含有作为活性成分的α－糖基神经酰胺的丙型肝炎病毒抑制剂的制作方法

专利名称：含有作为活性成分的α－糖基神经酰胺的丙型肝炎病毒抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人类丙型肝炎病毒的生长抑制剂，其含有用于感染了上述病毒的病人的作为活性成分的α-糖基神经酰胺。
背景技术：
KRN7000已作为衍生自天然海绵动物的age1asphin类物质的衍生物而合成出来(Tetrahedron Lett.，345591-5592，1993；Tetrahedron Lett.，345593-5596，1993；Tetrahedron，502771-2784，1994)，最近发现，KRN7000为在自然杀伤T(NKT)细胞内发现的不可变型T细胞受体(TCR)的配体(Science，2781626-1629，1997；J.Exp.Med.，1881521-1528，1998；J.Exp.Med.，1881529-1534，1998)。据报道，KRN7000所代表的α-糖基神经酰胺(α-GlyCer)为鞘糖脂，其中的亲水糖类，如半乳糖或葡萄糖在α-位与包括脂肪酸和神经鞘氨醇碱的疏水神经酰胺结合，其作为配体通过刺激NKT细胞而显示出有效的抗癌活性(0ncol.Res.，7529-534，1995；Cancer Res.，581202-1207，1998)。α-GlyCer作为糖脂质抗原首先结合至包括树状细胞(DC)的抗原呈递细胞(APC)中，其呈递过程不涉及与抗原呈递(TAP)路径相关的、已知在蛋白质抗原呈递中起重要作用的运输物质，然后通过主要的组织相容性(MHC)抗原类中的Ib型非晶型分子-CD1d表达在APC上。当KRN7000(其已通过CD1d表达在APC上)被NKT细胞膜上的不可变型TCR识别后，NKT细胞被激活。基于此原理，使用与α-GlyCer结合的衍生自单核细胞的人类DC可有效地培养人的NKT细胞(Hum.Immunol.，6010-19，1999)。此外，还报道了白细胞介素-7(IL-7)或IL-5在体内与α-GlyCer协同进行作用可使NKT细胞增生(Hum.Immunol.，61357-365，1999)。
NKT细胞是一种淋巴细胞，并且是独一无二的，因为其既表示TCR又表示自然杀伤(NK)细胞标记物(Annu.Rev.Immunol.，15，535-562，1997；J.Exp.Med.，182，633-638，1995)。一个显著的性质是，在NKT细胞内发现的TCRα链为不可变型链，该α链通过与一个非常受限的β-链类型配对来表达一个极其受限的TCR种类(不可变型TCR)。对于人来说该稳定的TCRα链称为Vα24，对于小鼠来说称为Vα14。这两个种类之间的不可变型TCR显示出高度的相似性。特别地，在被认为是TCR抗原结合部位的中心部分的DCR3领域内，就其中的氨基酸来说，该TCRα显示出85％的非常高的相似性。对于人来说TCRβ链为Vβ11，对于小鼠来说为Vβ8、Vβ7或Vβ2(J.Exp.Med.，1801097，1994；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887518，1991；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896506，1992；J.Exp.Med.，176269，1992)。与之相比，NKR-P1(CK161或NK1.1)作为NK细胞标记物表达在NKT细胞上，但其功能还未解释清楚。NKT细胞可产生作为Th1型细胞因子(由TH1细胞产生的细胞因子(Th1))的干扰素-γ(IFN-γ)和作为Th2型细胞因子(由TH2细胞产生的细胞因子(Th2))的白细胞介素(J.Exp.Med.，1791285-1295，1994；J.Exp.Med.，186109，1997；J.Immunol.，1613271-3281，1998)。这说明NKT细胞与T辅助细胞的分化和调节有很大关系。具体地说，IFN-γ的过量产生会诱使T辅助细胞分化为Th1，而IL-4的过量产生会诱使其分化为Th2。此外，据报道，NKT细胞产生穿孔素和颗粒酶，其对NK细胞类的杀肿瘤活性起重要作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955690-5693，1998；Hum.Immunol.，61357-365，1999)。
KRN7000已知作为NKT细胞的配体(Kawano，T.等，Science 2781626，1997)。更具体地说，KRN7000首先结合至抗原呈递细胞(APC)，如树状细胞(DC)中，然后通过抗原呈递分子-CD1d呈递在DC表面上。在NKT细胞中表达的不可变型T细胞受体(TCR)可识别所谓的由呈递在DC表面上的CD1d和KRN7000组成的免疫络合物。与免疫络合物结合的NKT细胞被激活，并诱导出各种免疫响应。
其中多种糖类β-结合至神经酰胺上的β-半乳糖苷神经酰胺、β-糖基神经酰胺等存在于体内(Svennerholm，L.等，Biochem.Biophys.Acta，280，626，1972；Karlsson，K.-A.等，Biochim.Biophys.Acta，316，317，1973)。已知β-半乳糖苷神经酰胺具有显著的增强免疫的作用和抗肿瘤作用(Morita，M.等，J.Med.Chem.，38，2176，1995)。而且，已知α-半乳糖苷神经酰胺或α-糖基神经酰胺与β-半乳糖苷神经酰胺和β-糖基神经酰胺相比更加有效得多(Motoki，K.等，Biol.Pharm.Bull.，18，1487，1995)。此外，当将具有α-糖基神经酰胺结构的化合物，如α-半乳糖苷神经酰胺或α-糖基神经酰胺给药于体内时，这些化合物显示出辐射防护作用(Motoki，K等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5，2413，1995)，抑制鼠黑素瘤B16肺部转移的作用(Kobayashi，E.等，Oncology Res.，7，529，1995)，和抑制鼠结肠癌细胞(结肠26)或鼠T淋巴腺瘤EL4肝转移的作用(Motoki，K等，the Report of the Annual Meeting of the JapaneseCancer Association，523，1996)。还已知这种化合物可增加血小板和白细胞的数量(Motoki，K.等，Biol.Pharm.Bull.，19，952，1996)。
还提出了用含有KRN7000的α-半乳糖苷神经酰胺或α-糖基神经酰胺作为治疗药剂用于传染性疾病的可行性(WO 93/05055)。事实上，将这种物质给药于转移了人类乙型肝炎病毒(HBV)的小鼠时，小鼠肝内的HBV DNA复制被有效抑制(J.Exp.Med.192921-930，2000)。
虽然上述物质具有抑制HBV的作用，但这种效果并不能直接用于其它类型的病毒。特别地，即使有关该物质的作用已被认知，但由于HBV为DNA病毒，因此仍不能说上述物质还可影响RNA病毒，例如人丙型肝炎病毒(HCV)。
目前，人们推断世界上有100,000,000以上的人被丙型肝炎病毒(HCV)感染。在许多情况下，HCV导致慢性肝疾病，即，丙型慢性肝炎。此外，还有发展为肝硬化、肝细胞癌等的危险。丙型肝炎病毒可粗略地分为6种基因型。在日本、美国和欧洲，约70％的丙肝病人是被基因型1(其还进一步分为基因型1a和1b)所感染。干扰素(IFN)是经临床证实的用于治疗丙型慢性肝炎的治疗药剂。但是，已知基因型1对干扰素治疗具有明显的抵抗性。不利的是，干扰素具有较低速度的慢性响应并需要频繁给药。干扰素疗法会产生副作用，从而缩短进行干扰素治疗的病人的生命(即，视网膜病、甲状腺炎、急性胰腺炎或抑郁)。尤其需要关注的一个严重问题就是由于抑郁而导致的自杀。过去没有可有效地抑制丙型肝炎病毒的药剂。因此，一直希望开发一种抑制丙型肝炎病毒的新药剂，其可有效用于治疗感染HCV性疾病。
