包含α-半乳糖基神经酰胺作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物的制作方法

专利名称：包含α-半乳糖基神经酰胺作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鼻内施用的疫苗组合物，其包含OC-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)作为佐剂。
背景技术：
到目前为止，已经开发了用于治疗各种赘生性和传染性疾病的新疫 苗。与使用活的减毒或非-复制灭活病原体的常规疫苗不同，当前疫苗由 合成的、重组的或纯化的亚基抗原组成。不管通过使用人免疫系统的免疫治疗法治疗癌症的各种研究，但是由 于人癌症细胞不是抗原呈递细胞，所以没有诱导适当的抗体免疫应答，或 者没有正确地激活肿瘤特异的细胞毒性T-细胞。疫苗已经被用作减少住院机会以及患有病毒感染诸如流感病毒感染 的患者的死亡率的主要工具。但是，RNA病毒，诸如流感病毒，特征在 于连续地抗原变异，这使得用于所述病毒的疫苗的研发变得困难。然而， 由于它们引起世界烕胁性的传染疾病，所以已经努力研发用于病毒诸如流 感病毒、SARS等的恰当的疫苗。抗原的主要入侵途径是口腔、鼻腔、喉、小肠、大肠、生殖器和肛门， 并且黏膜系统是致病抗原的主要防御线，形成黏膜免疫系统，其为两种主 要免疫系统之一 (另一种是全身免疫系统)。因此，大部分开发疫苗的研 究集中在开发能够诱导黏膜和系统免疫应答的疫苗组合物上(Czerkinsky 等，Immunol. Rev.(免疫学综述)，170: 197， 1999; Belyakov等，Proc, Natl. Acad. SciU.S.A.(美国国家科学院学报)，95: 1709, 1998; Berzofsky等，Nat. Rev. Immunol.(国家免疫学综述),1: 209， 2001; Kozlofsky等,Curr. Mol. Med.(当代分子医学),3:217,2003)。
疫苗可以以各种制剂进行开发。考虑到患者的并发症、剂量、施用容 易性以及副作用的发生率，最理想的制剂是鼻内疫苗。由于在可能参与感染危险的注射区域引起疼痛，所以用针注射疫苗减 少患者的顺应性。同时，黏膜接种，例如鼻接种，避免用针注射。因此， 黏膜免疫是比常规注射接种容易得多并且更加便利的方式。并且，与常规口服接种相比，由于鼻内施用避免肝一传作用(hepatic first pass effect) 和所施用的抗原在胃肠道中的降解，这带来高生物利用度、成本-减少和 由于最低的剂量的低副作用发生率，所以鼻内接种具有一些优点(Remeo 等，Adv. Drug Deliv. Rev.(高级药物递送综述),29:89,1998)。只包含抗原的黏膜疫苗诱导免疫耐受性，而不是免疫应答，所以与佐 剂共同-施用很重要(Yuki等，Rev. Med. Virol.(医学病毒学综述)，13: 293， 2003)。但是，尽管急需诱导黏膜免疫的佐剂，还没报道用于诱导黏膜免 疫性的临床可用的佐剂。'佐剂'意指促进或增强免疫应答的特异阶段从而最终增强免疫应答 的任何化合物。单独佐剂的施用不影响免疫性，但是与疫苗抗原共同-施 用可以提高并且维持针对所述抗原的免疫应答。佐剂典型的例子为油乳液 (弗氏佐剂)、皂角苷、铝或钙盐(明矾)、非离子嵌段聚合物表面活性 剂、脂多糖、分枝杆菌(mycobacteria)和破伤风类毒素。a-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)是一种来自于海绵体Jgeto mm^//"m 的糖脂，其作用为NKT (天然杀伤T)细胞的Val4+ T细胞受 体(TCR)的配体，并且由抗原呈递细胞(APC)的CDld呈递(Kawano等, Science(科学)，278: 1626, 1997)。NKT细胞的激活导致产生IFN-丫和IL-4, 这为特异的疾病或感染提供调节免疫应答的机会(Chen等，J. Immunol.(免 疫学杂志),159: 2240, 1997; Wilson等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美国 国家科学院学报)，100: 10913,2003)。在先前的研究中，检验了 aGalCer作为系统接种的佐剂的作用和效 果。结果，证实aGalCer作用为 一 种有效佐剂用于治疗感染 (Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美国国家科学院 学报),97: 8461 ，2000; Gonzalez-Asegui廳lza等，J. Exp. Med.(实验医学 杂志),195:615,2002)，自体-免疫疾病(Laloux等，J. Immunol.(免疫学杂
志)，166: 3749,2001: Teige等，J. Immunol.(免疫学杂志)，172: 186,2004) 和癌症(Hermans等，J. Immunol,(免疫学杂志)，171: 5140， 2003; Fujii等, J. Exp. Med.(实验医学杂志)，199: 1607, 2003; Hayakawa等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美国国家科学院学报)，100:9464,2003)。按照WO 2003/009812，当通过腹膜内注射、肌内注射和静脉内注射 而施用cxGalCer作为佐剂时，它增强抗原特异性Thl-型应答，特别是CD8+ T细胞应答。韩国专利公布No. 2003-0017733还描述当将肿瘤溶解产物与 aGalCer共同注射到腹腔中时，刺激NKT细胞，增加用于T细胞激活的 辅因子的表达，这导致对肿瘤细胞生长的抑制。然而，上述文件只证明aGalCer作为佐剂通过全身施用而诱导细胞介 导的免疫应答，并且没有提及ctGalCer作为用于鼻接种的佐剂的功能。由于不同淋巴器官中免疫细胞的免疫学微环境和动力学不同，所以在 免疫学方面，不能接受通过全身途径而诱导免疫应答的某种佐剂还可以用 作鼻疫苗佐剂，或者反之亦然。特别地，在体液免疫应答和细胞介导的免 疫应答方面，鼻疫苗和肌内或皮下疫苗可以诱导不同的免疫应答。因此， 需要彻底的检查，以验证用于肌内疫苗的佐剂是否可以用作用于鼻疫苗的 佐剂。例如，明矾是通过肌内注射用于临床应用的唯一一种疫苗佐剂，但 是不能被用作用于鼻疫苗的佐剂。霍乱毒素是鼻疫苗佐剂的一种有前途的 候选，但是不是关于肌内疫苗佐剂的研究目标。