42结合，而图IOC显示识别存在于A P的C-末端的线性表位的抗体22C4的显著结合。图11:竞争性ELISA显示与过量浓度的单体AP肽预孵育后，抗体6E10 (针对A P的N-末端的线性表位的抗体)的结合可被完全阻抑，而与过量浓度的这些单体A ^ 肽制品的预孵育没有破坏NI-101. 11的结合。图12 =NI-IOl. 13A和NI-101. 13B与获自阿尔茨海默病的Tg2676转基因小鼠模型的脑切片的结合。图13: ELISA显示与单体A P相比，NI-101. 13A和NI-101. 13B优先结合人
工淀粉样蛋白原纤维。图14A-B:图14A显示ELISA中重组NI-101. 12与合成的A3 1_42肽的结合。 图14B显示过量的A P 1-42肽竞争NI-101. 12的结合。图15:在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，针对脑淀粉样蛋白的重组人NI-101. 11抗体穿越血脑屏障,并在体内与脑P -淀粉样蛋白斑块结合。图16A-B :在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，重组人NI-101. 11抗体改善了异常认知行为。24个月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗体i. p.治疗2个月。在治疗完成之前和之后进行Y-迷宫行为测试。
图17:通过外周施用NI-101. 11的淀粉样蛋白斑块的血脑屏障穿透和修饰( decoration)。在NI-101. 11治疗小鼠中(左图)，NI-101. 11可穿越血脑屏障，并与￠-淀粉样蛋白沉积物结合，而在用人对照抗体治疗的动物中(右图)，没有此类染色可见。在系统性治疗两个月之后，重组人NI-101. 11抗体减少了脑￠-淀粉样蛋白斑块的负载。图18:用NI- 101. 11的被动免疫减少了 arcAP小鼠中P _淀粉样蛋白的负载。(A，B)硫代黄素S和刚果红斑块负载分析揭示了与对照抗体治疗的动物相比超过50%的显著减少(曼-惠特尼U; ThioS:皮层p=0. 02，海马p=0. 009，和刚果红分析皮层p=0.009， 海马p=0. 04)。比例尺200 u m。(C-E)硫代黄素S分析揭示了与对照治疗的动物相比， NI-101. 11治疗的arcAP小鼠中￠-淀粉样蛋白负荷(C)、P -淀粉样蛋白斑块的数目⑶ 和平均斑块大小(E)的显著减少。曼-惠特尼U统计皮层斑块面积p=0. 02;海马斑块面积p=0. 009;皮层斑块数目p=0. 047 ;海马斑块数目p=0. 047 ;皮层斑块大小p=0. 009;海马斑块数目P=O. 009。图19:减少的P -淀粉样蛋白负载伴随着减少的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。A)抗GFAP染色的定量揭示，当与对照治疗的转基因动物相比时，NI-101. 11治疗的arcAP小鼠皮层中反应性星形胶质细胞数目的显著减少。B) Iba-I染色的定量显示在 NI-101. 11治疗的小鼠皮层和海马中倾向于减少数目的活化小胶质细胞。比例尺200 iim。图20:用重组人NI-101. 11抗体治疗两个月后，脑微出血没有增加。患有已证实的块状嗜刚果红淀粉样蛋白血管病的24个月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗体i.p.治疗2个月。arcAP小鼠脑微出血的代表图片由Perl氏普鲁士蓝染色显示(左侧)。定量分析说明与其野生型同窝小鼠相比，arcA^转基因小鼠中显著增加的微出血( micorhemorrhages)频率。用NI-101. 11的慢性治疗没有导致微出血(micorhemorrhages) 频率的增加。比例尺20iim。图21:重组人NI-101. 11抗体在体外抑制合成的AP原纤维的形成。重组人 NI-101.11抗体对AP原纤维形成的影响通过荧光分析测量与聚集的AP结合的硫代黄素 S来测定。图22 BV-2小胶质细胞中抗体-介导的剂量依赖性的FITC-A ^ 1-42原纤维的吞噬作用在抑制了清除受体系统后测量。NI-101. 11触发强有力的剂量依赖性的Fcy受体-介导的AP原纤维的吞噬作用。发明详述
I.定义
应注意，术语“一个(a) ”或“一个(an)"实体指一个或多个该实体；例如，“一个抗体(an antibody)”理解为代表一个或多个抗体。因此，术语“一个(a)”(或“一个 (an) ”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。如本文所用，术语“多肽”预期包括单个“多肽(polyp印tide) ”以及两个以上“多肽(polyp印tides)”，并且指主要由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任一条或几条链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指两个或多个氨基酸的一条或几条链的任何其他术语都包括在定义“多肽”内，并且术语“多肽”可代替或与任何这些术语互换使用。
术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰产物，包括但不限于已知保护/封闭基团的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、或非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术产生，但不是必然地从指定的核酸序列翻译而来。多肽可以任何方式产生，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以是约3个或更多、5个或更多、I 0个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、 1000个或更多、2000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必然地具有这样的结构。具有确定三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有确定三维结构而是可采用多种不同构象的多肽被称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白指与通过氨基酸残基(例如，丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链与蛋白相连的至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白。