专利文献1WO 93/05055非专利文献1Tetrahedron Lett.，345591-5592，1993非专利文献2Tetrahedron Lett.，345593-5596，1993非专利文献3Tetrahedron Lett.，502771-2784，1994非专利文献4Sciernce，2781626-1629，1997非专利文献5J.Exp.Med.，1881521-1528，1998非专利文献6J.Exp.Med.1881529-1534，1998非专利文献70ncol.Res.，7529-534，1995非专利文献8Cancer Res.，581202-1207，1998非专利文献9Hum.Immunol.，6010-19，1999非专利文献10Hum.Immunol.，61357-365，1999非专利文献11Annu.Rev.Immunol.，15，535-562，1997非专利文献12J.Exp.Med.，182，633-638，1995非专利文献13J.Exp.Med.，1801097，1994非专利文献14Proc.NatI.Acad.Sci.USA，887518，1991非专利文献15Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896506，1992
非专利文献16Exp.Med.，176269，1992非专利文献17Exp.Med.，1791285-1295，1994非专利文献18Exp.Med.，186109，1997非专利文献19Immunol.，1613271-3281，1998非专利文献20Proc.Nati.Acad.Sci.USA，955690-5693，1998非专利文献21Hum.Immunol.，61357-365，1999非专利文献22Kawano，T.等，Science 2781626，1997非专利文献23Porcelli，S.等.J Exp Med 1781-16，1993非专利文献24Svennerholm，L.等，Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)非专利文献25Karlsson，K.-A.等，Biochim.Biophys.Acta，316，317(1973)非专利文献26Morita，M等，J.Med.Chem.，38，2176(1995)非专利文献27Motoki，K.等，Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995)非专利文献28Motoki，K.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5，2413(1995)非专利文献29Kobayashi，E.等，Oncology Res.，7，529(1995)非专利文献30Motoki，K.等，the report in the Annual Meeting of theJapanese Cancer Association，523(1996)非专利文献31
Motoki，K.等，Biol.Pharm.Bull.，19，952(1996)非专利文献32Eberl，G.等，J.Immunol 1626410-6419，1999非专利文献33J.Exp.Med.192741-753，2000非专利文献34J.Exp.Med.192921-930，2000非专利文献35Toder，R.等，Chromosome Res.9431-435，2001发明内容本发明的目的是提供一种含有α-糖基神经酰胺，并用于抑制丙型肝炎病毒的治疗药剂。
如上所述，KRN7000在抑制HCV在人体内感染中的作用还存在问题。但是，在希望开发出新的HCV抑制剂的情况下，本发明者还是试验了KRN7000是否具有抑制HCV感染的效果。
通常，由于下列原因，因此主要将感染了HCV的黑猩猩用作试验动物模型来试验药剂的抗-HCV效果。也就是，小鼠并不象感染HBV那样感染HCV，而且制备转移了HBV的小鼠模型也很困难。
在利用HCV-感染的黑猩猩来试验KRN7000的药效的过程中，本发明者发现KRN7000具有抑制HCV的效果。这样就完成了本发明。
本发明的丙型肝炎抑制剂包括作为活性成分的下式(I)代表的化合物或其盐，或其溶剂化物
其中R1表示H或OH；X为7-27的整数；R2为下面取代基(a)-(e)中的任意一种取代基(其中Y为5-17的整数)(a)-CH2(CH2)YCH3；(b)-CH(OH)(CH2)YCH3；(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2；(d)-CH＝CH(CH2)YCH3；或(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；和R3-R9独立地为下面i)-y)中的任意一个所定义的取代基i)当R3、R6和R8独立地表示H时，R4为H、OH、NH2、NHCOCH3或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 R5为OH或下面(E)或(F)所定义的取代基
R7为OH或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 R9为H、CH3、CH2OH，或下面(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基 或ii)当R3、R6和R7独立地为H时，R4为H、OH、NH2、NHCOCH3，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基
R5为OH或下面(E)或(F)所定义的取代基 R8为OH，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 和R9为H、CH3、CH2OH，或下面(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基 合成上述化合物的方法可参考WO 98/44928来进行。
更具体地说，本发明如下面的描述。
(1)一种丙型肝炎病毒抑制剂，其包含作为活性成分的式(I)代表的化合物或其盐，或其溶剂化物。
(2)根据(1)的丙型肝炎病毒抑制剂，其中丙型肝炎病毒为基因型1。
(3)一种用于丙型肝炎的治疗药剂，其包括作为活性成分的根据(1)的式(I)化合物或其盐，或其溶剂化物。
(4)根据(3)的用于丙型肝炎的治疗药剂，其中丙型肝炎为丙型慢性肝炎。
(5)根据(3)的用于丙型肝炎的治疗药剂，其中丙型肝炎为丙型急性肝炎。
(6)用于改善因丙型肝炎而受到有害影响的肝功能的药剂，其包括作为活性成分的根据(1)的式(I)化合物或其盐，或其溶剂化物。
(7)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，R3和R6独立地为H，R4为OH或(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基，R5为OH或(E)或(F)所定义的取代基，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，R9代表CH2OH、CH3、H或(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基。
(8)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，X为21-25的整数，R2为取代基(b)(其中Y为11-15的整数)。
(9)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，X为9-13的整数，R2为取代基(a)(其中Y为11-15的整数)。
(10)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物选自下列(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(6’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯醣基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；(11)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物选自下列
