专利名称：重型肝炎相关基因hfg12、hFas和hTNFR1 microRNA腺病毒表达质粒的构建方法及其药学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建一组基因生物制剂，即构建重型肝炎相关的人 fgl2 ( Human Fibrinogen-like protein 2, hfgl2)凝血酵原酶、Fas 和肺瘤坏死因子受体I (tumor necrosis f actor, TNFR1 )基因的 microRNA腺病毒表达质粒，在重型肝炎中联合应用三种质粒进行治 疗，验证其药学用途。
背景技术：
由于病毒性肝炎发病率高、危害性大，已成为严重影响人民健康 与生活水平、制约经济发展的重要疾病。迄今为止，国际上对于重型 肝炎尚无确定有效的治疗方法，探索重型肝炎的发病机制和防治方法 是应用基础和临床研究领域的重要课题。
用鼠3型肝炎病毒(mouse h印atitis virus-3, MHV-3 )感染不 同种系近亲繁殖小鼠，我们已成功建立了类似人类各种不同临床类型 的肝炎，包括暴发型肝炎、慢性肝炎及临床健康病毒携带者(专利申 请号02115980. 7 ); MHV-3诱导产生的鼠fgl2 (mfgl2)凝血酶原酶(纤 维介素)基因在鼠病变肝组织中选择性高度表达，其基因表达水平与 肝组织纤维蛋白沉积及广泛肝细胞坏死密切相关；MHV-3感染小鼠接 受鼠fg12凝血酶原酶中和抗体注射后可减轻肝脏疾病严重程度并显 著降低死亡率。以上结果表明，鼠fg12凝血酶原酶在鼠暴发型肝炎 的发病过程中起重要作用。在上述研究的基础上，我们进一步研究发
现重症乙型肝炎病人肝脏组织的枯否氏细胞、血管内皮细胞和坏死、
纤维化区域发现人fgl2 (hfgl2)凝血酶原酶高度表达，fgl2在病毒性 肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏 死，表明人fgl2凝血酶原酶在人病毒性肝炎的恶化进展中起着关键 性的作用。
重型肝炎的肝细胞死亡包括细胞坏死和细胞凋亡。迅速发生的凋 亡是引发暴发性肝炎的重要机制之一。Fas基因广泛表达于人体组织 中，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)，并被命名为CD95。 Fas/FasL通过介导细胞凋亡，在感染性疾病、自身免疫性疾病和肺 瘤的发生中起重要的作用，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性 肝病、急慢性肝衰竭和移植性排斥反应等造成肝组织细胞炎症损伤的 重要环节。肝细胞对Fas介导的凋亡非常敏感。文献才艮导，病毒抗原 激活肝细胞表达Fas,局部大量浸润的CTL表达FasL，引起肝细胞凋 亡，肝细胞Fas/FasL表达程度与病变活动性一致，Fas介导的肝细 胞凋亡在肝损伤中起非常重要的作用。
肺瘤坏死因子(TNF)包括TNF cx和TNF p ,其中TNFoc主要是由 活化的单核/巨噬细胞分泌，是具有广泛的生物学活性的多肽调节因 子，在内毒素性休克、炎症、免疫调节、细胞毒性和抗病毒活动中起 着重要作用。TNFcx诱导的各种细胞反应是通过细胞表面两种特异性 受体而产生的，即55KD的肿瘤坏死因子受体I (TNFR I )和75KD的 肿瘤坏死因子受体II ( TNFR II )。 TNF oc的许多生物学效应包括细胞凋 亡都是通过TNFR I产生的，而TNFRII则起着辅助信号转导的作用。 TNFR I的高表达所致的肝细胞凋亡在人类重型肝炎的发生发展中起
着重要作用。
临床上多种病因可致重型肝炎，其发病凶险，患者短期内可出现
大面积肝细胞死亡，目前缺乏特异有效的治疗手段。研究表明Fas、 TNFR I系统介导的肝细胞凋亡与重型肝炎的肝损伤有关，抗原特异性 细胞毒性T淋巴细胞大量激活并高度集中于患者肝脏，通过Fas/FasL 或TNFa/TNFR I诱导细胞凋亡，进而杀伤肝细胞。hfgl2凝血酶原酶 在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和微血管内微循环障碍，导致 肝细胞坏死。上述研究表明人fgl2凝血酶原酶、Fas/FasL和TNFoc /TNFR I系统在人重型肝炎的恶化进展中起着关键性的作用。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指导入特异性针对目标基 因的同源双嗜连RNA (double-strain RNA， dsRNA),-秀导产生的沉默复 合体(RISC)将目标mRNA降解，从而引起目标基因不表达或减效表 达。MicroRNA是由机体内源基因转录的约70nt的发夹状结构前体 (pre-microRNA)被Dicer酶切割后产生的约22nt的非编码单链核 苷酸片段，可与目的基因mRNA的非翻译区结合，抑制mRNA的翻译而 不影响其稳定性，也可以RISC样降解与之完全互补的靶RNA。 microRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优 点，为基因调控的研究和基因治疗的发展带来了新的视角。国际上大
量研究表明其基因表达干预效果优于反义技术，更具临床应用价值。 应用腺病毒载体有如下优点l.宿主范围广，对人致病性低；2.可在 增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；3.不整合到染色体中，无插 入致突变性；4.与人类基因同源；5.能有效进行增殖，滴度高；6.能