“分离”多肽或其片段、变体或衍生物意指不处于其天然环境的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离多肽可从其天然或自然环境脱离。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，通过任何适合的技术而分离、分级分离、或部分或基本纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。 当指本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应的天然结合分子、抗体或多肽的抗原结合特性的至少一些的任何多肽。本发明的多肽片段包括蛋白水解片段和缺失片段，以及在本文其他地方讨论的特定抗体片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括上述片段，还包括由于氨基酸置换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。新表位特异性结合分子(例如本发明的抗体和抗体多肽)的衍生物是已被改变以便表现出未发现于天然多肽的其他特点的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文也称为“多肽类似物”。如本文所用，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”指具有通过功能性侧基的反应而化学衍生化的一个或多个残基的主题多肽。“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可置换脯氨酸； 5-羟赖氨酸可置换赖氨酸；3_甲基组氨酸可置换组氨酸；同型丝氨酸可置换丝氨酸；鸟氨酸可置换赖氨酸。术语“多核苷酸”预期包括单个核酸以及两个以上的核酸，并且指分离核酸分子或构建体，例如，信使RNA (mRNA)或质粒DNA ( pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，诸如发现于肽核酸(PNA)中)。术语“核酸”指存在于多核苷酸的任一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。“分离”核酸或多核苷酸意指从其天然环境脱离的核酸分子(DNA或RNA)。例如，为了本发明的目的，包含于载体中的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离多核苷酸的其他实例包括保持于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本纯化的)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，诸如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，其可被认为是编码区的一部分，但是例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子以及类似序列的任何侧翼序列不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如，在单个载体上)，或在分开的多核苷酸构建体中(例如，在分开的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或多个编码区，例如，单个载体可分别编码免疫球蛋白的重链可变区和免疫球蛋白的轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可编码与编码结合分子、抗体、或其片段、变体、或衍生物的核酸融合或不融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特定的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能性结构域。在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况中，包含编码多肽的核酸的多核苷酸正常可包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相连的其他转录或翻译控制元件。可操作连接是基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调节序列以使基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下的方式相连。如果启动子功能的诱导引起编码需要的基因产物的mRNA的转录，以及如果两个DNA片段之间的键合性质不干扰表达调节序列指引基因产物表达或不干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其结合的启动子)是“可操作连接”。因此，如果启动子能影响该核酸的转录，那么启动子区将与编码多肽的核酸可操作连接。启动子可以是指引DNA仅在预定细胞中基本转录的细胞特异性启动子。除启动子外，其他转录控制元件(例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号)可与多核苷酸可操作地连接以指引细胞特异性转录。适合的启动子和其他转录控制区公开于本文。多种转录控制区对本领域技术人员是已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于，来自巨细胞病毒(即时早期启动子，连同内含子-A)、猿猴病毒40 (早期启动子)、和反转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括来自脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔￠-珠蛋白)的转录控制区，以及能在真核细胞中控制基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导型启动子(例如， 可由干扰素或白介素诱导的启动子)。相似地，多种翻译控制元件对本领域普通技术人员是已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和来自小RNA病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码指引由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌的分泌或信号肽的其他编码区缔合。