(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；(12)根据(1)-(6)中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物为(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇。
本发明涉及一种丙型肝炎病毒抑制剂，其包括根据本发明的由式(I)代表的化合物作为活性成分。
(1)式(I)代表的化合物在式(I)代表的化合物中，神经酰胺部分中的X优选为11-25的整数。
由R2代表的Y优选为9-17的整数，更优选为11-15的整数。
在式(I)的神经酰胺部分中，优选的X和R2组合的例子为其中X为21-25的整数，并且R2为取代基(b)(其中r为11-15的整数)的化合物，和其中X为9-13的整数，R2为取代基(a)(其中Y为11-15的整数)的化合物。
在式(I)的糖部分中，优选的R3-R9组合的例子为下述化合物其中R3和R6独立地为H，R4为OH或(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基，R5为OH或(E)或(F)所定义的取代基，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，R9为CH2OH、CH3、H或(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基。
其更优选的组合的例子为下述化合物其中R3和R6独立地为H，R4和R5独立地为OH，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，R9为CH2OH或(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基的化合物；和其中R3、R6和R8独立地为H，R4、R5和R7独立地为OH，R9为CH2OH的化合物。
优选的式(I)化合物的例子包括下述化合物化合物，其中X为21-25的整数，R2为取代基(b)(其中，Y为11-15的整数)，R3和R6独立地为H，R4为OH，或基团(A)-(D)中的任一种基团，R5为OH，或基团(E)或(F)，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，和R9为CH2OH，或基团(A’)-(D’)中的任一种基团；化合物，其中X为9-13的整数，R2为取代基(a)(其中，Y为11-15的整数)，R3和R6独立地为H，R4和R5独立地为OH，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，而R9为H、CH3或CH2OH；化合物，其中X为21-25的整数，R2为取代基(b)(其中，Y为11-15的整数)，R3和R6独立地为H，R4和R5独立地为OH，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，而R9为CH2OH，或基团(A’)-(D’)中的任一种基团；
化合物，其中X为21-25的整数，R2为取代基(b)(其中，Y为11-15的整数)，R3、R6和R8独立地为H，R4和R5和R7独立地为OH，而R9为CH2OH。
优选用作根据本发明的药剂的活性成分的化合物组的例子包括(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇(KRN7000)；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-563)；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-563)；(2S，3R)-1-(6’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-571)；(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯醣基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-577)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇(AGL-586)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇(AGL-584)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(S1140B-9)；O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(719-7)；和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D)-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(STL-8)。
已经验证了这些化合物具有促进NKT细胞生长的作用(WO98/44928)特别优选的用作根据本发明的药剂的活性成分的化合物为(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇(KRN7000)。
式(I)代表的化合物可为药学上可接受的非毒性盐。式(I)所代表的化合物的盐例如包括酸加成盐，例如，与无机酸，如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的盐，和与有机酸，如醋酸、丙酸、马来酸、油酸、棕榈酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸、谷氨酸、泛酸、月桂基磺酸、甲磺酸或邻苯二甲酸形成的盐。
式(I)所代表的化合物可为溶剂化物(如，水合物)。
式(I)所代表的化合物可按照合成α-糖基神经酰胺的方法制备。
首先由D-来苏糖合成神经酰胺部分，然后再将糖引入到该神经酰胺部分中。这样就可制得式(I)所代表的化合物。可参考，例如，WO 93/0500、WO 94/2168、WO 94/9020和WO 94/24142中有关合成α-糖基神经酰胺的一般方法。
可采用柱色谱或其它方法从天然存在的物质(如，有机体)中分离和提纯出式(I)所代表的化合物。
根据本发明的药剂可抑制丙型肝炎病毒的生长。因此，其可用作丙型肝炎的治疗药剂。根据本发明的药剂可用作慢性和急性丙型肝炎的治疗药剂。通过将本发明的药剂给药于感染了丙型肝炎病毒的病人，或给药于感染了丙型肝炎，之后出现肝炎症状的病人，可治疗传染性丙型肝炎病毒性疾病或丙型肝炎。在将本发明的药剂持续给药于病人一段时间后可完全根除丙型肝炎病毒。此外，本发明的药剂还可减轻由丙型肝炎病毒感染引起的各种丙型肝炎的症状。在将本发明的药剂持续给药于病人一段时间后可完全根治丙型肝炎。在病毒未被完全清除的情况下，该药剂也可抑制病人体内的病毒生长、抑制丙型肝炎病毒感染的症状、改善肝功能和防止疾病发展为肝硬化或肝癌。
根据治疗方法、给药途径和给药目的，可将式(I)化合物或其盐或其溶剂化物制备成适当的剂型。具体剂型的例子包括下列制剂如，注射液、悬浮剂、乳化剂、软膏、膏状物、片剂、胶囊、颗粒、粉末、药丸、细粒、锭剂、直肠给药试剂、油脂状栓剂和水溶性栓剂。
这些制剂可按照常用技术，使用例如下述药剂可接受的载体来制备。载体的例子为赋形剂，如溶剂(如，水和生理盐水)、膨胀剂和填充物(如，乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、磷酸氢钙、软化硅酸酐和碳酸钙)；辅药，如，增溶剂(如，乙醇和聚山梨醇酯)、粘合剂(如，淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素和阿拉伯树胶)、崩解剂(如，淀粉和羧甲基纤维素钙)、润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石粉和硬化油)、稳定剂(如，乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨糖醇酯、聚乙二醇和聚氧乙烯硬化的蓖麻油)、等渗化剂、润湿剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂和增溶剂；添加剂，如抗氧化剂、防腐剂、调味剂、镇定剂、稳定剂、着色剂和甜味剂。
