专利名称：具有细胞壁结合神经酰胺类糖脂的细菌疫苗及其应用的制作方法
具有细胞壁结合神经酰胺类糖脂的细菌疫苗及其应用发明背景发明领域本发明一般涉及免疫学领域。
背景技术：
已知分枝杆菌在哺乳动物中引起严重疾病，如结核病、汉森氏病、麻风、肺病类结核、淋巴腺炎、皮肤病或弥散性疾病。全球人口的三分之一感染结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)，尽管卡介苗(BCG)已使用超过75年，每年仍有200万人死于结核病。Hoft DF5Lancet 372:164-175^008)。结核病是目前全球传染病中导致死亡的第二大因素，仅次于 HIV/AIDS。Young DB 等，Journal of Clinical Investigation 118 1255-1265(2008)。一些研究表明有效控制结核分枝杆菌感染需要MHC I类和II类限制性T细胞。 Mogues T等，J Exp Med 193 :271_28(K2001)和Flynn JL等，Proc Natl Acad Sci USA 89 12013-12017(1992)。然而，脂质抗原呈递分子⑶Id缺陷型小鼠并不比野生型小鼠更易感染结核分枝杆菌，表明CDld限制性NKT细胞对于保护性免疫不是绝对必需。Behar SM等， J Exp Med 189 :1973-1980 (1999)。天然杀伤细胞(NKT)代表了表达T-细胞受体和NK-细胞受体的T淋巴细胞亚群，在连接先天性免疫和适应性免疫中发挥作用。Kronenberg M和 Gapin L，Nat Rev Immunol 2:557-568^002)。激活后，NKT细胞在针对不同病原体包括单增李斯特菌(L. monocytogenes)、结核分枝杆菌、硕大利什曼原虫(Leishmania major)的早期和迟发性免疫有显著作用。Kronenberg(2002) ；Behar SM 和 Porcelli SA，Curr Top Microbiol Immunol 314 :215-250(2007) ；Emoto M等，Eur J Immunol 29:650-659(1999)； Ishikawa H 等，Int Immunol 12 :1267-1274(2000)禾Π Ranson T 等，J Immunol 175 1137-1144(2005)。有报导NKT细胞的激活可引起⑶4和⑶8 T细胞应答增强，并诱导树突细胞成熟。Nishimura T 等，Int Immunol 12 :987-994 Q000)和 Silk JD 等，J Clin Invest 114 :1800-1811(2004)。与识别MHC-结合肽的常规T细胞不同，NKT细胞特异性针对MHC I类样蛋白 ⑶Id呈递的脂质抗原。目前已鉴定了一些可由⑶Id呈递激活NKT细胞的糖脂抗原，包括从自源和细菌源性糖脂。Tsuji M Cell Mol Life Sci 63:1889-1898(2006)。含非变异 Va 14-Ja 18重排T细胞受体的NKT细胞(iNKT细胞)经由⑶Id呈递时，对鞘糖脂、a -半乳糖神经酰胺(a GalCer)有反应性。Kronenberg M 和 Gapin L, Nat Rev Immunol 2 557-568(2002) ；Kronenberg M，Annu Rev Immunol 23 :877_90(K2005)。最近的研究显示通过共施用α GalCer作为佐剂激活iNKT细胞，可改善抗疟原虫、杜氏利什曼原虫、单增李斯特菌和 HIV 的疫苗。Gonzalez-Aseguinolaza G等，J Exp Med 195 :617-624(2002) ；Dondji B European Journal of Immunology 38:706-719(2008) ；Huang YX Vaccine 26: 1807-1816(2008)和 Enomoto N 等，FEMS Immunol Med Microbiol 51 :350-362U007)。
作为一种治疗剂，α feilCer可减少小鼠中的疟原虫寄生并延长结核分枝杆 ^ ^ Ife /Jn 的 # 夕舌。Gonz￡ilez_Aseguinol￡iz￡i G 等，Proc Natl Acad Sci USA 97 8461-8466(2000) ；Chackerian A 等，Infection and Immunity 70 :6302-6309(2002) 因此，尽管CDld限制性T细胞对于最佳免疫并不绝对必需，其特异性激活提高了宿主对传染病的抵抗力。对小鼠单次注射afedCer引发血清中的细胞因子动荡，导致IFNY，、IL-12和 IL-4 分泌。Fujii S 等，Immunol Rev 220:183-198(2007)。通过 a GalCer 刺激 CDld 限制性iNKT细胞也可迅速激活NK细胞、树突细胞、B细胞和常规T细胞。Nishimura T等，Int Immunol 12 :987-994(2000) ；Kitamura H 等，J Exp Med 189:1121—1128(1999) ；Fujii S 等，J Exp Med 198:267-279 0003)。iNKT细胞生成大量IFN γ且其生成需要iNKT细胞与DC之间经⑶40-⑶40配体相互作用实现直接接触。Nishimura T等，Int Immunol 12: 987-994(2000).。显示iNKT细胞生成的IFN γ对小鼠肿瘤模式中α feilCer的抗转移效果具有关键作用。