针对通过黏膜入侵的病原 体的最重要的免疫应答是分泌型IgA的产生，其只通过黏膜接种而诱导。 此外，黏膜接种可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，以致它不但通过 黏膜而且通过其它途径诱导针对病原体的免疫应答。因此，用于肌内疫苗 或全身施用的疫苗的佐剂不同被用作鼻内施用的疫苗的佐剂。为了应用用 于不同施用方法的佐剂，它必须通过实验和临床检验(Infectious Disease Review(传染病综述)3:2, 2001; Nature Immunology(自然免疫学)6:507， 2005; Reviews in Medical Virology (医学病毒学综述)，2003， 13:293-310; Nature Reviews Immunology (自然免疫学综述)，1: 20, 2001)。本发明人将肿瘤-相关抗原或病毒抗原与ocGalCer共同施用到小鼠鼻 腔，并且证实共同-治疗的aGalCer不但诱导针对肿瘤-相关的或病毒抗原
的体液免疫应答还诱导细胞介导的免疫应答。并且本发明人通过进一步证实aGalCer可以用作鼻疫苗组合物的佐剂而完成本发明。内容 技术问题本发明的目的是提供一种用于预防和治疗病毒感染和癌症的组合物， 所述组合物包含aGalCer作为佐剂用于鼻疫苗组合物，本发明人已证实其 诱导针对施用到小鼠鼻腔的肿瘤-相关抗原或病毒抗原的体液免疫应答和 细胞介导的免疫应答。技术方案本发明提供一种鼻疫苗组合物，其包含抗原和有效剂量的作为佐剂 的a-半乳糖基神经酰胺。本发明还提供同时增强针对与a-半乳糖基神经酰胺一起共同施用至 鼻腔的抗原的全身(systemic)免疫应答和黏膜免疫应答的方法。本发明还提供通过鼻内施用所述疫苗组合物而增强Thl和Th2免疫 应答的方法。本发明还提供通过鼻内施用所述疫苗组合物而增强分泌型IgA在黏 膜区室中的产生和IgG在系统区室中的产生的方法。本发明还提供一种用于鼻内施用的包含(x-半乳糖基神经酰胺的疫苗 佐剂。在下文中，详细地描述本发明。(x-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)是一种来自于海绵体的糖脂，其作用 为NKT(天然杀伤T)细胞的Val4+T细胞受体(TCR)的配体，并且由抗原 呈递细胞(APC)的CDld分子呈递(Kawano等，Science (科学)，278: 1626, 1997)。 NKT细胞的激活导致产生IFN-Y和IL-4，这为特异的疾病或感染 提供调节免疫应答的机会(Chen等,J. Immunol.(免疫学杂志)，159:2240, 1997; Wilson等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美国国家科学院学报),100: 10913,2003)。按照一些先前的报道，激活的NKT细胞可以诱导Th2免疫 应答(Yoshmoto等，Science (科学)，270: 1845, 1995; Singh等，J.Immunol.(免疫学杂志)163: 2373, 1999; Laloux 等 ， J. Immunol.(免疫学杂志)，166: 3749)。但是，其它报道认为激活的NKT 细胞诱导Thl免疫应答(Hermans等，J. Immunol.(免疫学杂志)，171: 5140， 2003; Stober等，J. Immunol.(免疫学杂志),170: 2540, 2003)。按照 目前的报道，aGalCer和OVA的共同-治疗诱导树突细胞(DC)的完全成熟， 并且由此诱导抗原-特异的Thl CD4+T细胞和具有针对OVA表达肿瘤的 抗性的CTL (Fujii等，J. Exp. Med.(实验医学杂志)，198: 267, 2003; Fujii等J. Exp. Med.(实验医学杂志),199: 1607,2004)。另夕卜，本发明人在体外成功地抑制由高量和低量抗原诱导的口服耐受性，这通过在全身施 用aGalCer和口服施用OVA后诱导肠系膜淋巴结中的DC完全成熟和T 细胞分化而实现(Chung等，Eur. J, Immunol.(欧洲免疫学杂志)，34:2471， 2004)。结果表明aGalCer可以用作各种黏膜疫苗的有效佐剂，并且诱导 Thl和CTL或Th2免疫应答。本发明人还证实，OVA与aGalCer —起的鼻内施用在C57BL/6和 Balb/c两种小鼠中诱导OVA-特异的黏膜S-IgA和全身IgG抗体应答、Thl 和Th2细胞因子应答以及很强的CTL应答。为了研究aGalCer作为佐剂在黏膜中的活性，将需要量的aGalCer和 100吗OVA或单独的100吗OVA用PBS稀释，制成20 pi溶液(IO吗1/ 鼻孔)，将其施用给6-8周龄的C57BL/6小鼠或Balb/c小鼠(Charles River 实验室，东方有限公司(Orient Co.， Ltd.)，韩国)，以一周的时间间隔施 用3次。aGalCer由Snaghee Kim博士 (Seoul National University(首尔国立大 学)，韩国)提供，其通过将植物鞘氨醇与二十六烷酸连接，并且然后按照 常规技术进行保护/去保护和半乳糖苷化而制备(Takikawa等，Tetrahedron (四面体)，54: 3141， 1998)。将aGalCer溶解在含有0.5%吐温20的PBS 中。含有0.5%吐温20的PBS用作本文的每一实验的赋形剂。从在C57BL/6小鼠中关于针对OVA的体液免疫应答的研究，证实 oiGalCer提高抗原-特异性的黏膜S-IgA (分泌型IgA)的水平(参见图l)以及 OVA-特异性的Th2型IgGl和Thl型IgG2a的水平，这间接地表明aGalCer 诱导Thl和Th2两种免疫应答(参见图2和图3)。在脾和CLN中的Thl
型细胞因子IFN-y和Th2型细胞因子IL-4的水平被aGalCer显著提高， 这直接表明aGalCer诱导Thl和Th2两种免疫应答(参见图4)。上述结果表明aGalCer是一种有力的黏膜疫苗佐剂，其能够诱导抗原 -特异的黏膜S-IgA (分泌型IgA)和全身IgG抗体应答，并且在C57BL/6 小鼠中诱导Thl和Th2两种免疫应答。己经充分确定，当静脉内或口服施用时，aGalCer诱导CTL应答(Fujii 等，J. Exp. Med.(实验医学杂志)，198: 267, 2003: Silk等，J. Clin. Invest.(临床研究杂志)，114: 1800,2004)。因此，还研究当它与OVA—起施用 到鼻腔时，aGalCer是否能在C57BL/6小鼠中诱导CTL应答。结果，所 有用aGalCer处理的组在黏膜(CLN)和系统(脾和MLN)区室中表现出剂 量一依赖型细胞溶解活性和细胞毒性活性(参见图5和图6)。上述结果 表明aGalCer是一种能够在黏膜和全身免疫系统中都诱导CTL的有力的 鼻疫苗佐剂。在Balb/c小鼠中关于aGalCer活性的研究结果与上述结果一 致，这表明aGalCer的作用不限于C57BL/6小鼠(参见图7—