根据需要，这些制剂还可另外包括甘油、二甲基乙酰胺、乳酸钠(70％)、表面活性剂或碱性物质(如，乙二胺、乙醇胺、碳酸钠、精氨酸、甲葡胺或三氨基甲烷)。
在本发明中，根据给药目的，可通过任何途径给药式(I)所代表的化合物。更具体地说，对于动物，该化合物可腹膜内给药、皮下给药、通过血管静脉或动脉给药，或局部注射给药。对于人，该化合物可静脉给药、动脉给药、局部注射、腹膜内给药、胸内(intrathoracically)给药、皮下给药、肌肉内给药、舌下给药、经皮肤给药或直肠给药。静脉内或皮下给药是最优选的给药途径。
根据病人的状况，可将本发明的治疗药剂的各个活性成分连续或间歇地给药。根据给药途径和病人的各种状况(例如，年龄、体重、性别和病人的敏感性)、给药持续时间或组合，使用的药剂类型、具体的剂量也发生变化。通常，对于静脉内给药，每个成年人每天给药式(I)化合物的剂量优选为约0.001mg-10mg，优选0.05mg-2mg，更优选0.01mg-1mg。式(I)所代表的化合物优选为冻干制剂。优选，在即将给药之前，将该制剂溶解在蒸馏水中进行注射等方式的给药。按给定时间段，例如，每几个小时或几个月进行给药。
通过周期性监测丙型肝炎病毒感染的发生率及其活体滴定度，可对抑制丙型肝炎病毒的效果进行评价。丙型肝炎病毒减少或被根除导致肝炎被治愈，而且使在病人感染丙型肝炎病毒时受到有害影响的肝功能也得到改善。通过测定血清的ALT、AST和LDH可监测肝功能的改善。
本发明进一步涉及一种抑制丙型肝炎病毒的方法，其包括将本发明的药剂给药于感染了丙型肝炎病毒的病人；一种治疗丙型肝炎病毒的方法，其包括将本发明的药剂给药于感染了丙型肝炎病毒的病人；和一种使在感染丙型肝炎病毒时受到有害影响的肝功能得到改善的方法，其包括将本发明的药剂给药于因丙型肝炎病毒感染而使肝功能恶化的病人。此外，本发明还涉及式(I)所代表的化合物在丙型肝炎病毒抑制剂或在用于丙型肝炎的治疗药剂中的用途，以及在制备因丙型肝炎病毒感染而受到有害影响的肝功能的改善药剂中的用途。而且，本发明还包括式(I)所代表的化合物与干扰素或其它抗病毒药剂，如病毒唑(RVB)结合使用的用途。
本说明书包括日本专利申请No.2002-275466的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，该专利申请为本申请的优先权文献。
附图简述

图1显示了在向2只感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩给药KR7000一段时间后，其血液中白细胞总数、嗜中性白细胞数和淋巴细胞数的变化。
图2A显示了在给药KR7000前，FACS化验感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩的NKT细胞所得的结果。
图2B显示了在向2只感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩给药KR7000一段时间后，其NKT细胞数与T细胞数的比例。
图3显示了在向2只感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩给药KR7000一段时间后，其血清中的ALT、AST和LDH水平的变化。
图4显示了在向2只感染了丙型肝炎病毒的黑猩猩给药KR7000后，其丙型肝炎病毒的增加和减少。
图5示意了本发明中所用的代表性α-糖基神经酰胺化合物-KRN7000的合成路径。
图6示意了接着图5所示合成路径之后的合成路径。
图7显示了代表实施例1-3中制备的化合物的化学式。
本发明的最佳实施方式下文中参考下列实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围并不受这些实施例的限制。
化合物的合成、分离和纯化[实施例1](2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇(KRN7000)的合成合成方法如图5和6所示。在图5所示的反应过程中，pyr表示吡啶，BrPPh3(CH2)12CH3表示十三烷三苯基氯化，n-BuLi表示正丁基锂，MsCl表示甲基磺酰氯，BnBr表示苄基溴，1-PrOH表示丙醇。在图6所示的反应过程中，WSC-HCl表示1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，MS4A表示分子筛4A，Hex4NBr表示四己基溴化铵。
(1)化合物G1的合成将经氯化钙干燥的丙酮溶液(3.01)和硫酸(0.5ml)加至D-来苏糖(200g，1.33mol)中，将所得混合物在室温下搅拌18小时。向其中加入分子筛4A粉末(100g)来中和反应溶液，将中和后的溶液通过硅藻土过滤，剩余物再用丙酮洗涤。将滤出液和洗涤溶液合并，并进行减压浓缩，从而获得化合物G1的粗产物(产率240g，95％)。该产物不经进一步纯化直接用在随后的过程中。使用硅胶色谱，以己烷/丙酮(9/1)为洗脱液来纯化分析物。
mp76-78℃。
FDMSm/z 191(M+1)+1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.45(1H，d，J＝1.8Hz)，4.83(1H，dd，J＝3.7，5.5Hz)，4.64(1H，d，J＝6.1Hz)，4.27-4.30(1H，m)，3.90-3.99(2H，m)，1.48(3H，s)，1.32(3H，s)(2)化合物G2的合成将吡啶(10ml)和三苯基甲基氯(39.0)加至168ml含有化合物G1(239g，约1.26mmol)的二氯甲烷溶液中，在32℃下搅拌混合物4小时。向其中滴加乙醇(8ml)，并在室温下搅拌混合物2小时。用氯化铵的饱和水溶液、碳酸氢钠的饱和水溶液和盐水洗涤后，减压浓缩所得物质。将剩余物溶解在乙酸乙酯中，并冷却至0℃进行结晶(产率501g，由D-来苏糖计产率为87％)。
mp174-176℃。
FDMSm/z 432M+1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.49(15H，m)，5.38(1H，d，J＝2.4Hz)，4.75(1H，dd，J＝3.7，6.1Hz)，4.59(1H，d，J＝6.1Hz)，4.31-4.35(1H，m)，3.43(1H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.39(1H，dd，J＝6.7，9.8Hz)，1.29(3H，s)，1.28(3H，s)(3)化合物G3的合成140℃下将1-溴代十三烷和三苯基膦加热至4.5小时，得到十三烷三苯基溴化(962g，1.16mol)。然后将所得物质加至THF中，制得1,500ml溶液。在0℃的氩气氛下，向其中滴加2.5M的正丁基锂己烷(462ml，366mmol)溶液。滴加结束后，搅拌混合物15分钟，再向其中滴加450ml含有化合物G2(250g，579mmol)的THF溶液。搅拌混合物18小时，同时逐渐将温度升至室温。减压浓缩反应溶液，向剩余物中加入1,000ml己烷/甲醇/水混合物(10/7/3)，将所得物质用氯化铵饱和水溶液洗涤。水相用500ml己烷萃取，并将所有有机层合并，之后用无水硫酸镁干燥并减压浓缩。这样，获得化合物G3的粗产物(产率339g，98％)。该产物不经进一步纯化直接用在随后的过程中。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(9/1)为洗脱液纯化分析物。
