专利名称：：检测结核分支杆菌和非结核分支杆菌核酸扩增产物的试纸与方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于快速识别是否存在结核分支杆菌和非结核分支杆菌的扩增DNA产物的试纸和方法。技术背景结核分支杆菌(A//co/^cte/7々/77/"Ze/"c"/os/^是一种弓I起肺结核病(Tuberculosis,TB)的细菌。结核分支杆菌大多攻击呼吸系统，但也可感染身体的其它器官、组织等。结核分支杆菌通过其携带者咳嗽、打喷嚏或说话等行为而通过空气传播。在2004年，统计数据显示有1460万人长期患病、有890万人是新增病例、有160万人死亡，这些人大部分分布在发展中国家。然而，因为免疫抑制药物的滥用或艾滋病的感染，越来越多的发达国家的人患上了肺结核。非结核分支杆菌(Nontuberculousmycobacteria,NTM)不会引起我们所说的肺结核症状，且感染到非结核分支杆菌并不会传染，因此不会产生公共卫生问题。它不像结核分支杆菌引起的疾病，属于非法定传染病。然而，受非结核分支杆菌感染的组织，会引起与肺结核病相似的肉芽肿(gra皿lomataformation),进而导致干酪样坏死(caseousnecrosis)。在直接涂片中，分支杆菌抗酸醇Ziehl-Neelsen染色呈阳性反应，故无法区别是结核分支杆菌或非结核分支杆菌。只有通过细菌培养，才能从它们特定的形态特征上加以区别。结果导致感染非结核分支杆菌的患者，经常首先被诊断出肺结核症状。只有当细菌培养约六周后，才发现诊断需修正，这段期间导致患者或医生治疗混乱。快速正确地检测结核分支杆菌的临床样本，对于临床治疗及疑似病人的确认，都有越来越重要的作用。分子技术，例如结核分支杆菌特定DNA的PCR扩增，可能是一种最有前景的快速、精确和敏锐的诊断方式。在加拿大专利第02223705号中，JiaBeiZhu等揭露了检测核酸扩增最终产物的一步分析法，该方法是通过用免疫原分子或亲和配体化合物来标记用于DNA扩增的探针，以及利用预固定有两种不同抗体和/或配体的测试试纸来检测最终产物来进行的。
发明内容本发明提供一种用于检测结核分支杆菌(TB)和非结核分支杆菌(NTM)的核酸扩增产物的检测试纸，其包括:(a)抗生物素蛋白-金释放区域(avidin-goldreleaseregion)和(b)测试带。本发明还提供一种检测TB盒NTM的方法，其包括(a)扩增具有标记的引物的样本DNA;(b)用电泳缓冲夜混合扩增的DNA产物；(c)将所述检测试纸浸入所述混合物中；和(d)使所述混合物流向试纸的反应区。图1为本发明一个实施例中的设计图。图2显示了引物的相对位置。图3显示了不同比例的结核分支杆菌及非结核分支杆菌的效果。图4显示了不同电泳缓冲液的效果。图5显示了引物与试纸的特异性。图6显示了TB/NTM二重PCR及巢式二重PCR的检测局限。图7显示了当用TB/NTM巢式二重PCR扩增DNA时试纸的检测局限。具体实施方式肺结核的致死率与死亡率在传染病中列于首位。然而，由于结核分支杆菌与非结核分支杆菌的临床症状相似，传统的诊断方法不但耗时而且混乱。快速而精确的诊断分支杆菌菌属(Mycobacterialspecies),可以帮助临床治疗并降低传染风险。本发明的试纸及方法为从检测分支杆菌提供了一种快速且简便的方式，而且可在同一张试纸上检出两种分支杆菌，例如TB和NTM。本试纸是一片吸水纸，自左到右包括，抗生物素蛋白-金释放区域和有测试带的测试区。所述试纸还可以包括位于所述测试区之后的对照带。抗生物素蛋白-金释放区域被覆盖着连有抗生物蛋白的胶体金颗粒。另外，两种与下述免疫原标记引物相对应的抗体分别被预固定在两个检测带上，而结合有牛血清白蛋白(BSA)的生物素被预固定在对照带上。本方法包含四个步骤。在第一步中，通过PCR，将一个链上含有生物素而另一链上含有免疫原分子例如DIG或FITC的特别设计的引物，用于扩增从病人体内获得的样本DNA。所述引物对应于一个耙标基因，例如rpoB基因，其包含高度保守区域，该区域存在于所有分支杆菌种类中但各种类间又是可区别的。扩增后，DNA产物被混合在电泳缓冲液中。在以下步骤中，测试试纸的左边浸入混合物，使得混合物利用毛细作用由左向右移动。如果靶标DNA是存在于样本中，且已被扩增，则所述DNA产物将在其一端包含生物素，而在其另一端包含免疫原分子。在DNA产物中的生物素将通过生物素化而在抗生物素蛋白-金释放区域结合到抗生物素上，从而与胶体金颗粒结合。测试带上的抗免疫原性分子抗体将结合到DNA产物中的免疫原分子上。只要样本中存在生物素，并且与抗生物素蛋白-金释放区域的抗生物素蛋白-金充分反应，使得抗生物素蛋白-金移向试纸的右侧，则胶体金颗粒也将会被连结到对照带上。因为胶体金的自然色为红色，所以检测带及对照带将显色为红色条带。若检测带为红色，则表示为阳性反应。如测试标的物不存在于混合物中，g卩，无DNA被扩增，则无标记DNA存在。在试纸上，在检测带将不发生反应，红色条带将仅仅存在于对照带上，而不论该靶标DNA是否存在于样本中。在一些实施例中，试纸上的区域和条带由左至右的顺序为抗生物素蛋白-金释放区域、TB检测带、NTM检测带及控制带。TB检测带覆盖有预固定的抗DIG抗体，NTM检测带覆盖有预固定的抗FITC抗体。对照带覆盖有BSA-生物素。结合到TBDNA的引物对其中一链标记有生物素，而另一链标记有DIG。而结合到NTMDNA的引物对其中一链标记有生物素，而另一链标记有FITC。