图11)。aGalCer具有能够诱导抗病毒免疫应答特别是针对流感病毒 A/PR/8/34感染的免疫应答的鼻疫苗佐剂活性。为了研究黏膜受到针对病 毒感染的aGalCer的多少保护，将Balb/c小鼠用aGalCer和PR8 HA抗原 免疫，以一周的时间间隔鼻内施用3次进行。在最后的免疫后两周，通过 鼻途径用20 LDs。流感病毒刺激。3天后，在鼻洗液、肺洗液和血液血清 中检测PR8HA-特异性抗体应答。结果，在所有cxGalCer-处理的组的鼻洗 液、肺洗液和血液血清中检测到高水平的PR8 HA-特异性IgA抗体(参见 图12)，并且还在所有用aGalCer共同免疫的小鼠的血液血清中检测到 高水平的PR8HA-特异性IgG抗体(参见图13)。因此，这证实aGalCer 是一种不但诱导针对病毒抗原的全身IgG而且诱导针对病毒抗原的黏膜 S-IgA的有力的鼻疫苗佐剂。在只用抗原免疫的小鼠中，发病机理比用抗 原和aGalCer共同免疫的那些小鼠严重得多(参见图14)。所有只用赋 形剂处理的小鼠在10天内死亡，并且只用PR8 HA处理的小鼠有57%在 感染病毒后14天内死亡。相反，通过鼻内途径用(xGalCer和PR8 HA共 同免疫的小鼠在存活率和体重减少以及快速体重减少恢复速率中没有表 现出任何显著的减少(参见图14)。因此，证实aGalCer是一种能够诱 导针对病毒感染的强抵御机制和黏膜S-IgA抗体以及全身IgG抗体的有力 的鼻疫苗佐剂。通过鼻内途径用0.125吗aGalCer和携带(3-半乳糖酶基因的复制_缺 陷型腺病毒(Ad-LacZ)(Viromed,韩国)免疫Balb/c小鼠，而进一步研究由 (xGalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答。结果，aGalCer有效地诱导针对携 带(3-半乳糖酶基因的复制一缺陷型腺病毒的细胞介导的和体液免疫应答 (参见图15—图17)。进一步证实aGalCer具有诱导针对EG7肿瘤的抗癌免疫应答的鼻疫 苗佐剂活性。通过以一周的时间间隔鼻内施用3次而将C57BL/6小鼠用 OVA和aGalCer—起免疫。最后免疫后两周，在免疫小鼠的左胁皮下接 种3xW个EG7肿瘤细胞。接种后14天，将小鼠处死，并且将可触摸的 肿瘤切离，并且检测重量。结果，在通过鼻内途径用0.5吗和2.0 pg的 cxGalCer和OVA共同免疫的小鼠中，肿瘤形成完全得到抑制(参见图18)。 这些结果表明(xGalCer可以用作诱导抗癌免疫应答的有力的鼻疫苗佐剂。为了研究由a—GalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答是否受CDld分子 调控，将CDlcW-C57BL/6小鼠，其中CDld分子缺失并且因此缺失NKT 细胞，用单独的OVA或与a-GalCer —起以一周的时间间隔鼻内免疫3次。 一周后，在野生型和CDld-/- C57BL/6两种小鼠中研究血清中的全身IgG 应答和体内CTL活性。结果，在CDld-A小鼠中的全身IgG抗体应答被显 著地抑制(参见图19)，并且还在001(1-/-小鼠的排泄淋巴结(draining lymph node)和全身淋巴器官中抑制CTL细胞溶解活性(参见图20)。 上述结果表明由a-GalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答专一地受CDld分子 调控。aGalCer的鼻内施用诱导先天T细胞的激活，并且因此将这些细胞分 化成为效应器细胞。为了再次证实aGalCer对先天T细胞激活的作用，将 CFSE-标记的OTl细胞过继转移到同系基因小鼠(syngenicmice)。在过 继转移的第二天，对所述小鼠鼻内施用单独的OVA或与2.0 )ig aGalCer 一起的OVA。 48小时后，研究CD25在CLN中的表达。结果，在用OVA 和aGalCer共同处理的小鼠中，表达CD25的OT1细胞的水平高于只用 OVA处理的那些小鼠，这意味着aGalCer鼻佐剂诱导先天T细胞的活化 (参见图21)。为了证实激活的T细胞是否成功地分化成高度功能性的CTL，将这些细胞进一步用OVA257.264肽刺激6小时，然后检测细胞内IL-2 和IFN-y水平。结果，在用OVA与aGalCer—起通过鼻内途径免疫的小 鼠中，由OT1细胞产生的IL-2和IFN-y水平高于只用OVA处理的那些 小鼠(参见图22)。结果表明鼻内施用的aGalCer诱导先天T细胞的活 化，并且促使活化的T细胞分化成为效应T细胞。甚至在用杀死的PR8病毒作为抗原的情形中，ocGalCer诱导针对流感 感染的可信的和有力的免疫应答。具体地，将Balb/c小鼠用杀死的PR8 病毒和aGalCer以两周的时间间隔通过鼻内途径免疫两次。结果，aGalCer 鼻疫苗佐剂提高血清中IgG的水平(参见图23)和黏膜区室中S-IgA的 水平(参见图24) 。 ctGalCer鼻疫苗佐剂还显著地提高免疫细胞的增殖(参 见图25)以及IFN-y和IL-4的产生(参见图26)。证明由aGalCer鼻疫苗 佐剂激活的细胞毒性T细胞具有强细胞溶解活性(参见图27)和保护性 免疫性(参见图28)。上述结果表明，当通过鼻内途径与甚至杀死的病 毒抗原共同处理时，aGalCer诱导针对活病毒感染的有力的体液免疫应答 和细胞介导的免疫应答，以及强和可信的保护性免疫应答。上述结果还表明aGalCer可以用作诱导抗-感染和抗癌免疫应答的有 效的鼻疫苗佐剂。因此，本发明提供包含有效剂量的ot-半乳糖基神经酰胺佐剂和抗原的 疫苗组合物。在本文中术语"有效剂量的佐剂"表示能够引发针对通过鼻内途径施 用的抗原的免疫应答的aGalCer的量，其还被本领域的那些技术人员很好 地理解。更精确地，佐剂的有效剂量意指，与只用抗原免疫的小鼠相比， 能够将来自用抗原和aGalCer共同免疫的小鼠的鼻洗液中的S-IgA水平 提高大于5%、更优选地25%和最优选地大于50%的量。因此，优选地，本发明的组合物包含低于0.5 w/v%的 oi-半乳糖基神经酰胺。"抗原"意指当其入侵宿主时，能够通过被宿主的免疫系统识别而诱导 免疫应答的任何物质(例如，蛋白、肽、癌症细胞、糖蛋白、糖脂、活病 毒、杀死的病毒、DNA等)。