FDMSm/z 598M+1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.45(15H，m)，5.48-5.59(2H，m)，4.91(0.7H，t，J＝7.3Hz)，4.44(0.3H，t，J＝7.3Hz)，4.26(0.3H，dd，J＝4.3，7.3Hz)，4.21(0.7H，dd，J＝4.3，6.7Hz)，3.75(0.7H，m)，3.69(0.3H，m)，3.24(0.3H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.17(0.7H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.09-3.14[1H，(3.11，dd，J＝4.9，9.2Hz)，H1bE重叠的]，1.75-2.03(2H，m)，1.49(3H，s)，1.39和1.38(3H，各自为单峰)，1.21-1.34(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)(4)化合物G4的合成将吡啶(500ml)加至1,500ml含有化合物G3(338g，约565mmol)的二氯甲烷溶液中，并向其中滴加甲基磺酰氯(49ml，633mmol)，之后在31℃下搅拌24小时。向其中滴加乙醇(40ml)，在室温下搅拌混合物1小时。减压浓缩后，向剩余物中加入1,000ml己烷/甲醇/水的混合物(10/7/3)，并分离所得物质。将水相萃取三次，每次用200ml己烷，将所有有机相合并，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。这样，得到化合物G4的粗产物(产率363g，95％)。该产物不经进一步纯化直接用在随后的过程中。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(9/1)为洗脱液纯化分析物。
FDMSm/z 676M+1H-NMR(500MHz，CDCl3)57.21-7.47(15H，m)，5.41(0.7H，ddd，J＝5.5，9.2，11.0Hz)，5.32(0.7H，bt，J＝11.0Hz)，5.22(0.3H，bdd，J＝9.2，15.0Hz)，5.02(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝15.0Hz)，4.8(0.3H，m)，3.24(0.7H，ddd，J＝3.1，5.5，7.9Hz)，4.73(0.7H，dd，J＝5.5，9.8Hz)，4.64-4.67(0.3H，m)，4.61(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，4.48(0.7H，dd，J＝5.5，7.9Hz)，4.22(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，3.55(0.3H，dd，J＝2.4，11.6Hz)，3.45(0.7H，dd，J＝3.2，11.0Hz)，3.06-3.12[4H，(3.12，s)，(3.11，s)，(3.09，dd，J＝3.1，11.0Hz)]，1.66-1.82(2H，m)，1.47和1.46(3H，各自为单峰)，1.39(3H，s)，1.13-1.35(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.8Hz)(5)化合物G5的合成将甲醇(350ml)加至1,500ml含有化合物G4(362g，约536mmol)的二氯甲烷溶液中，向其中滴加浓盐酸(200ml)，并在室温下搅拌混合物5小时。加入碳酸氢钠来中和反应溶液，并过滤中和后的溶液。减压浓缩滤出液，向剩余物中加入乙酸乙酯，并用食盐水洗涤所得物质。用乙酸乙酯萃取水相，将所有的有机相合并，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。剩余物从己烷中结晶出来(产率161g，由G2计产率为70％)。
mp66-67℃。
FDMSm/z 377(M-H2O)+1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5.86(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝14.7Hz)，5.77(0.7H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝10.4Hz)，5.55(0.3H，br.dd，J＝7.3，14.7Hz)，5.49(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，4.51(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.11(0.3H，bt，J＝7.3Hz)，3.94-4.03(2H，m)，3.67-3.73[1H，(3.70，dd，J＝3.1，6.7Hz)，(3.69，dd，J＝3.1，7.3Hz)]，3.20和3.19(3H，各自为单峰)，2.05-2.22(2H，m)，1.22-1.43(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)
(6)化合物G6的合成将5％硫酸钯-钡(16g)加至780ml含有化合物G5(160g，405mmol)的THF溶液中，用氢气置换反应室中的空气，并在室温下搅拌其中所含物质20小时。用硅藻土过滤反应溶液，并用氯仿/甲醇混合物(1/1)洗涤。将滤出液和洗涤溶液合并，并减压浓缩。剩余物从乙酸乙酯中结晶出来(产率146g，91％)。
23D+12°(c 1，CHCl3/MeOH＝1/1)mp124-126℃。
FDMSm/z 397(M+1)+1H-NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD＝1/1)δ4.93(1H，m，H2)，3.91(1H，dd，J＝6.7，12.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，12.2Hz)，3.54-3.60(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝1.8，8.5Hz)，3.19(3H，s)，1.75-1.83(1H，m)，1.53-1.62(1H，m)，1.21-1.45(24H，m)，0.89(3H，t，J＝6.7Hz)(7)化合物G7的合成将叠氮化钠(47g，730mmol)加至1,000ml含有化合物G6(145g，365mmol)的DMF溶液中，在95℃下搅拌混合物4小时。浓缩反应溶液，向剩余物中加入乙酸乙酯(450ml)，并漂洗所得物质。再用乙酸乙酯萃取水相。将所有的有机相合并，用食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。这样，得到化合物G7的粗产物(产率122g，97％)。该产物不经进一步纯化直接用在随后的过程中(产率126g，95％)。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(100/1)为洗脱液纯化分析物。
23D+16.5°(c 0.5，CHCl3/MeOH＝1/1)mp92-93℃。
FDMSm/z 344(M+1)+1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ3.91(1H，dd，J＝3.7，11.6Hz)，3.75(1H，dd，J＝7.9，11.6Hz)，3.49-3.61(3H，m)，1.50-1.71(2H，m)，1.22-1.46(24H，m)，0.90(3H，t，J＝6.7Hz)(8)化合物G8的合成将吡啶(250ml)和三苯基甲基氯(124g，445mmol)加至750ml含有化合物G7(121g，约352mmol)的二氯甲烷溶液中，并在室温下搅拌混合物16小时。向其中滴加乙醇(30ml)，并在室温下搅拌混合物30分钟。之后，用碳酸氢钠饱和水溶液、氯化铵饱和水溶液和食盐溶液洗涤所得物质，并用无水硫酸镁干燥所得物质，之后再减压浓缩。剩余物用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(10/1)为洗脱液纯化(产率34.4g，以G6计产率为52％)。