同时表达多个基因。发明人构建了 hf g 12 、 hFas和h頂FRl基因的miRNA 表达质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果证明了hfgU、 hFas和hTNFRl基因的miRNA表达质粒对相应基因有特异性地抑制作 用，表明它们对病毒诱导的重型肝炎的治疗具有潜在的临床应用价值。
发明内容
本发明基于重型肝炎暂无确定有效的治疗方法，发明了一种用 于治疗多种病因诱导的重型肝炎的基因药物。发明人构建了一组新的 生物制剂一hfg12凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒， 用以抑制重型肝炎相关的hfgl2 ;疑血酶原酶、hFas和hTNFRl的表达， 阻止肝细胞死亡和异常凋亡，可望在临床上提高重型肝炎患者的存活 率和生存质量。所以，本发明的第一个目的是提供构建hfgl2凝血酶 原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒的方法；本发明的第二个目 的是应用hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒特异 性地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的表达，并验证其 药学用途。我们通过细胞水平实验，证实hfgl2凝血酶原酶、hFas 和hTNFRl的miRNA pcDNA表达质粒特异性地抑制细胞系中相应目的 基因的表达。
为了实现本发明的目的，发明人设计重型肝炎相关基因hfgl2、 hFas和hTNFRl的microRNA腺病毒表达质粒的构建方法，在于采 用pAd/CMV/V5-DEST载体和hfg12、 hFas、 hTNFRl的pcDNA表达 质粒通过Gateway技术，构建pAd-hfg12、 pAd-hFas、 pAd-hTNFRl 。 本发明所述的pcDNA表达质粒的构建是将产生hfgl2凝血酶原
酶、hFas和hTNFRl的miRNA的双链寡核苷酸分别插入microRNA 的表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中。
本发明所述的寡核甘酸如下
产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTG
ACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA画3'
产生hFas的miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTG
ACTGACTCTCATGACTCCAACCTTA-3'
产生hTNFRl的miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTG
ACTGACTGTGGGAACGACACCTGAA國3'。
本发明所述的pcDNA表达质粒，它们保藏的培养物名称为大 肠杆菌ToplO/phfgl2-miRNA/大肠杆菌ToplO/phTNFRl-miRNA/大肠 杆菌ToplO/phFas-miRNA,已于2007年11月30日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO: 207188 /CCTCC NO: M207画CCTCC NO: M207187。
下面发明人进一步展现本发明表达质粒构建的具体步骤是
一、pcDNA表达质粒的构建
构建表达hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA pcDNA表
达质粒。
1.利用Invitrogen公司miRNA设计软件获得针对hfgl2凝血酶 原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA模板，合成miRNA模板单链。
2. 将退火的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA 模板双链插入miRNA的表达载体pcDNA 6. 2-GW/ EmGFP-miR。
3. 测序筛选未发生突变的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl 基因的miRNA表达质粒。
二、 miRNA pcDNA表达质粒的细胞水平试马全
分别4全测hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒 特异性地抑制细胞系中hf g 12凝血酶原酶、hFa s和hTNFR 1基因表达 的效果。采用real-time PCR和western-blot方法，乂人基因水平和 蛋白水平验证hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的microRNA表达 质粒分别特异有效地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因在 293T细胞中的表达。
三、 miRNA腺病毒表达质粒的构建
利用Gateway技术，分别将hfgl2、 hFas和hTNFRl的miRNA pcDNA 表达质粒和pAd/CMV/V5-DEST载体重组成pAd-hfg12、 pAd-hFas、 pAd-hTNFRl腺病毒表达质粒。测序筛选未发生突变的pAd-hfgl2、 pAd-hFas、 pAd-hTNFRl 4泉病毒表达质粒。
图1是本发明实时荧光定量PCR检测hFas-miRNA的干扰效果图 图中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；
2. 阳性对照组H又转染pcDNA3. 0-Fas );
3. 非相关对照组(pcDNA3. 0—Fas+ irrelevant miRNA);