Hayakawa Y 等，Eur J Immunol 31 :1720-1727(2001) ；Smyth MJ 等，Blood 99 =1259-1266(2002)。因此，有认为iNKT细胞激活能通过影响早期细胞因子环境调节适应性免疫应答。最近，称为α -C-GalCer的α -GalCer C-糖苷类似物被确定为优势Thl扭曲化合物，其比felCer在小鼠中的抗肿瘤和抗疟疾活性更高。该化合物也在小鼠中诱导更高的 Thl 细胞因子 IL-12 和 IFNy 水平。khmieg J 等，Journal of Experimental Medicine 198 :1631-1641(2003) 已确认这2种细胞因子IL-12禾口 IFNy对于在小鼠和人中控制TB 是必须的。对于在小鼠模型中针对结核病与BCG疫苗一起的佐剂使用很少有研究。一项此类研究报导了当将CpG ODN和BCG疫苗一起使用时，抗结核分枝杆菌的保护提高。Freidag BL等，hfect Immun 68 :2948-2953(2000) 大部分针对α GalCer与抗不同传染病疫苗一起使用的佐剂效果的早期研究分别共施用afeilCer和各疫苗以利用其佐剂活性。 Gonzalez-Aseguinolaza G等(2002) ；Dondji B等(2008) ；Huang YX等(2008)和Enomoto N等0007)。因此，仍需要用于增强对细菌如分枝杆菌、抗原的免疫应答的有效组合物和疫
田ο发明概述本发明涉及包括细菌细胞和神经酰胺类糖脂的经修饰细菌，其中所述神经酰胺类糖脂与细胞壁物理结合。在进一步实施方式中，神经酰胺类糖脂包括糖基神经酰胺或 α-糖基神经酰胺或其类似物。在一种实施方式中，糖基神经酰胺或其类似物包括式I
权利要求
1.一种经修饰细菌，包括细菌细胞和神经酰胺类糖脂，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂与所述细菌细胞物理结合。
2.如权利要求1所述的经修饰细菌，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂包括糖基神经酰胺或其类似物。
3.如权利要求2所述的经修饰细菌，其特征在于，所述糖基神经酰胺或其类似物包括式I:
4.如权利要求3所述的经修饰细菌，其特征在于，所述Rl是-(CH2)22CH3或-(CH2) 24CH3。
5.如权利要求3所述的经修饰细菌，其特征在于，所述R2是-CH(OH)-(CH2)13CH3。
6.如权利要求3所述的经修饰细菌，其特征在于，所述R4是半乳糖基、甘露糖基、岩藻糖基或葡萄糖基。
7.如权利要求1所述的经修饰细菌，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂包括α-半乳糖神经酰胺或其类似物。
8.如权利要求7所述的经修饰细菌，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括式II
9.如权利要求8所述的经修饰细菌，其特征在于，所述R2是-CH(OH)(CH2)xCH3，其中X 是4-13范围内的整数。
10.如权利要求8所述的经修饰细菌，其特征在于，所述Rl选自下组=(CH2)9CH= CH-CH2-CH = CH (CH2) 4CH3、(CH2)8CH = CH-CH2-CH = CH(CH2)4CH3^ (CH2)7CH = CH-CH2-CH = CH (CH2) 4CH3、(CH2)3CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-(CH2) 4CH3、(CH2)3CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-Ql2CH3、(CH2)7CH = CH-CH2-CH = CH = (CH2) 4CH3、(CH2) 7CH = CH-CH = CH (CH2) 5CH3、(CH2) 8CH = CH-CH = CH (CH2) 4CH3、(CH2) 9CH =CH-CH = CH(CH2)5CH3, (CH2)6CH = CH-CH = CH-CH = CH(CH2)4CH3, (CH2)6CH = CH-CH = CH-CH = CH(CH2)4CH3 和(CH2)7CH = CH-CH = CH-CH = CH (CH2) 3CH3。
11.如权利要求10所述的经修饰细菌，其特征在于，所述双键是顺式或反式。
12.如权利要求7所述的经修饰细菌，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括式III
13.如权利要求12所述的经修饰细菌，其特征在于，所述Rl由氧代；羟基；卤素；苯基；-OC (0) R6 ； -0R6 ；-C (0) R6 或 N (R6) 2 取代，其中各R6独立地是卤素、C1-C6烷基、或芳香环，芳香环可选有卤素；羟基；-OC(O) R7 ； -0R7 ； -C (0) R7 或 N (R7) 2 取代，其中各R7独立地是卤素或C1-C6烷基。
14.如权利要求12所述的经修饰细菌，其特征在于，所述Rl选自
15.如权利要求7所述的经修饰细菌，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括(2S, 3S，4R)-1-0- ( α -D-半乳吡喃糖基)-N-廿六醇基_2_氨基_1，3，4-十八烷三醇(KRN7000)或(2S, 3S)-1-0- ( α -D-半乳吡喃糖基)-N-廿六醇基_2_氨基-1，3-十八烷二醇)。