23D+11.9°(c 0.9，CHCl3)FDMSm/z 585M+1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.24-7.61(15H，m)，3.62-3.66(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.0，10.4Hz)，1.23-1.56(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)(9)化合物G9的合成将百分之六十的氢化钠(5.5g，约138mmol NaH)加至300ml含有化合物G8(33.5g，57.3mmol)的DMF溶液中，并在室温下搅拌混合物40分钟。将反应溶液冷却至0℃，并向其中滴加苄基溴(15ml，120mmol)。搅拌混合物18小时，同时使其温度逐渐升至室温。向反应溶液中加入冰水(100ml)以结束反应。之后，用乙酸乙酯萃取水相。洗涤萃取物三次，每次都用盐水，并将所有有机相合并，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。这样，得到化合物G9的粗产物(产率42.2g，96％)。该产物不经进一步纯化直接用在随后的过程中。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(100/1)为洗脱液纯化分析物。
23D+9.8°(c 1.0，CHCl3)FDMSm/z 738(M-N2)+1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.07-7.48(25H，m)，4.57(1H，d，J＝11.6Hz)，4.44(1H，d，J＝11.6Hz)，4.41(2H，s)，3.73-3.79(1H，m)，3.46-3.56(2H，m)，3.37(1H，dd，J＝8.6，10.4Hz)，1.20-1.64(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)(10)化合物G10和G11的合成将甲醇(30ml)加至250ml含有化合物G9(41.2g，约54mmol)的1-丙醇溶液中，并向其中进一步加入5％钯-碳(4.1g)和甲酸铵(27.1g，4.3mol)。在室温下搅拌混合物16小时，用乙酸乙酯稀释，然后用硅藻土过滤。减压浓缩滤出液，将其溶解在乙酸乙酯中，并洗涤三次，每次都用碳酸氢钠饱和水溶液和盐水。将所有有机相合并，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。这样，得到化合物G10的粗产物(产率38.9g，98％)。所得化合物G10不经进一步纯化直接用在随后的过程中。
将二十六烷酸(22.4g，56.5mmol)和WS硅藻土酸盐(12.6g，64.6mmol)加至300ml含有化合物G10的二氯甲烷溶液中，加热回流混合物2小时。将混合物温度冷却至室温，并减压浓缩该混合物。向剩余物中加入乙酸乙酯(500ml)，并用0.5M盐酸、盐水溶液、碳酸氢钠饱和水溶液和盐水溶液洗涤所得物质。将所有有机相合并，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。这样，得到化合物G11的粗产物(产率53.2g，88％)。所得化合物G11不经进一步纯化直接用在随后的过程中。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(100/1)为洗脱液纯化分析物。
24D+5.3°(c 0.4，CHCl3)FDMSm/z 118M+1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ 7.20-7.38(25H，m)，5.57(1H，d，J＝9.1Hz)，4.80(1H，d，J＝11.6Hz)，4.48-4.50(3H，m)，4.24-4.32(1H，m)，3.83(1H，dd，J＝3.0，6.7Hz)，3.43-3.51(2H，m，H1a)，3.29(1H，dd，J＝4.3，9.8Hz)，1.92(2H，t，J＝7.3Hz)，1.28-1.60(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)(11)化合物G12的合成将甲醇(36ml)加至180ml含有化合物G11(52.2g，约47mmol)的二氯甲烷溶液中，然后向其中滴加3.0ml 10％盐酸在甲醇中的溶液，并在室温下搅拌混合物2小时。用18g碳酸氢钠粉末中和反应溶液，然后用硅藻土过滤。用二氯甲烷洗涤剩余物。将滤出液和洗涤溶液合并，用盐水溶液洗涤所得物质，并用无水硫酸镁干燥有机相，之后再减压浓缩。通过加热将剩余物溶解在丙酮中，冷却至0℃，通过沉淀作用进行纯化(产率38.6g，由G9计产率为77％)。
24D-29.7°(c 0.7，CHCl3)mp75-76.5℃。
FDMSm/z 876M+1H-NMR(500MHz，CDDCl3)δ7.30-7.47(10H，m)，6.03(1H，d，J＝7.9Hz)，4.72(1H，d，J＝11.6Hz)，4.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.61(1H，d，J＝11.6Hz)，4.45(1H，d，J＝11.6Hz)，4.12-4.17(1H，m)，4.00(1H，dt，Jt＝4.3，Jd＝7.3Hz)，3.67-3.72(2H，m)，3.61(1H，ddd，J＝4.3，8.6，11.6Hz)，1.94-2.05(2H，m)，1.15-1.69(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.1Hz)(12)化合物G13的合成1)将2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖基醋酸酯(79.8g)溶解在甲苯(160ml)和异丙醚(520ml)的混合物中，并将混合物冷却至-10℃-0℃。向其中加入含有2.0当量HBr的异丙醚(2.8mmol/ml，约100ml)。在-10℃-0℃下搅拌混合物约90分钟后，向反应溶液中加入5％的碳酸氢钠水溶液，通过搅拌来中和剩余量的HBr。将其全部量都转移至分液漏斗中以对溶液进行分馏。之后，弃去水层，洗涤剩余物两次，每次用10％的氯化钠水溶液。减压浓缩所得物质，得到2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(GalBr)的糖浆。
2)将DMF(140ml)和250ml GalBr(约137mmol)在甲苯中所形成的溶液按上述顺序加至420ml含有化合物G12(60.0g，68.6mmol)、四己基溴化铵(89.4g，206mmol)和分子筛4A(60g)的甲苯溶液中。室温下搅拌混合物72小时。将甲醇(12ml)加至反应溶液中，并搅拌混合物2小时。溶液经硅藻土过滤后，再用碳酸氢钠饱和水溶液和盐水溶液洗涤，之后用无水硫酸镁干燥，并减压浓缩。向剩余物中加入乙腈，并搅拌所得物质2小时，得到沉淀物。使所得沉淀物减压脱水，得到干燥粉末。使用硅胶色谱，以己烷/乙酸乙酯(8/1)为洗脱液纯化所得物质(产率70.9g，74％)。
24D+18.8°(c 0.9，CHCl3)mp74-75℃。
FDMSm/z 1399(M+1)+1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.37(30H，m)，6.12(1H，d，J＝9.0Hz)，4.91(1H，d，J＝11.6Hz)，4.84(1H，d，J＝3.7Hz)，4.72-4.80(4H，m)，4.35-4.65(7H，m)，4.12-4.18(1H，m)，3.99-4.05(2H，m)，3.84-3.93(4H，m)，3.73(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.47-3.51(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.1，9.1Hz)，1.87-1.99(2H，m)，1.18-1.70(72H，m)，0.88(6H，t，J＝7.4Hz)(13)化合物KRN7000的合成将化合物G13(60.0g，42.9mmol)加至乙醇(960ml)中以使其悬浮，并向其中加入含20％氢氧化钯(6.0g)的乙醇悬浮液。向其中进-步加入氢源，即，4-甲基环己烯(120ml，93.5mmol)，加热回流混合物4小时，过滤除去催化剂。剩余物用热乙醇洗涤。将滤出液放置在室温下，从而得到白色沉淀。过滤所得沉淀，然后减压脱水。将所得粉末悬浮在3.51乙醇/水(92/8)中，边搅拌边加热使其溶解，并将其放置在室温下进行沉淀。过滤该沉淀，并使过滤所得的滤饼减压脱水，得到白色粉末(产率35.0g，95％)。
24D+43.6°(c 1.0，吡啶)mp189.5-190.5℃。