如果样本中含有TB，则TBDNA将被扩增，因此TB检测带与对照带将显示红色。如果样本中含有NTM，则NTMDNA将被扩增，因此NTM检测带与对照带将显示红色。如果TB、NTM皆存在于样本中，贝l」TB、NTMDNA都将被扩增，因此TB、NTM检测带以及对照带都将显示红色。如果TB、NTM都不存在于样本中，则无DNA被扩增，因此TB、NTM检测带都不会显示红色，只有对照带将显示红色。实施例以下实施例进一步说明本发明。它们仅用于说明本发明，并阐明本发明特定实施例的各种优点，但不表示本发明只局限于此种方式。本发明实施例的设计如图l所示。实施例1耙标DNA的扩增下述引物的相对位置如图2所示。首先用rpoB弓I物通过PCT扩增TB/NTM的rpoB基因。正义引物RpoBF3的序列为5'-ACCGACGACATCGACCACTT-3，(SEQIDNO:1)。反义引物RpoBR2的序列为5，-AGCCGATCAGACCGATGTT-3(SEQIDNO:2)。第一次PCR的条件如下95°C95°C54°C72°C72°C4。C5分钟l分钟l分钟l分钟5分钟保存30循环10x延伸缓冲溶液5dNTP(10mM)1rpoBF3(lOuM)1rpoBR2(lOuM)1PowerTaq(5U/ul)0.4水36.6pi模板DNA5总共50第一次PCR的产物随后被用作第二次PCR的模板。用作第二次PCR的引物为TB引物和NTM引物，TB正义引物Tbcl的序列为5-CGTACGGTCGGCGAGCTGATCCAA画3，(SEQIDNO:3);TB反义引物TbcR的序列为5，陽GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT画3，(SEQIDNO:4)。NTM正义引物NTMM5的序列为5，-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTC-3，(SEQIDNO:5);NTM反义引物NTMRM3的序列为5，-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3，(SEQIDNO:6)。测试TB弓I物和NTM引物的比例，结果显示最佳比例为0.3ulTB引物加1ulNTM引物，参考表1及图3。表11234567810x缓冲夜55555555dNTP0.50.50.50.50.50.50.50.5Tbcl-biotin0.5111.50.50.30.50.3TbcR7-DIG0.5111.50.50.30.50.3NTMM5-biotin0.510.50.5111.51.5NTMRM3-FITC0.510.50.5111.51.5Taq0.20.20.20.20.20.20.20.2DNA55555555水37.335.336.335.336.336.735.335.7总共5050505050505050根据测试结果，第2次PCR的条件如下:10x延伸缓冲液95°C5分钟95°C30秒72°C60秒72°C5分钟4°C保存h35循环dNTP(10mM)Tbcl-biotin(10uM)TbcR7-DIG(10uM)NTMM5画Biotin(10uM)NTMRM3-(FITC)(10uM)PowerTaq(5U/ul)水0.4pi36.5pl模板DNA50jil实施例2电泳缓冲液申请人测试了三种电泳缓冲液。缓冲液A包含10mMHEPES,1%牛血清白蛋白(BSA),和0.1°/。吐温20。缓冲液B包含lOmMTris,1%牛血清白蛋白(BSA),和0.1%吐温20。缓冲液C包含lx磷酸缓冲液(PBS)，1%牛血清白蛋白(BSA)，及0.1%吐温20。结果显示缓冲液B提供了最佳的电泳条件，如图4所示，其中C为对照带，T为结核分枝杆菌检测带，N为非结核分枝杆菌检测带，TB(+)为结核分枝杆菌阳性，NTM(+)为非结核分枝杆菌阳性，TB(-)为结核分枝杆菌阴性，NTM(-)为非结核分枝杆菌阴性。实施例3弓l物与TB/NTM检测试纸的特异性为测试上述引物的特异性，以另外四种经常存在于呼吸道的细菌的基因组位靶标，进行上述测试步骤。这四种细菌是流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷白氏月巿炎菌(Klebsiellapneumoniae)禾口月巿炎链球菌(Streptococcuspneumonia)。结果显示引物及试纸对于TB及NTM具有特异性(如图5所示，其中TB代表结核分枝杆菌；NTM代表非结核分枝杆菌；H代表流感嗜血杆菌；S代表金黄色葡萄球菌；K代表克雷白氏肺炎菌；P代表肺炎链球菌)。实施例4TB/NTM检测试纸的敏感度为测试TB/NTM试纸的敏感度，TB/NTM二重PCR及TB/NTM巢式二重PCR被用来扩增DNA。结果显示依靠TB/NTM二重PCR检测TB及NTM的最低限度为20000份(见图6);依靠TB/NTM巢式二重PCR，检测TB的最低限度至少为10份，检测NTM的最低限度至少为20份(见图7)。试纸的生色结果与电泳结果一致。试纸亦侦测TB至少需10份及NTM至少为20份，如图7。实施例5TB/NTM试纸对于临床样本的特异性及敏感性为了确认实际TB/NTM检测试纸对临床样本的特异性及敏感性，共收集239个临床样本且利用TB/NTM检测试纸检测并用传统细菌培养方式作比较。