16.如权利要求7所述的经修饰细菌，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括(2S, 3S，4R)-I-CH2- ( α -半乳吡喃糖基)-N-廿六醇基_2_氨基_1，3，4-十八烷三醇(α -C-GalCer)。
17.如权利要求1-16中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂纳入所述细菌细胞的细胞壁。
18.如权利要求1-17中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞选自分枝杆菌细胞、李斯特菌细胞、沙门氏菌细胞、耶尔森氏菌细胞、弗朗西丝氏菌和军团菌细胞。
19.如权利要求18所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是分枝杆菌细胞。
20.如权利要求19所述的经修饰细菌，其特征在于，所述分枝杆菌细胞选自结核分枝杆菌复合群(MTBC)细胞和非结核分枝杆菌(NTM)细胞。
21.如权利要求20所述的经修饰细菌，其特征在于，所述分枝杆菌细胞是MTBC细胞。
22.如权利要求21所述的经修饰细菌，其特征在于，所述MTBC细胞选自结核分枝杆菌细胞、牛分枝杆菌细胞、牛分枝杆菌卡介苗(BCG)细胞、非洲分枝杆菌细胞、卡氏分枝杆菌细胞、山羊分枝杆菌细胞和鳍脚分枝杆菌细胞。
23.如权利要求22所述的经修饰细菌，其特征在于，所述MTBC细胞是结核分枝杆菌细胞。
24.如权利要求22所述的经修饰细菌，其特征在于，所述MTBC细胞是BCG细胞
25.如权利要求20所述的经修饰细菌，其特征在于，所述分枝杆菌细胞是NTM细胞。
26.如权利要求25所述的经修饰细菌，其特征在于，所述NTM细胞是耻垢分枝杆菌细胞。
27.如权利要求116中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是活的、 死的或减毒的。
28.如权利要求27所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是活的。
29.如权利要求27所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是死的。
30.如权利要求27或观所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是减毒的
31.如权利要求1-30中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌提高抗原特异性CD8T细胞对抗原的反应。
32.如权利要求31所述的经修饰细菌，其特征在于，所述抗原是分枝杆菌抗原。
33.如权利要求1-31中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌表达异源抗原。
34.如权利要求33所述的经修饰细菌，其特征在于，所述异源抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或肿瘤特异性抗原。
35.如权利要求33所述的经修饰细菌，其特征在于，所述异源抗原是免疫原性肽。
36.如权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌，其特征在于，所述细菌细胞是重组细菌细胞。
37.一种组合物，包含权利要求1-36中任一项所述的经修饰细菌和药物载体。
38.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述药物载体选自盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油和其组合。
39.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括佐剂。
40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自下组糖脂、细胞因子、趋化因子、诱导细胞因子和趋化因子生成的化合物、生长因子、干扰素、细菌组分、铝基盐、钙基盐、氧化硅、多核苷酸、类毒素、血清蛋白、病毒、病毒来源物质、毒物、毒液、咪唑并喹啉化合物、TLR9激动剂(例如CPG 0DNS)、TLR7/8激动剂(例如咪喹莫特)、泊洛沙姆、阳离子类脂、惰性载体、普流罗尼嵌段聚合物、沉淀形成剂、表面活性物质、巨噬细胞刺激剂、替代途径补体激活剂、非离子表面活性剂、mLT、MF59 、SAF、Ribi 佐剂系统、LPS衍生物(例如单磷酰脂质A (MPL))、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)；细胞壁骨架(CWS)、Det0XTM、QS21、Stimul0nTM、 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、 3-0-脱酰MPL、CpG寡核苷酸、皂苷、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯、和一种以上第二佐剂的组合。
41.一种疫苗组合物，包含权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌或权利要求 35-40中任一项所述的组合物。