4. 实验组(pcDNA3. 0_Fas+hFas-miRNAl);
5. 实验组(pcDNA3. 0-Fas+hFas-miRNA2 ); 6.实验组(pcDNA3. 0-Fas+hFas-miRNA3 )。 图2是本发明western-blot检测hFas-miRNA的干扰效果图 图中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；
2. 阳性对照组(仅转染pcDNA3. O-Fas );
3. 非相关^f照组(pcDNA3. 0-Fas+ irrelevant miRNA);
4. 实验组(pc腿3. O-Fas+hFas-miRNAl );
5. 实'睑组(pcDNA3. 0-Fas+hFas-miRNA2 );
6. 实验组(pc腿3. 0-Fas+hFas-miRNA3 )。
图3是本发明实时荧光定量PCR检测hfgl2-miRNA的干扰效果
图
图中，1: pcDNA3. 1—hfgl2;
2: phfgl2-mi醒l+PcDNA3. 1-hfgl2;
3: phfgl2-miRNA2+Pc腿3. l-hfgl2;
4: phfgl2-miRNA3+Pc腿3. 1-hfgl2;
5: irrelevant miRNA+Pc腿3. 1-hfgl2;
6:blank control。 图4是本发明western-blot检测hfgl2-miRNA的干扰效果图 图中，M: Marker, B: Blank;
1: phfgl2-mi腿l+pc腿3. 1-hfgl2;
2: phfgl2-miRNA2+pcDNA3. 1-hfgl2;
3: phfgl2-miRNA3+pcDNA3. 1-hfgl2;
4: irrelevant miRNA+pc腿3. l-hfgl2;
5: pc腿3. 1—hfgl2。
图5是本发明实时荧光定量PCR检测hTNFRl-miRNA的干扰效果
图
图中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；
2. 阳性对照组H又转染pcDNA3. 1-TNFR1 );
3. 非相关对照组(pcDNA3. 1-TNFR1+ irrelevant miRNA);
4. 实验组(pc腿3. O-Fas十hTNFRl-miRNA 1 );
5. 实验组(pcDNA3,0_Fas+ hTNFRl-miRNA 2);
6. 实验组(pcDNA3. 0-Fas+ hTNFRl-miRNA 3)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。 本发明构建了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达
质粒，并在细胞水平证实其干扰效应，包括以下步骤(以构建
hFas-microRNA表达质并立为例)
一、 pcDNA表达载体的构建
构建hFas-miRNA表达质粒根据PubMed上hFas c腿序列,利 用Invitrogen公司miRNA设计软件设计、合成3对互补寡核苷酸单 链。按照分子克隆操作过程，将dsOligo插入microRNA的表达载体 pcDNA 6. 2-GW/ EmGFP-miR,构建3个hFas-miRNA质粒p-hFasmi-RNAl、 p-hFasmiRNA2和p-hFasmiRNA3。测序筛选未发生突变的hFas 基因的miRNA表达质粒。
二、 miRNA pcDNA表达质粒的细胞水平试马全研究
microRNA表达体系在导入人体后是否能特异性结合到耙基因并 有效表达，目前国际上尚无能够提供直接证据的相关实验方法，只能
通过体外干预试验来间接反映上述生物制剂的干预效果。发明人构建
了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒，并对其进 行细胞水平的实验，过程如下(以hFas-miRNA表达质粒体外抑制Fas 基因在293T细胞中的表达为例.) 材料
miRNA表达质粒p-hFasmiRNAl、p-hFasmiRNA2和p-hFasmiRNA3， 能够表达hFas-miRNA，用于抑制hFas基因的表达。 非相关对照质粒。
pcDNA3. 0-hFas:hFas的真核基因表达载体，可通过转染导入 Fas基因使其在细胞系中外源性表达。 293T细胞人胚肾细胞。. 方法
^f吏用lipofectamine2000将p-hFasmiRNAl、 p-hFasmiRNA2和 p-hFasmiRNA3分别与pcDNA3. O-hFas共转染293T细胞，作为试验组； 不转染任何质粒作为空白对照组；另仅转染pcDNA3. 0-hFas作为阳性 对照组；共转染非相关对照和pcDNA3. Q-hFas作为非相关对照组。转 染后48h提取细胞RNA， real-time PCR检测Fas基因mRNA的表达情 况。裂解细胞提取蛋白，western-blot检测Fas蛋白的表达情况。
结果
real-time PCR 和western-blot 4企测到 293T 细胞内 p-hFasmiRNAl、 p-hFasmiRNA2和p-hFasmiRNA3在基因水平(附图1 ) 和蛋白水平对hFas的表达均具有特异性抑制作用(附图2 )。
系列体外试验均表明本发明涉及的新的生物制剂hfgl2凝血酶
原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒在细胞水平可有效地干预相 应目的基因的表达(附图3、 4、 5)。在转染293T细胞系48小时后， p-hfgl2raiRNA对hfgl2、 p-hFasmiRNA对hFas、 p- hTNFRI miRNA对 hTNFRI在RNA水平上的抑制效率分别达到89. 3°/。、 87. 5%和80°/。。联 合使用miRNA表达质粒也显示了相似的很好的干预效果。本项发明对 于重型肝炎的治疗，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延长移植 物存活时间等方面具有深远而重大的药学意义。 三、miRNA腺病毒表达质粒的构建