抗原可以作为纯化的形式或未-纯化的形式提供，但是优选纯化的形 式。 .本发明可以用于各种抗原，包括病原体的蛋白、重组蛋白、肽、多糖、 糖蛋白、糖脂和DNA (多聚核苷酸)、癌细胞、活病毒以及杀死的病毒。提供下列抗原作为本发明的示例性实施方案的参考，但是不限于此 流感病毒抗原(血细胞凝集素和神经氨酸酶抗原)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原(百日咳毒素，丝状血细胞凝集素，pertactin),人 乳头状瘤病毒(HPV)抗原，Helicobacterpylori抗原(血清组A, B, C， Y和 W-135的荚膜多糖)，破伤风类毒素，白喉抗原(白喉类毒素)，肺炎球菌 (pneumococcal)抗原(月巿炎链球菌(Streptococcus pnemoniae) 3型荚膜多 糖)，结核(tuberculosis)抗原，人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120， GP-160): 霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)，葡萄球菌(staphylococcal)抗原(葡萄球菌肠 毒素B)，志贺氏菌(shigella)抗原(志贺氏菌多糖)，疱疹性口炎病毒抗原 (疱疹性口炎病毒糖蛋白)，巨细胞病毒(cytomegalovirustigen) (CMV)抗 原，肝炎抗原(甲型肝炎(HAV)，乙型(HBV)，丙型(HCV), 丁型(HDV)和庚 型(HGV)抗原),呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，单纯疱疹抗原或它们的组合 (不包括，白喉、百日咳和破伤风、DPT)。本发明的鼻疫苗组合物可以配制成液体或粉末形式的组合物，特别是 按照施用方法的气溶胶、滴剂、吸入剂或吹入剂，并且优选粉剂或小球体。用于滴鼻剂的组合物可以包括一种或多种可用的赋形剂，诸如防腐 剂、粘性调节剂、渗透性调节剂和缓冲剂。疫苗的施用量确定为能够有效诱导免疫应答的量。例如，对于人疫苗 的施用频率是每天一次到几次，并且剂量是l-250吗，并且优选2-50 吗。在啮齿动物和猿类中，a-半乳糖基神经酰胺似乎不诱导毒性(Nakata 等，Cancer Res.(癌症研究),58: 1202-1207, 1998)。并且，在用2200 |ig/Kg aGalCer处理的小鼠中没有报道过副作用，并且，证明aGalCer是一种不 引起剂量-限制性毒性(50-4800 ng/m、的安全物质，并且在剂量增加的研 究中具有抗性(Giaccone等，Clin. Cancer Res,(临床癌症研究),8: 3702， 2002)。 本发明还提供增强针对与ccGalCer —起通过鼻内途径施用的抗原的 免疫应答的方法。上文提及的抗原与aGalCer —起同时施用至鼻腔内优选地通过配发 装置(dispensing device)进行，并且更优选地使用气溶胶递送系统。本发明还提供通过将抗原与cxGalCer —起同时施用至鼻腔内而增强 Thl和Th2免疫应答的方法。本发明还提供通过将抗原与(xGalCer —起同时施用至鼻腔内而增强 IgA黏膜免疫应答和IgG全身免疫应答的方法。本发明提供一种包含aGalCer作为有力的鼻疫苗佐剂的鼻疫苗组合物。附图描述参考附图，更好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中 图l-图4举例说明在C57BL/6小鼠中共同-施用OVA和aGalCer诱导 OVA-特异性S-IgA和全身IgG应答以及Thl和Th2细胞因子分泌。图1 是显示在用OVA单独或与aGalCer —起通过鼻内途径以一周的时间间隔 免疫3次的最后一次免疫之后一周小鼠鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中 OVA-特异性S-IgA效价的一组图表。图2是显示在血清中的OVA-特异性 全身IgG效价的图表，并且图3是显示在血清中OVA-特异性IgG同种型 效价的图表。图4是显示在来自脾和子宫颈淋巴结(CLN)的OVA和单细 胞培养4天后获得的培养物上层清液中IFN-Y和IL-4生产水平的一组图 表，其通过夹层ELISA进行检验。图5和图6举例说明在C57BL/6小鼠体内aGalCer诱导强CTL应答。 图5是举例说明通过FACS分析的脾细胞的特异性裂解的一组图表。具体 地，将来自首次用于实验的C57BL/6小鼠的等数目OVA257.264肽脉冲的 CFSE胃脾细胞(靶点细胞)和未脉冲的CFSE^脾细胞(对照细胞)静脉 内注射至免疫的小鼠。24小时后，将小鼠处死，并且检测靶点细胞在脾、 MLN和CLN中的比例。图6是以百分数表示图5中检测的CTL活性的 一组图表。
图7-图11举例说明通过鼻内途径共同-施用OVA和aGalCer在Balb/c 小鼠中诱导OVA-特异性抗体应答、Thl和Th2细胞因子分泌和CTL活性。 图7是显示在最后一次免疫后一周的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中的 OVA-特异性S-IgA效价的一组图表。图8是显示血清中OVA-特异性全身 IgG效价的图表。图9是显示在血清中IgG同种型效价的图表。图10是 显示在来自脾和子宫颈淋巴结(CLN)的OVA和单细胞培养4天后获得的 培养物上层清液中IFN-y和IL-4生产水平的一组图表，其通过夹层ELISA 进行检验。图11举例说明在将脾细胞和OVA培养4天后并且通过细胞内 细胞因子染色(ICS)检验的生产IFN-y-的CD8+T细胞(CTL)的产生。图12-图14举例说明在Balb/c小鼠中由aGalCer鼻疫苗佐剂诱导的针 对流感病毒A/PR/8/34感染的强保护性免疫应答。图12是显示在鼻洗液 (NW)、肺洗液(LW)和血清中PR8 HA-特异性S-IgA效价的一组图表。特 别地，将Balb/c小鼠用单独的PR8 HA或与aGalCer —起通过鼻内途径以 一周的时间间隔免疫3次。2周后，将小鼠通过鼻内途径用20 LDso活的 流感病毒A/PR/8/34感染。然后，检测在鼻洗液(NW)、肺洗液(LW)和血 清中PR8 HA-特异性S-IgA效价。图13是显示血清中PR8 HA-特异性IgG 效价的图表。图14是显示在病毒感染后每隔一天检测的小鼠存活率和体 重减少的一组图表。