42.一种治疗动物疾病的方法，包括给需要所述治疗的动物施用权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌、权利要求35-40中任一项所述的组合物或权利要求41所述的疫苗组合物；其中所述经修饰细菌的施用量足以改变所述疾病的进展。
43.一种预防动物疾病的方法，包括给需要所述预防的动物施用权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌、权利要求35-40中任一项所述的组合物或权利要求41所述的疫苗组合物；其中所述经修饰细菌的施用量足以在所述动物中诱导抗所述疾病的免疫应答。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述免疫应答比未结合所述神经酰胺类糖脂的细菌细胞产生的免疫应答有增强或改变。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病选自病毒性疾病、 细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫病和增生性疾病。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述疾病是细菌性疾病。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疾病是分枝杆菌病。
48.如权利要求42-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病选自下组结核病、 肺病类结核、淋巴腺炎、皮肤病、弥散性疾病、黑死病、肺鼠疫、兔热病、军团病、炭疽、伤寒症发热、副伤寒发热、食源性疾病、李斯特菌病、疟疾、111￥、31￥、朋￥、1 ￥、流感、肝炎(HAV、HBV 和HCV)和癌症。
49.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌病是结核病。
50.一种诱导动物中针对抗原的免疫应答的方法，包括给所述动物施用权利要求1-35 中任一项所述的经修饰细菌、权利要求35-40中任一项所述的组合物或权利要求41所述的疫苗组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述经修饰细菌的施用量足以在所述动物中增强抗原特异性CD8T细胞反应或提高天然杀伤(NKT)细胞活性。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括抗体反应。
53.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括CD8T细胞反应。
54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括CD8T细胞反应和抗体反应。
55.一种调节动物中对BCG的CD8T细胞反应的方法，包括给所述动物施用有效量的权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌、权利要求35-40中任一项所述的组合物或权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述细菌细胞是BCG细胞。
56.如权利要求42-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述施用的途径选自下组 肌肉内、静脉内、气管内、鼻内、经皮肤、皮内、皮下、眼球内、阴道、直肠、腹膜内、肠内、吸入或者2种或2种以上所述途径的组合。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述施用是皮内。
58.一种试剂盒，包括权利要求1-35中任一项所述的经修饰细菌、权利要求35-40中任一项所述的组合物或权利要求41所述的疫苗组合物。
59.如权利要求60所述的试剂盒，其特征在于，所述经修饰细菌是冻干的。
60.如权利要求58或59所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括施用所述经修
61.一种制被神经酰胺类糖脂/分枝杆菌复合物的方法，包括(a)在培养基中培养分枝杆菌细胞和(b)在所述神经酰胺类糖脂纳入所述分枝杆菌细胞的细胞壁的条件下，将神经酰胺类糖脂加入培养基。
62.一种生成针对抗原的疫苗的方法，包括(a)分离权利要求61所述的神经酰胺类糖脂/分枝杆菌复合物和(b)将药物载体加入(a)分离的复合物。
63.如权利要求61或62所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌细胞选自结核分枝杆菌复合群(MTBC)细胞和非结核分枝杆菌(NTM)细胞。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述NTM细胞是耻垢分枝杆菌细胞。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述MTBC细胞选自结核分枝杆菌细胞、牛分枝杆菌细胞、BCG细胞、非洲分枝杆菌细胞、卡氏分枝杆菌细胞、山羊分枝杆菌细胞和鳍脚分枝杆菌细胞。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述MTBC细胞是结核分枝杆菌细胞。
67.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述MTBC细胞是牛分枝杆菌细胞。