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦正在生成的蛋白链起始了穿过粗面内质网的输出，信号肽或分泌前导序列从成熟蛋白上切下。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N-末端融合的信号肽，信号肽从完整或“全长”多肽上切下以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽(例如，免疫球蛋白重链或轻链的信号肽)，或者保留了指引与其可操作连接的多肽的分泌的能力的那些序列的功能性衍生物。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠￠-葡糖醛酸酶的前导序列来置换野生型前导序列。除非另外指明，术语“疾病”和“疾患”在本文可互换使用。在本发明上下文使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但也可指与新表位结合的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、诸如热激蛋白(HSP)的分子伴侣，以及细胞-细胞粘着分子，诸如I丐粘着蛋白、整联蛋白(intergrin)、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为清楚起见，并且不限制本发明的范围，下述实施方案的大多数是就代表用于治疗和诊断剂开发的优选结合分子的抗体和类抗体分子而讨论的。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用。抗体或免疫球蛋白是包含重链的至少可变结构域、并且正常包含重链和轻链的至少可变结构域的抗原结合分子。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构了解得相对清楚。参见,例如,Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual (抗体实验指南)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版， 1988)。如下文将更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包含可生化地区别的多种类别的多肽。本领域技术人员将理解，重链分为Y、U、a、6或e ( y , u , a , 6 , e )，其中有一些亚类(例如，Yl- Y 4)。链的性质确定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA IgG或 IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等，表征得很清楚，并且已知其赋予功能专门化。鉴于本公开内容，这些类别和同种型的每一个的修饰形式对熟练的技术人员来说是容易辨别的，并且相应地在本发明的范围内。所有的免疫球蛋白类别都清楚地在本发明的范围内，下述讨论一般将针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两条相同的分子量大约23，000道尔顿的轻链多肽和两条相同的分子量53，000-70, 000的重链多肽。四条链一般以“Y”构型由二硫键相连，其中轻链支持重链，在“Y”的口处开始并延续经可变区。轻链分为K或入(k, A)0每重链类别可与K或入轻链结合。一般而言，当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键合或非共价键合彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉末端的N-末端延伸到每条链底部的C-末端。轻链和重链都分成结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”功能地使用。 在这方面，应理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，诸如分泌、 经胎盘的迁移率、Fe受体结合、补体结合及类似特性。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得与抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。N-末端部分是可变区，而C-末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。如上文所示，可变区允许抗体选择性地识别和特异地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域、或互补决定区(CDR)的亚型组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成了存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。 更具体地，该抗原结合位点由每条VH和VL链上的三个CDR定义。含有足以特异结合抗原的结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文可交换表示为“抗原结合片段”或“免疫特异性片段”。在天然存在的抗体中，每个抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或 “CDR”是特异地定位以便当抗体在水环境中采取其三维构型时形成抗原结合结构域的短的、不相邻的氨基酸序列。抗原结合结构域中剩余的氨基酸(称为“构架”区)显示更低的分子间可变性。构架区主要采取￠-折叠构象，而⑶R形成连接的环，在一些情况中，⑶R形成￠-折叠结构的一部分。因此，构架区的作用是形成提供CDR通过链间非共价相互作用以正确取向定位的支架结构。定位的CDR形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同族表位的非共价结合。本领域普通技术人员可容易地鉴定任何特定重链或轻链可变区的分别包含CDR和构架区的氨基酸，因为这些氨基酸已被精确定义(参见，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” (具有免疫学重要性的蛋白序列)Kabat，E.等，美国卫生及公共服务部，(1983);和Chothia 和Lesk, JMol. Biol. ,196:901-917 (1987)，其通过引用整体并入本文)。