图15-图17举例说明鼻内施用的aGalCer在Balb/c小鼠中诱导黏膜 S-IgA和全身IgG应答以及CTL应答，这确定针对复制-缺陷型活的腺病 毒感染的强免疫性。图15是显示，在用单独的复制-缺陷型活的腺病毒或 与aGalCer —起通过鼻内途径以2周的时间间隔2次免疫Balb/c小鼠后一 周检测在鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中p-半乳糖酶-特异性S-IgA效价的一 组图表。图16是显示血清中(3-半乳糖酶-特异性IgG效价的图表。图17 是显示在用(3-半乳糖酶刺激脾细胞后通过细胞内细胞因子染色检测的 IFN个生产CD8+T细胞的水平的图表。图18是举例说明通过C57BL/6小鼠的鼻腔共同-施用OVA和aGalCer 可以诱导针对EG7肿瘤的强保护性的图表。具体地，从最后一次免疫2 周后，将3 x 106个EG7肿瘤细胞皮下接种到免疫的小鼠的左胁。14天后， 研究可触摸的肿瘤的重量和肿瘤的发生率。
图19和图20举例说明aGalCer作为佐剂的活性受CDld调控。图19 是显示在野生型和CDld-/-C57BL/6 (0)1(1-/-)小鼠血清中OVA-特异性IgG 效价的图表。简要地，将野生型和CDld-/- C57BL/6小鼠用OVA和aGalCer一起以一周的时间间隔免疫3次。最后一次免疫后一周，将等数目的 OVA257.264脉冲的CFSE *脾细胞(革巴点细胞)和未脉冲的CFSE ^脾细胞(对照细胞)过继转移到免疫的小鼠。l天后，通过EILSA检测血清中OVA-特异 的IgG效价，并且显示在图19中，通过FACS检验靶点细胞的比例并显 示在图20中。图21和图22举例说明通过鼻内途径共同-施用OVA和aGalCer激活 先天CD8+T细胞，并且因此诱导它们分化成效应T细胞。图21是显示 通过aGalCer鼻疫苗佐剂激活先天T细胞的一组图表。将CFSE-标记的 OT-1细胞过继转移到同系基因的小鼠。1天后，将所述小鼠用OVA与 aGalCer—起鼻内免疫。1天后，通过FACS分析来自CLN的淋巴细胞的 CD25的表面表达。图22是显示aGalCer鼻疫苗佐剂促使活化的T细胞分化成为效应T细胞的一组图表。在将细胞用OVA257—264肽和GolgiPhlg(BD Pharmingen)刺激6小时后，通过FACS进一步检验如在图21中获得 的淋巴细胞细胞内IL-2和IFN-y的生产。图23-图28举例说明通过鼻内途径用福尔马林(formaline)-灭活的 PR8病毒与aGalCer —起免疫诱导体液免疫应答、细胞介导的免疫应答和 保护性免疫应答。将Balb/c小鼠用灭活的PR8病毒与aGalCer —起通过 鼻内途径以两周的时间间隔免疫两次。在最后一次免疫后两周，将小鼠处 死，并且获得鼻洗液和肺洗液。检测IgG(图23)和黏膜S-IgA(图24)在其 中的生产。图25显示在从脾和CLN分离的单细胞中的免疫细胞的增殖。 图26是显示Thl和Th2细胞因子的生产的一组图表。图27是显示检测 CTL活性的"Cr释放检测的结果的图表。图28是示例将免疫的小鼠用活 PR8病毒感染并且然后通过蚀斑测定检测肺洗液中的病毒数目以研究保 护性免疫应答的图表。发明的方式 本发明的实施和目前优选的实施方案如下述实施例所示进行举例说明。然而，应该理解，考虑到本公开，本领域的那些技术人员可以在本 发明的精神和范围内进行改进和改善。实施例1:对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而诱导的 OVA-特异的黏膜S-IgA和全身IgG抗体应答将6只8周龄的C57BL/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司 (Orient Co.， Ltd.),韩国)用100吗单独的OVA或与指定量的aGalCer (0.125, 0.5， 2.0 pg)以一周的时间间隔免疫3次，其中OVA禾n aGalCer用 PBS稀释，并且制成20iil溶液(10nl/鼻孔)。aGalCer由Sanghee Kim博士(首尔国立大学，韩国)提供，其通过将 植物鞘氨醇与二十六垸酸连接，并且然后按照常规技术进行保护/去保护 和半乳糖苷化而制备(Takikawa等，Tetrahedron (四面体)，54: 3141, 1998)。 将aGalCer溶解在含有0.5%吐温20的PBS中。含有0.5%吐温20的PBS 用作本文的每一实验的赋形剂。在最后免疫后一周，将小鼠处死。通过ELISA检测OVA-特异性抗体 应答。鼻洗液通过用100pl灭菌PBS洗涤鼻通道(nasal passage)而获得 (Yamamoto等，J. Immunol.(免疫学杂志),161:4115,1998)，还通过如所 述相同的方式获得支气管小泡灌洗流体，以制备肺洗液(Chimg等，免疫学 206: 408,2002)。检测在所述鼻洗液和肺洗液中的OVA-特异性IgG效价(Chung等，免 疫学206: 408, 2002)。为了检测IgA、 IgGl和IgG2a效价，使用两倍连续 稀释的样品。为了确定IgA效价，使用辣根-过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠IgA (SIGMA， USA)、过氧化物酶底物和TMB (西格玛(SIGMA), 美国)，并且向其中加入0.5N-HCL终止显色。然后，检测OD4so。为了确 定IgG、 IgGl和IgG2a效价，使用碱性磷酸酶-缀合的山羊抗-小鼠IgG、 IgGl和lgG2a(南方生物技术(SouthernBiotech)，美国)和碱性磷酸酶底 物、对-硝基苯基磷酸(西格玛)。