68.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述MTBC细胞是BCG细胞。
69.如权利要求61-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌细胞是活的、 死的或减毒的。
70.如权利要求61-69中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂包括糖基神经酰胺或其类似物。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述糖基神经酰胺或其类似物包括式I
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述Rl是-(CH2)22CH3或-(CH2)24CH3。
73.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述R2是-CH(OH)-(CH2)13CH3。
74.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述R4是半乳糖基、甘露糖基、岩藻糖基或葡萄糖基。
75.如权利要求61-69中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经酰胺类糖脂包括 α-半乳糖神经酰胺或其类似物。
76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括Rl是线性或分支的C1-C27烷烃或C2-C27烯烃；或Rl是-C(0H)-R3，其中R3是线性或分支的C1-C26烷烃或C2-C26烯烃；R2是下列(a)-(e)中的一种(a)-CH2(CH2)xCH3,(b)-CH(OH) (CH2)xCH3,(c)-CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,(d)-CH= CH(CH2)xCH3,(e)-CH(OH) (CH2)xCH(CH3) CH2CH3,其中，X是4-17范围内的整数。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述R2是-CH(OH)(CH2)xCH3，其中X是 4-13范围内的整数。
78.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述Rl选自(CH2)9CH= CH-CH2-CH = CH (CH2) 4CH3、(CH2)8CH = CH-CH2-CH = CH(CH2)4CH3^ (CH2)7CH = CH-CH2-CH = CH (CH2) 4CH3、 (CH2)3CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH- (CH2)4CH3^ (CH2)3CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2-CH = CH-CH2CH3、(CH2) 7CH = CH-CH2-CH = CH= (CH2) 4CH3、 (CH2)7CH = CH-CH = CH(CH2)5CH3, (CH2)8CH = CH-CH = CH (CH2) 4CH3、(CH2)9CH = CH-CH =
79.如权利要求78所述的方法，其特征在于，所述双键是顺式或反式。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括式 III
81.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述Rl由氧代；羟基；卤素；苯基；-OC(O) R6 ； -0R6 ； -C (0) R6 或 N (R6) 2 取代，其中各R6独立地卤素、C1-Qg基或芳香环，芳香环可选用卤素；羟基；-OC(O) R7 ；-0R7 ；-C(0)R7 或 N(R7)2 取代，以及其中各R7独立地是卤素或C1-C6烷基。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述Rl选自下组
83.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述α-半乳糖神经酰胺或其类似物包括(2S，3S，4R)-l-0-(a -D-半乳吡喃糖基)_N_廿六醇基_2_氨基-1,3,4-十八烷三醇 (KRN7000)或(2S, 3S)-1-0- ( a -D-半乳吡喃糖基)-N-廿六醇基_2_氨基-1，3-十八烷二醇)。
84.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述a-半乳糖神经酰胺或其类似物包括(25，35，4幻-1-012-((1-半乳吡喃糖基)4-廿六醇基-2-氨基-1，3，4-十八烷三醇 (a -C-GalCer)。
全文摘要
本发明涉及与物理结合了神经酰胺类糖脂物理的细菌细胞相关的组合物和方法。本发明可直接递送神经酰胺类糖脂佐剂到感染细菌疫苗的相同细胞。本发明的组合物和方法用于预防和治疗疾病。
文档编号C12N1/12GK102325875SQ201080008971
公开日2012年1月18日 申请日期2010年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者M·M·文卡塔斯瓦米, S·A·泊赛利 申请人:阿尔伯爱因斯坦医科叶希瓦大学,叶希瓦大学分部