实验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>利用TB/NTM试纸测试的239个临床样本中，只有1个(169号)与细胞培养的检测结果不相符。因此TB/NTM检测试纸的TB检测灵敏度约为97%>特异性为100%，而NTM检测灵敏度为100%、特异性为97%。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明。本领域的任何技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的改动或修饰，均属本发明的专利保护范围。序列表<110>亚洲基因科技股份有限公司<120>检测结核分支杆菌和非结核分支杆菌核酸扩增产物的试纸与方法<150>US11/948,389<151>2007-11-30<160>6<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>1accgacgacatcgaccactt20<210>2<211>19<212>DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>2agccgatcagaccgatgtt19<210>3<211>24<212>DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>3cgtacggtcggcgagctgatccaa24<210>4<211>25<212>DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>4gacctcc3gcccggcacgctcacgt25<210>5<211>25<212〉DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>5ggagcggatgaccacccaggacgtc25<210>6<211>25<212>DNA<213>结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>6cagcgggttgttctggtccatgaac2权利要求1.一种用于检测结核分支杆菌及非结核分支杆菌的核酸扩增产物的试纸，其包含(a)抗生物素蛋白-金释放区域和(b)检测带，其中所述检测带为结核分支杆菌检测带或非结核分支杆菌检测带。2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于该试纸进一步包含对照带。3.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于所述核酸扩增产物为利用标记引物通过PCR扩增的DNA。4.根据权利要求3所述的试纸，其特征在于所述标记引物在其一链上标记生物素，在其另一链上标记免疫原分子。5.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于所述免疫原分子是地高辛或异硫氰酸荧光素。6.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于所述结核分支杆菌检测带被覆盖有与被标记的结核分支杆菌DNA结合的抗体。7.根据权利要求6所述的试纸，其特征在于所述结核分支杆菌检测带被覆盖有抗地高辛抗体。8.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于所述非结核分支杆菌检测带被覆盖有与被标记的非结核分支杆菌DNA结合的抗体。9.根据权利要求8所述的试纸，其特征在于所述非结核分支杆菌检测带被覆盖有抗异硫氰酸荧光素的抗体。10.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于所述对照带被覆盖有牛血清白蛋白结合的生物素。11.一种检测结核分支杆菌及非结核分支杆菌的方法，其包含以下步骤:(a)利用标记引物扩增样本DNA;(b)将扩增的DNA产物与电泳缓冲液混合；(C)将检测试纸浸入所述混合物；及(d)使混合物移向试纸上的反应区。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述标记引物其一链标记有生物素，其另一链上标记有免疫原分子。13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述免疫原分子是地高辛或异硫氰酸荧光素。14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述检测试纸为权利要求1所述的试纸。全文摘要本发明提供一种用于检测结核分支杆菌(TB)和非结核分支杆菌(NTM)的核酸扩增产物的检测试纸，其包括(a)抗生物素蛋白-金释放区域(avidin-goldreleaseregion)和(b)测试带。本发明还提供一种检测TB和NTM的方法，其包括(a)扩增具有标记的引物的样本DNA；(b)用电泳缓冲液混合扩增的DNA产物；(c)将所述检测试纸浸入所述混合物中；和(d)使所述混合物流向试纸的反应区。文档编号C12Q1/04GK101307355SQ20081013360公开日2008年11月19日申请日期2008年7月11日优先权日2007年11月30日发明者周锦生,撒耘伊央,朱志锋申请人:亚洲基因科技股份有限公司