如在图1中所示，在用2.0pgaGalCer共同免疫的小鼠中，鼻洗液和 肺洗液中的OVA-特异性IgA应答显著高于只用赋形剂或只用OVA免疫 的那些小鼠中的应答。如在图2中所示，与只用赋形剂或只用OVA免疫的那些小鼠相比， 在用不同浓度的aGalCer (0.125， 0.5， 2.0吗)共同免疫的小鼠的血清中检测 到更高的OVA-特异性IgG水平。为了评估由(xGalCer鼻疫苗佐剂间接诱导的对Thl或Th2免疫应答的 免疫偏爱性，确定血清中的IgG同种型，并且计算IgGl与IgG2a的比例。如在图3中所示，共同-施用aGalCer和OVA导致OVA-特异性的Th2 型IgGl和Thl型IgG2a水平的显著增加，这表明aGalCer鼻疫苗佐剂没 有使免疫应答偏向Thl或Th2免疫应答，并且诱导Thl和Th2两种免疫 应答。从上述结果，证实aGalCer是一种能够在C57BL/6小鼠中诱导抗原-特异性黏膜S-IgA (分泌型IgA)和全身IgG抗体应答并且可以诱导Thl和 Th2两种免疫应答的强黏膜佐剂。实施例2:对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而诱导TM 和Th2细胞因子的分泌直接研究aGalCer鼻疫苗佐剂是否使得免疫应答偏向Thl或Th2免疫 应答。为了检测细胞因子的分泌，在最后免疫后一周从脾和子宫颈淋巴结 (CLN)获得细胞。将所述细胞(5 x 106个细胞/1111)用500吗/ml OVA培养4 天。通过使用小鼠IFN-y和IL-4 OptELA set ELISA试剂盒(BD Pharmigen) 按照制造者的用法说明而检测培养物上层清液中的IFN-y和IL-4的分泌。如在图4中所示，IFN-y和IL-4在脾和CLN中的分泌显著增加。高 浓度的aGalCer诱导更多的IFN-y分泌，并且IL-4在CLN中的分泌也与 aGalCer浓度成比例增加。从上述结果，证实aGalCer的鼻内施用在全身(脾)和黏膜(CLN) 区室中诱导Thl (IFN-力和Th2 (IL-4)两种免疫应答。
实施例3:对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而诱导的 强CTL应答已经公知静脉内或口服施用aGalCer诱导CTL应答(Fuji等，J. Exp. Med.(实验医学杂志)，198:267，2003:Silk等，J. Clin. Invest.(临床研究杂 志)，114: 1800， 2004)。在此处，研究鼻内施用aGalCer是否能够诱导CTL 应答。将脾细胞从首次用于实验的C57BL/6小鼠分离，将其用1 OVA257—264在37"脉冲90分钟。将脉冲的细胞用20 (iM CFSE (分子探针 (Molecular Probes),美国)在37。C标记15分钟，形成OVA257.264脉冲的 CFSE^细胞。同时，将未脉冲的细胞用2 CFSE (分子探针，美国)在 37。C标记15分钟，形成OVA257.264未脉冲的CFSE^细胞。将等数目的肽-脉冲的CFSE ^细胞和未脉冲的CFSE ^细胞混和，将其在最后免疫后一周 以2x 107个细胞的数目静脉内注射到小鼠。24小时后，在脾、肠系膜淋 巴结(MLN)和子宫颈淋巴结(CLN)中通过FACS而研究肽-脉冲的CFSE s 细胞的特异性裂解。如在图5和图6中所示，与只用赋形剂或只用OVA免疫的那些组相 比较，所有用aGalCer鼻疫苗佐剂共同免疫的组在脾、MLN和CLN中表 现出剂量-依赖方式的更高的细胞毒性。上述结果表明cxGalCer是一种能够在局部和系统淋巴器官中都诱导 CTL的强鼻疫苗佐剂。实施例4:对Balb/c小鼠通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而诱导的体液和细胞介导的免疫应答<4-1>抗体和细胞因子的检测(体液免疫性)为了研究aGalCer是否可以在Balb/c小鼠中用作鼻疫苗的强佐剂，通 过如实施例1中所述相同的方式对Balb/c小鼠鼻内施用不同量的 aGalCer(0.15, 0.5, 2.0吗)和100 ng OVA，接着检测血清中OVA-特异性 IgG、 OVA-特异性IgGl和IgG2a，以及鼻洗液和肺洗液中的OVA-特异性 IgA应答。
如在图7和图8中所示，与只用赋形剂或只用OVA处理的小鼠中的那些相比较，对Balb/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司，韩国) 鼻内施用cxGalCer和OVA诱导血清中更高的OVA-特异性IgG应答和鼻 洗液与肺洗液中更高的OVA-特异性IgA应答。如在图9中所示，鼻内施用aGalCer和OVA导致OVA-特异性IgGl 和IgG2a效价的增加。如在实施例2中所述，对Balb/c小鼠(Charles River实验室，东方有 限公司，韩国)鼻内施用不同量的aGalCer (0.125, 0.5, 2.0吗)和OVA，接 着检测脾和CLN中的IFN-y和IL-4水平。如在图10中所示，所有用aGalCer共同免疫的组表现出IFN-y和IL-4 生产的显著增加。有趣地，当鼻内施用0.5ngaGalCer时，在血清中检测 到最高的IgG抗体水平，并且在脾中检测到最高的IL-4水平。此外，肺 洗液中黏膜IgA水平和CLN中IL-4的生产与ocGalCer的量成反比。总之，高浓度的aGalCer可以在Balb/c小鼠中诱导针对共同施用的抗 原的耐受性。<4-2>细胞毒性的检测(细胞介导的免疫性)在Balb/c小鼠中，OVA剂量不包括与I类MHC分子结合的表位肽。 因此，为了研究由aGalCer佐剂在Balb/c小鼠中诱导的细胞毒性活性，检 测IFN-y-生产CD8+T细胞的数目(图ll)。具体地，将所述细胞(2x106 个细胞/ml)用500 pg /ml OVA培养4天，在终止培养前6小时向其中加入 l|al/ml GolgiPug (BD Pharmigen,美国)。然后，通过使用FITC-缀合的 CD3 mAb (克隆145-2C11, Biolegend Inc，美国)，PE-缀合的CD8 mAb (克 隆53-6.7, Biolegend Inc,美国)和APC-缀合的IFN-y mAb (克隆XMG1,2, Biolegend Inc,美国)进行染色。使用BD Cytofix/Cytoperm Plus (BD Pharmigen,美国)按照制造者的用法说明进行细胞内染色，并且将染色的 细胞用FACSCalibur (BD Bioscience,美国)和CellQuest软件(BD Bioscience,美国)分析。如在图11中所示，IFN个生产CD8+ T细胞的数目随着(xGalCer浓度 增加而减少。在图10中，通过夹层ELISA检测的IFN-y数目不依赖于aGalCer的浓度，但是产生IFN-y-的CTL数目与oiGalCer浓度成反比例。 上述结果归因于这样的事实，即，通过夹层ELISA检测的IFN-y数目包 括由不同细胞包括CD4+、 CD8+ T细胞或APC分泌的所有的IFN-y，而 通过FACS检测的CTL数目只是由CD8+ T细胞分泌的。因此，上述结果表明aGalCer在Balb/c小鼠中具有强的鼻疫苗佐剂活性。实施例5:通过鼻内共同-施用ocGalCer和病毒抗原蛋白而诱导的抗-病毒 免疫应答为了检测cxGalCer防止病毒感染的黏膜保护程度，将Balb/c小鼠用单 独的PR8 HA抗原(Shin-Ichi Tamura博士，大阪大学，日本，其通过 Davenport, J. Lab. Clin. Med.