在本领域使用和/或接受的术语有两种或多种定义的情况中，本文所用的术语的定义预期包括所有这些含义，除非明确指明为相反的意思。具体实例是使用术语 “互补决定区”(“CDR”)来描述重链和轻链多肽可变区内发现的不相邻的抗原组合位点。 这一特定区域已描述于Kabat等,美国卫生及公共服务部,“Sequences of Proteins of Immunological Interest” (具有免疫学重要性的蛋白序列)(1983)和Chothia等,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)，其通过引用并入本文，其中当彼此比较时，定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的亚型。然而，指抗体或其变体的CDR的任一定义的应用预期在本文定义和使用的术语的范围内。由上文引用的每个参考文献定义的包含CDR的适当氨基酸残基描述于下文的表I中作为比较。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员常规地可根据抗体的可变区氨基酸序列来确定哪些残基包含特定的 CDR。表I :CDR 定义 权利要求
1.一种分离疾病相关蛋白特异性结合分子的方法，所述方法包括(a)使获自无症状但患有疾病或处于发展疾病的危险的患者、或具有异常稳定的疾病进程的患者的样品经受具有预定临床特征的病理上改变的细胞或组织试样；和(b)鉴定并任选地分离与所述试样结合、但不与健康对象的对应细胞或组织结合的结合分子。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述样品包括体液或细胞样品，最好其中(a)所述体液是脑脊液、血浆或尿液；并且/或者(b)所述样品包括或来自B细胞或记忆B细胞。
3.如权利要求I或2中所述的方法，其中所述结合分子是抗体。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其中所述患者和对象分别为人。
5.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述患者已通过有或没有替代标志物而被确定患有尚未表现的疾病或处于发展疾病的危险，最好其中所述替代标志物选自老年、脑淀粉样蛋白负载，ApoE基因型、APP基因型、PSl基因型、体液中AP肽的水平、异前列腺素、Tau和磷酸-Tau。
6.如权利要求I至5中任一项所述的方法，其中所述疾病选自神经疾病、自身免疫病和肿瘤，最好其中所述疾病是阿尔茨海默病。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述样品获自满足以下标准的患者(i)年龄为65岁或更大；(ii)具有完全的认知能力和良好的健康；和(iii)没有痴呆的临床体征；或(iv)具有异常缓慢的疾患进展速度，尽管存在可能为阿尔茨海默病的确定的临床诊断。
8.如权利要求I至7任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤(i)从已鉴定含有与所述试样结合但不与健康对象的对应细胞或组织结合的例如抗体的结合分子的样品中纯化B细胞或B记忆细胞；(ii)从所述B细胞或B记忆细胞获得所述抗体的免疫球蛋白基因谱系；和(iii)使用所述谱系表达所述抗体，最好其中步骤(ii)包括以下步骤(iv)从所述B细胞或记忆B细胞获得mRNA；(V)从步骤(iv)的mRNA获得cDNA ;和(vi)使用引物延伸反应从所述cDNA扩增对应于所述抗体的重链(HC)和K轻链(LC) 的片段。
9.一种结合分子，其可通过权利要求I至8任一项所述的方法获得，所述结合分子能选择性地识别疾病相关蛋白的新表位，最好其中所述的结合分子基本不识别以其非疾病相关形式存在的所述蛋白。
10.如权利要求9所述的结合分子，其为抗体或其抗原结合片段，最好其中的抗体为人抗体。
11 如权利要求9或10中所述的结合分子，其中所述疾病为神经疾病，最好其中所述疾病是脑疾病。
12.如权利要求9至11任一项所述的结合分子，其选自单链Fv片段(scFv)、F (ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段。
13.一种多核苷酸，其编码权利要求9至12任一项所述的结合分子。
14.一种载体，其包含权利要求13所述的多核苷酸，任选地与编码所述抗体的其他免疫球蛋白链的可变区的权利要求13所述的多核苷酸组合。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的多核苷酸或权利要求14所述的载体。
16.一种用于制备疾病相关蛋白特异性结合分子、抗体或其结合片段或免疫球蛋白链的方法，所述方法包括(a)培养权利要求15所述的细胞；和(b)从所述培养物中分离所述结合分子、抗体或其结合片段或免疫球蛋白链。
17.一种结合分子、抗体、或其免疫球蛋白链或结合片段，其由权利要求13所述的多核苷酸编码，或者可通过权利要求16所述的方法获得。
18.如权利要求9至12或17中任一项所述的结合分子、抗体或结合片段(a)其被可检测地标记，最好其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属；并且/或者(b)其与药物相连。
19.一种组合物，其包含权利要求9至12，17或18中任一项所述的结合分子、抗体或结合片段，权利要求13所述的多核苷酸，权利要求14所述的载体或权利要求15所述的细胞，其中(a)组合物为药物组合物，并且进一步包含药学可接受的载体，还可以进一步包括用于治疗阿尔茨海默病的其他物质，所述其他物质选自小有机分子、抗Abeta抗体及其组合；或者(b)组合物为诊断组合物，并且进一步包含常规用在基于免疫或核酸的诊断方法中的试剂。
全文摘要
提供疾患特异性结合分子和靶的方法，本发明提供了识别疾患相关蛋白新表位的新的特异性结合分子、特别是人抗体及其片段、衍生物和变体，所述疾患相关蛋白来自天然的内源蛋白，但在患者体内以变体形式和／或脱离其正常生理环境普遍存在。另外，描述了包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和筛选治疗诸如阿尔茨海默病的神经疾病的新的结合分子(可以是或可以不是抗体)和靶的方法。
文档编号C12N15/13GK102603893SQ201210046808
公开日2012年7月25日 申请日期2008年1月7日 优先权日2007年1月5日
发明者克里斯托夫·爱瑟兰格, 克里斯托夫·霍克, 凯瑟琳·蒂索, 简·格林, 罗格·尼奇, 马伦·科诺布洛赫 申请人:苏黎世大学