负FDMSm/z 857(M-H)-IR(cm-1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，10701H-NMR(500MHz，C5D5N)δ8.47(1H，d，J＝8.5Hz)，5.58(1H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，m)，4.63-4.70(2H，m)，4.56(1H，m)，4.52(1H，t，J＝6.1Hz)，4.37-4.47(4H，m)，4.33(2H，m)，2.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25-2.34(1H，m)，1.87-1.97(2H，m)，1.78-1.85(2H，m)，1.62-1.72(1H，m)，1.26-1.45(66H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)13C-NMR(125MHz，C5D5N)δ173.2(s)，101.5(d)，76.7(d)，73.0(d)，72.5(d)，71.6(d)，71.0(d)，70.3(d)，68.7(t)，62.7(t)，51.4(d)，36.8(t)，34.4(t)，32.1(t)，30.4(t)，30.2(t)，30.03(t)，30.00(t)，29.93(t)，29.87(t)，29.81(t)，29.76(t)，29.6(t)，26.5(t)，26.4(t)，22.9(t)，14.3(q)[实施例2]O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(S1140B-9)的分离和纯化在日本冲绳Kume岛周围的海域表面下15-25米处选择天然海绵动物试样，并将其冻干以获得粉末。用氯仿和甲醇的混合溶液萃取所得的粉末(447.1g)，并减压浓缩萃取物以获得51.28g萃取物。借助乙酸乙酯和水来分馏该萃取物。用无水硫酸钠干燥上层和中间层，并将其减压浓缩以分别获得18.37g和9.44g馏分。将由上层得到的馏分与借助于10％甲醇水溶液和正己烷分馏得到的醇层，以及从中间层获得的馏分合并，并浓缩所得物质。
之后，重复进行硅胶色谱分离和正常相TLC分离，这样，得到了单一的活性组分(169.9mg)。使用0DS-AM柱(YMC，250mm×20mm(内径)，甲醇9.0ml/分钟)，通过反相HPLC(保留时间30.3分钟)进一步纯化该活性组分，得到纯的目标化合物(S1140B-9)(产率10.2mg)。目标化合物的分离和纯化可参考F.Cafieri等，LiebigsAnn.Chem.1995，1477-1481页来进行。
负FABMSm/z 1007[(M-H)-]IR1H-NMR(500MHz，C5D5N，24℃)δ(ppm)8.55(1H，d，J＝9.2Hz，NH)，5.60(1H，d，J＝3.7Hz，H1”)，5.57(1H，d，J＝3.7Hz，H1”)，5.13(1H，m，H2)，4.75(1H，dd，J＝3.7，10.4Hz，H2”)，4.62(2H，m)，4.54(4H，m)，4.25-4.47(10H，m)，2.17(2H，m)，1.99(1H，m)，1.87(2H，m)，1.75(1H，m)，1.65(2H，m)，1.12-1.49(60H，m)，0.85(6H，m，端甲基)13C-NMR(125MHz，C5D5N，45℃)δ(ppm)175.5(s，C1’)，99.5(d，C1)，98.6(d，C1”)，76.7(d，C2”)，76.0(d，C3)，72.8(d，C4)，72.6(d，C5”)，72.6(d C4”)，72.5(d，C2)，71.3(d，C3)，71.0(d)，70.8(d)，70.5(d，C2)，69.7(d，C3”)，68.6(t，C1)，62.7(t)，62.5(t)，51.2(t，C2)，39.4(t)，35.6(t)，33.7(t)，32.2(t)，30.5(t)，30.3(t)，30.1(t)，30.0(t)，29.7(t)，29.6(t)，26.7(t)，26.0(t)，23.0(t)，22.9(t)，14.3(q，端甲基)[实施例3]根据引用的文献中所描述的各种化合物的合成方法来合成下列化合物(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-517)(WO 93/5055)；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-563)(WO 94/9020)；(2S，3R)-1-(6’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-571)(WO 94/9020)；(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯醣基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇(AGL-577)(WO 94/9020)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇(AGL-586)(WO 94/24142)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-0-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇(AGL-584)(WO 94/24142)；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(719-7)(WO 94/24142)；O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇(STL-8)(WO 94/24142)；下表1给出了对应于实施例中所述化合物的式(I)化合物。
表1式(I)所代表的化合物与实施例中所述化合物的对应关系
药理试验KRN7000对持久感染丙型肝炎病毒的黑猩猩的药效使用式(I)代表的化合物(KRN7000)作为根据本发明的糖苷化合物的代表例来进行下列试验。
黑猩猩是唯一可被丙型肝炎病毒持久感染的试验动物。因此，从黑猩猩提供机构(Kumamoto Primates公园，Sanwa Kagaku KenkyushoCO.，Ltd.)中选择2只黑猩猩用于本实验，在该机构中携带丙型肝炎病毒的黑猩猩已被人工饲养和繁殖了很长一段时间。实验考核委员会(Experiment Review Board)已提前就该实验的道德性和实验内容进行了考察并给予了批准，而且在实验过程中尽可能地减少对黑猩猩造成的痛苦。在下文中将实验中使用的2只黑猩猩分别称作动物No.C33(持久感染HCV(1a)的感染时间22年)和动物No.C54(持久感染HCV(1b)的感染时间20年)。
在适应约1个月后，间隔28天(第0天和第28天)给动物静脉用药KRN7000两次，给药速率为10μg/kg。为了获得用于验证黑猩猩对KRN7000的响应的试样和KRN7000对慢性HCV感染的药效，每次给药前后都要抽取血液。使用自动血细胞计数器Sysmex K4500(Sysmex公司)测定白细胞总数。将白细胞全部涂覆在脱脂载片上，固定，用Diff-Quick(International Reagents Corp.)染色以确定白细胞的百分数，显微镜检测为200个白细胞。用白细胞总数乘以所得值则计算出嗜中性白细胞和淋巴细胞数量。T细胞中的NKT细胞百分数按下述方式确定用以不同荧光染料标记的抗-人类TCR Vα24抗体(BeakmanCoulter)、KRN7000(α-GlaCer)-结合的人类CD1d四聚物和抗-人类CD3抗体(Becton Dickinson日本)对全部血液进行染色；用FACS细胞溶解溶液(Becton Dickinson日本)溶解全部经染色的血液；将其固定；然后用FACS Calibur(Becton Dickinson日本)确定NKT细胞的比例。对于抗-人类TCR Vα24抗体、四聚物和抗-人类CD3抗体都有响应的细胞被确定为黑猩猩的NKT细胞。使用自动分析仪分析血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。利用RT-PCR(使用AMPLICORGT HCV监测器(RocheDiagnostics))和分枝DNA(bDNA)探针分析(使用Quantiplex HCV-RNA2(Bayer Corporation))来分析血清HCV-RNA水平。利用液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)来分析血清KRN7000水平。