(实验室临床医学杂志)，63:5， 1964的方法制 备)或与aGalCer—起以一周的时间间隔免疫3次。最后免疫后2周，将 小鼠通过鼻腔用20LDso活的流感病毒A7PR78/34感染。病毒感染后3天， 制备鼻洗液、肺洗液和血清，并且通过如在实施例1中所述相同的方式检 测其中的PR8HA-特异性抗体应答。另外，每隔一天观察被感染的小鼠的 体重减少和存活率，持续14天。如在图12中所示，在从用(xGalCer共同免疫的所有组分离的鼻洗液 和肺洗液以及血清中检测到高水平的PR8 HA-特异性S-IgA抗体。如在图 13中所示，还在用aGalCer共同免疫的组的血清中检测到高水平的PR8 HA-特异的IgG抗体。上述结果表明，aGalCer可以用作能够诱导针对病毒抗原的黏膜S-IgA 抗体和全身IgG抗体应答的强的鼻疫苗佐剂。如在图14中所述，以用抗原和aGalCer共同-处理的那些小鼠相比较， 在不用aGalCer免疫的小鼠中观察到更严重的发病机理，这于检测存活 率、体重减少和体重恢复时间的结果一致。在只用赋形剂处理的组中，所 有小鼠在病毒感染后IO天内死亡。在只用PR8 HA处理的组内，57%的 小鼠在感染病毒后14天内死亡。然而，通过鼻腔共同-施用PR8 HA和 aGalCer的组在存活率上没有表现出任何显著的减少。
上述结果表明，cxGalCer可以用作能够诱导致针对病毒感染的保护的 黏膜S-IgA抗体以及全身IgG抗体应答的强鼻疫苗佐剂。实施例6:通过鼻内共同-施用aGalCer和活病毒而诱导的抗-病毒免疫应 答将Balb/c小鼠用单独的106 pfli携带(3-半乳糖酶基因的复制_缺陷型 活的腺病毒(Ad-LacZ) (Viromed，韩国)或与0.125 pg aGalCer—起通过鼻 内施用以两周的时间间隔免疫两次。最后免疫后一周，通过如实施例1中 所述相同的方式，制备鼻洗液、肺洗液和血清，以检测{3-半乳糖酶-特异 的抗体应答。另外，为了检测CTL活性，将脾细胞用2.5 ^g/mL |3-半乳糖酶 刺激5天，并且按照如实施例<4-2>中所述的方法通过细胞内细胞因子染 色检验产生IFN个的CD8+ T细胞。如在图15和图16中所示，与只用赋形剂或只用Ad-LacZ免疫的组 的那些相比较，在通过同时鼻内施用而用Ad-LacZ和cxGaICer共同免疫的 组的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)以及血清中分别检测到更高水平的 卩-半乳糖酶-特异的S-IgA抗体和p-半乳糖酶-特异的IgG抗体。如在图17中所示，在通过同时鼻内施用而用抗原和aGalCer共同免 疫的组中，证实产生IFN-y-的CD8+ T细胞数目的显著的增加。上述结果表明aGalCer是一种针对复制-缺陷型活病毒的有效的鼻疫 苗佐剂。实施例7:通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而诱导的针对EG7肿瘤的 抗癌免疫应答为了证实ctGalCer是否可以用作诱导抗癌活性的鼻疫苗佐剂，将 C57BL/6小鼠用单独的100吗OVA或与aGalCer (0.125， 0.5, 2.0 pg)—起 通过鼻内施用以一周的时间间隔免疫3次。最后免疫后2周，将3 x 106 个EG7肿瘤细胞皮下接种到免疫的小鼠的左胁。在接种的第14天，将小 鼠处死，并且称重可触摸的肿瘤。如在图18中所示，在只用赋形剂或只用OVA共同免疫的所有小鼠 中以及用0.125吗aGalCer处理的1/3小鼠中发现肿瘤块(tumor masses)。
与只用赋形剂处理的小鼠的肿瘤相比，通过鼻腔只用OVA处理的小鼠的肿瘤显著重(p < 0.05)。有趣地，在通过鼻腔用0.5pg和2.0pg aGalCer与 OVA—起处理的小鼠中，肿瘤形成被完全抑制。从所述结果，证实aGalCer可以用作诱导抗癌免疫应答的有效并且强 的鼻疫苗佐剂。实施例8: aGalCer的CDld调控的鼻内佐剂活性为了研究由aGalCer诱导的免疫应答是否受CDld调控，将NKT缺 陷型(由缺乏CDld导致)CDld-/- C57BL/6小鼠(Charles River实验室，东 方有限公司，韩国)用于本实验(Park等，J. Exp. Med.(实验医学杂志)， 193: 893, 2001)。在最后鼻内施用的第一周，通过如实施例1和实施例3 所述相同的方法在野生型和CDld-/- C57BL/6小鼠中检测血清中全身IgG 水平和体内CTL活性。如在图19中所示，在CDld-A小鼠中全身IgG抗体应答明显被抑制。 如在图20中所示，在CD 1 d-A小鼠的排泄淋巴结(draining lymph node) 和全身淋巴器官中抑制CTL细胞溶解活性。上述结果表明由本发明的 aGalCer诱导的免疫应答专一地受CDld和KNT细胞调控。实施例9:通过鼻内共同-施用抗原和aGalCer而激活先天T细胞并且将活 化的T细胞分化成为效应细胞为了研究aGalCer对T细胞激活的作用，检测CD25在过继转移到同 系基因的小鼠中的CFSE-标记的OT1细胞(OVA特异的CD8+ T细胞)中 的表面表达。通过使用CD8a (Ly-2)磁珠(Mitenyl Biotech)将OT1细胞从 OTl小鼠分离，将其用10pMCFSE在37。C标记15分钟，然后静脉内转 移到同系基因的小鼠中。过继转移后1天，对其进行单独的100 jig OVA 或与2.0pgaGalCer—起的鼻内施用。48小时后，使用FACS研究CD25 在CLN中的表达。如在图21中所示，在同时施用OVA和aGalCer的小鼠中，表达CD25 的OT1细胞的水平高于只用OVA处理的那些小鼠，这表明aGalCer鼻佐 剂诱导先天T细胞的活化。