利用Gateway技术，分别将hfgl2、hFas和hTNFRI的miRNA pcDNA 表达质粒和pAd/CMV/V5-DEST载体重组成pAd-hfgl2、 pAd-hFas、 pAd-hTNFRl腺病毒表达质粒。测序筛选未发生突变的pAd-hfgl2、 pAd-hFas、 pAd-hTNFRI月泉病毒表达质并立。
<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120>—歪型肝炎相关基因hfgl2、 hFas和hTNFRl microRNA的腺病毒表达质粒构建方法及其药学
用途
<141> 2008-07-08 <160> 1 <210> 1 <211>64 <212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
〈222〉(1)…(64) <400> 3
产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTG
ACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA -3'
产生hFas的miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTAAGTTGG AG ATTCATGAG AGTTTTGGCC ACTG
ACTGACTCTCATGACTCCAACCTTA-3'
产生hTNFRl的miRNA的单链寡核苷酸序列为
5'- TGCTGTTCAGGTGTCG ATTTCCCACAGTTTTGGCC ACTG ACTGACTGTGGGAACGACACCTGAA-3'
权利要求
1.重型肝炎相关基因hfgl2、hFas和hTNFR1的microRNA腺病毒表达质粒的构建方法，其特征在于采用pAd/CMV/V5-DEST载体和hfgl2、hFas、hTNFR1的pcDNA表达质粒通过Gateway技术，构建pAd-hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFR1。
2. 按权利要求1所述的重型肝炎相关基因hfgl2、hFas和hTNFRl microRNA腺病毒表达质粒的构建方法，其特征在于所述的pcDNA 表达质粒的构建是将产生hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的 miRNA的双链寡核苷酸分别插入microRNA的表达载体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中。
3. 按权利要求2所述的重型肝炎相关基因hfgl2、hFas和hTNFRl microRNA腺病毒表达质粒的构建方法，其特征在于所述的寡核甘酸 如下，产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苦酸序列为5'- TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA -3'产生hFas的miRNA的单链寡核苷酸序列为5'隱TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTC ATGACTCC AACCTTA-3'产生hTNFRl的miRNA的单链寡核苷酸序列为5'- TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTGACTGACTGTGGGAACGAC ACCTGAA-3'。
4. 按权利要求1或2所述的pcDNA表达质粒，它们保藏的培养 物名称为大肠杆菌ToplO/phfgl2-miRNA/大肠杆菌ToplO/phTNFRl -miRNA/大肠杆菌ToplO/phFas-miRNA，已于2007年11月30日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO: 207188 /CCTCCNO: M207189/CCTCC NO: M207187。
全文摘要
本发明涉及构建了一组基因生物制剂，即构建了重型肝炎相关的人fgl2(Human Fibrinogen-like protein 2，hfgl2)凝血酶原酶、Fas和肿瘤坏死因子受体I(tumor necrosis factor，TNFR1)基因的microRNA腺病毒表达质粒，在细胞水平检测microRNA干扰质粒的有效性和特异性，建立三种microRNA腺病毒表达质粒联合应用于治疗重型肝炎。本发明采用pAd/CMV/V5-DEST载体和hfgl2、hFas、hTNFR1的pcDNA表达质粒通过Gateway技术，构建pAd-hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFR1。
文档编号C12N15/861GK101348799SQ20081013344
公开日2009年1月21日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者严伟明, 东 习, 琴 宁, 朱传龙, 鸣 王, 罗小平, 郭健文, 随 高 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院