图1显示了给药前后白细胞总数、嗜中性白细胞数和淋巴细胞数的变化。在给药的两个阶段中，2只黑猩猩的嗜中性白细胞数均在6小时后升高。在许多情况下，白细胞总数暂时升高，这种升高反映了嗜中性白细数的变化。在给药6小时后淋巴细胞数下降，但也有一些例外情况。
图2A为使用激发荧光细胞分离器(FACS)，对存在于黑猩猩细胞群体中的四聚体-染色的和TCR Vα24-阳性的NKT细胞进行分析所得的结果，并且该NKT细胞存在于以CD 3阳性细胞门控的细胞群体中。图2B显示了在给药KRN7000前后NKT细胞数的变化。在对2只黑猩猩两次给药后的当天并未检测到NKT细胞。对于试验动物No.C54，在给药KRN7000后，NKT细胞在消失后，又逐渐显示出恢复的趋势。在给药KRN7000后，NKT细胞的迅速消失表明经KRN7000刺激使NKT细胞激活后，立即出现细胞死亡。据推断，各种类型的细胞因子从激活的NKT细胞中释放出来。
图3显示了在给药KRN7000前后血清ALT、AST和LDH的活性水平，其可用于肝功能障碍的临床指示。这些水平暂时性和缓和地升高，对于2只黑猩猩的两个给药阶段来说，均在给药1天或3天后达到峰值。此后，这些值又返回到给药前的水平。
图4显示了由RT-PCR或bDNA技术分析所得的，在给药前后血清HCV-RNA水平的变化。在两个阶段中，在给药KRN7000 1天或3天后，2只黑猩猩的血清HCV-RNA水平均明显降低。在第二次给药(第28天)时，HCV-RNA水平比第一次给药(第0天)更加持续地降低。
表2显示了在给药KRN7000前后，血清KRN7000水平的分析结果。在2只黑猩猩的两个给药阶段中，均在给药KRN7000 15分钟后检测到最大的KRN7000水平。这说明给药的KRN7000实际上在体内迁移。
尺度 150mm×2.1mm(长度，内径)4.3流动相水相 A于水中0.1％HCOOH有机相 CACN梯度条件

实施例29-TRI 50B对血小板促凝血活性的抑制当加入用凝血酶预处理的血小板时，由单独的凝血酶、单独的胶原或凝血酶与胶原的混合物所引起的，在存在因子Va的情况中，可观测到血小板促凝血活性随因子Xa对凝血酶原的激活速度而增加。这种性质是由于血小板表面上阴离子磷脂的增加及伴随的微泡从表面释放所致。这是一个基本的生理学反应，其血小板产生促凝血活性能力下降的人(Scott综合征)示出出血倾向加重。
方法洗涤的血小板用1.15nM凝血酶，23μg/ml胶原或者两种物质的混合物在相同浓度在37℃处理。在加入激活物前1分钟或在与激活物温育后立即加入TRI 50b。如前述确定血小板促凝血活性(Goodwin C A et al，Biochem J.1995 8，30815-21)。
TRI 50b被证实是血小板促凝血活性的强力抑制剂，其IC50如下所概括。
表2TRI 50b对由多种激动剂诱导的血小板促凝血活性的影响表权利要求
1.一种丙型肝炎抑制剂，其包括作为活性成分的下式(I)代表的化合物或其盐或其溶剂化物 其中R1表示H或OH；X为7-27的整数；R2为下面取代基(a)-(e)中的任意一种取代基(其中Y为5-17的整数)(a)-CH2(CH2)YCH3；(b)-CH(OH)(CH2)YCH3；(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2；(d)-CH＝CH(CH2)YCH3；或(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；和R3-R9独立地为下面i)-v)中任意一个所定义的取代基i)当R3、R6和R8独立地表示H时，R4为H、OH、NH2、NHCOCH3，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 R5为OH或下面(E)或(F)所定义的取代基 R7为OH，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 R9为H、CH3、CH2OH，或下面(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基 或ii)当R3、R6和R7独立地为H时，R4为H、OH、NH2、NHCOCH3，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 R5为OH，或下面(E)或(F)所定义的取代基 R8为OH，或下面(A)-(D)中的任意一个所定义的取代基 和R9为H、CH3、CH2OH，或下面(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基
2.根据权利要求1的丙型肝炎病毒抑制剂，其中丙型肝炎病毒为基因型1。
3.一种用于丙型肝炎的治疗药剂，其包括作为活性成分的根据权利要求1的式(I)化合物或其盐，或其溶剂化物。
4.根据权利要求3的用于丙型肝炎的治疗药剂，其中丙型肝炎为丙型慢性肝炎。
5.根据权利要求3的用于丙型肝炎的治疗药剂，其中丙型肝炎为丙型急性肝炎。
6.一种用于改善因丙型肝炎而受到有害影响的肝功能的药剂，其包括作为活性成分的根据权利要求1的式(I)化合物或其盐，或其溶剂化物。
7.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，R3和R6独立地为H，R4为OH或(A)-(D)任意一个所定义的取代基，R5为OH或(E)或(F)所定义的取代基，R7和R8独立地为H或OH，条件是R7和R8不同时代表相同的基团，R9代表CH2OH、CH3、H或(A’)-(D’)中的任意一个所定义的取代基。
8.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，X为21-25的整数，R2为取代基(b)(其中Y为11-15的整数)。
9.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，在式(I)代表的化合物中，X为9-13的整数，R2为取代基(a)(其中Y为11-15的整数)。
10.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物选自下列(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(6’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯醣基氧基)-2-十四烷酰氨基-十八烷-3-醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；
11.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物选自下列(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-十八烷-1，3，4-三醇；O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-十八烷-1，3，4-三醇；
12.根据权利要求1-6中任意一项的药剂，其中，式(I)代表的化合物为(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰氨基-十八烷-3，4-二醇。
全文摘要
本发明提供一种人类丙型肝炎病毒的生长抑制剂，其含有用于感染了上述病毒的病人的作为活性成分的α－糖基神经酰胺。该丙型肝炎病毒抑制剂包括作为活性成分的式(I)所代表的化合物或其盐，或其溶剂化物。
文档编号A61P31/00GK1681519SQ0382244
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月18日 优先权日2002年9月20日
发明者芹泽功, 牛田和夫, 西信介 申请人:麒麟麦酒株式会社