为了证实活化的T-细胞是否分化成为完全功能性的CTL，通过如在实施例4中所述相同的方法，将2 x 106/ml细胞进一步用5 pM OVA257_264 肽刺激6小时，并且然后通过使用APC-缀合的IL-2 (克隆JES6-5H4， Biolegend Inc.,美国)和APC-缀合的IFN-y mAb (克隆XMG1.2 Biolegend Inc.,美国)检测细胞内的IL-2和IFN-y水平。如在图22中所示，在同时施用OVA禾n aGalCer的小鼠中，分泌IL-2 和IFN-y的OT1细胞水平高于只用OVA处理的那些小鼠。上述结果表明，鼻内施用aGalCer诱导先天T细胞的激活，以及这些 活化的T-细胞向强的效应T细胞的分化。实施例1.0:通过鼻内共同-施用otGalCer和杀死的病毒而诱导的抗-病毒免疫应答为了检验aGalCer作为杀死的病毒的佐剂的作用，将用福尔马林灭活 的流感病毒A/PR78/34 (PR8)用作检验所述抗-病毒免疫应答的抗原。将 Balb/c小鼠用指定量的(l jig, 10 ng)单独的PR8或与aGalCer—起通过鼻 内施用以两周的时间间隔免疫两次。最后免疫后两周，将小鼠处死，并且 进行下述实验。<10-1>研究体液免疫应答从处死的小鼠分离鼻洗液、肺洗液和血清，并且通过如实施例1所述 相同分方法观察其中抗体的生产。如在图23中所示，在用单独的灭活的 PR8处理的小鼠组和用相同量的灭活的PR8和aGalCer—起同时处理的小 鼠组之间进行比较。结果，在同时施用灭活的PR8和aGalCer的小鼠中， 抗原-特异的全身IgG水平显著高于只有灭活的PR8处理的小鼠。如在图 24中所示，在同时施用灭活的PR8和aGalCer的组中，鼻洗液和肺洗液 中的黏膜S-IgA水平显著地升高。上述结果证实，同时鼻内施用aGalCer和杀死的病毒强烈地诱导有力 的体液免疫应答。<10-2>研究免疫细胞增殖
将从处死的小鼠的脾和CLN分离的单细胞用灭活的PR8培养3天， 并且加入[3司-胸苷，并且继续培养18小时。当细胞增殖时，通过LSC检 测结合的[3司-胸苷的水平。如在图25中所示，在同时施用aGalCer的小 鼠中，免疫细胞的增殖显著提高。上述结果表明，鼻内施用cxGalCer和杀死的病毒强烈地诱导免疫细胞 增殖。<10-3〉由aGalCer诱导的IFN-y和IL-4的生产将从处死的小鼠的脾和CLN分离的单细胞用灭活的PR8培养5天。 获得上层清液，并且通过如实施例2所述相同的方法检测其中的IFN-y和 IL-4水平。如在图26中所示，在同时施用aGalCer的小鼠的脾和CLN中， Thl细胞因子IFN-丫和Th2细胞因子IL-4的水平显著提高。上述结果表明，用aGalCer和杀死的病毒鼻内免疫同时诱导Thl和 Th2免疫应答。<10-4〉研究细胞介导的免疫应答将从处死的小鼠的脾分离的单细胞用刺激细胞培养5天。为了获得刺 激细胞，单细胞取自首次用于实验的Balb/c小鼠的脾，将所述细胞用y-射线照射，导致细胞的灭活。然后，将灭活的细胞用活的PR8病毒感染。 在将脾细胞用刺激细胞培养5天后，将效应细胞连续稀释3倍，接着与51Cr-标记的靶点细胞一起继续培养6小时。然后，检测培养物上层清液中残留 的"Cr的量。通过用活PR8病毒感染P815肿瘤细胞(购自ATCC)并且 用"Cr标记而制备靶点细胞。如在图27中所示，只在同时用aGalCer处 理的小鼠中观察到耙点细胞-特异的细胞溶解活性。上述结果表明，同时鼻内施用aGalCer和杀死的病毒诱导强的细胞介 导的免疫应答。<10-5>研究保护性免疫应答 如前文所述，同时鼻内施用aGalCer和杀死的病毒诱导强的体液免疫 应答和细胞介导的免疫应答。接着进行实验，以检验当活病毒侵入时，所 述免疫应答是否能够激发保护性免疫应答。将免疫的小鼠用20LDs。活的PR8病毒感染，并且3天后处死，以获 得肺洗液。通过蚀斑测定而检测肺洗液中活的PR8的量。具体地，将MDCK 细胞(购自ATCC)以95 — 100%的密度培养在6孔平板中。通过使用培养 基将所述肺洗液连续稀释10倍，将其添加到平板上，接着感染1个小时。 然后，除去肺洗液。向其中加入包含琼脂糖的培养基，接着在C02培养箱 中继续培养2-3天。用肉眼计数其中形成的蚀斑的数目。如图28中所示， 在用10 pg灭活的PR8和aGalCer同时免疫的小鼠中，没有观察到蚀斑， 这表明诱导了可信的保护性免疫应答。上述结果证实，同时鼻内施用杀死的病毒和(xGalCer诱导强保护性免 疫应答。工业适用性如前文所解释，本发明证实，用aGalCer和肿瘤-相关的抗原或病毒 抗原同时鼻内免疫不但有效地诱导针对侵入的肿瘤细胞或病毒的体液免 疫应答，还诱导细胞介导的免疫应答。因此，本发明的aGalCer可以有效 地用作鼻疫苗佐剂，用于预防和治疗病毒感染与癌症。本领域的那些技术人员应该理解，在前述描述中公开的观念和具体的 实施方案可以容易地用作改进或设计实行本发明的相同目的的其它实施 方案的基础。本领域的那些技术人员还应该理解，这样的等价实施方案没 有背离在后附的权利要求中提出的本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种用于鼻内施用的疫苗组合物，其包含抗原和作为佐剂的有效剂量的α-半乳糖基神经酰胺(αGalCer)。
2. 按照权利1的用于鼻内施用的疫苗组合物，其中所述抗原选自由 病原体的蛋白、重组蛋白、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖和多聚核苷酸组成 的组。
3. 按照权利1的用于鼻内施用的疫苗组合物，其中所述抗原是细胞 或病毒。
4. 按照权利1的用于鼻内施用的疫苗组合物，其中包含少于0.5 w/v% 的所述a-半乳糖基神经酰胺作为佐剂。
5. 按照权利1的用于鼻内施用的疫苗组合物，其中所述组合物配制 成液体、粉剂或小球体形式。
6. —种增强针对所注射的抗原的全身免疫应答和黏膜免疫应答的方 法，其通过同时鼻内施用抗原与a-半乳糖基神经酰胺而实施。
7. 按照权利要求6的增强针对注射的抗原的免疫应答的方法，其中 所述抗原和a-半乳糖基神经酰胺通过配发装置进行鼻内注射。
8. 按照权利要求7的增强免疫应答的方法，其中所述配发装置是气 溶胶或滴剂递送系统的形式。
9. 一种增强Thl和Th2两种免疫应答的方法，其通过鼻内施用权利 要求1的疫苗组合物而实施。
10. —种增强IgA黏膜免疫应答和IgG全身免疫应答的方法，其通 过鼻内施用权利要求1的疫苗组合物而实施。
11. 一种用于鼻内施用的疫苗佐剂，其包含a-半乳糖基神经酰胺。
全文摘要
本发明涉及包含α-半乳糖基神经酰胺(αGalCer)作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物。本发明人将αGalCer与肿瘤细胞抗原或病毒抗原一起施用至小鼠的鼻腔，并且然后证实αGalCer不但有效地诱导体液免疫应答，还诱导细胞介导的免疫应答。因此，所述αGalCer可以有效地用作通过鼻内施用的疫苗的佐剂，用于预防和治疗病毒感染与癌症。
文档编号A61K39/12GK101212983SQ200680024197
公开日2008年7月2日 申请日期2006年4月3日 优先权日2005年7月13日
发明者姜昌律, 高圣悦 申请人:财团法人首尔大学校产学协力财团