专利名称：糖抗原的糖基神经酰胺佐剂的制作方法
技术领域：
本发明属于疫苗佐剂，尤其是用于糖抗原的疫苗佐剂领域。
背景技术：
疫苗常常包含佐剂以增强免疫活性。已知佐剂的例子包括铝盐、水包油乳剂、皂苷类、细胞因子、脂质和CpG寡核苷酸。目前，仅有铝盐和单磷酰基脂质MF59TM被批准用于人。然而，铝盐的安全性受到关注，并且与一些抗原不相容。因此，需要开发其它佐剂。
α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)是糖脂，更具体说是糖基神经酰胺，最初分离自海绵动物[1]。MHC I类-样分子CD1d将α-GalCer递呈到未变异的天然杀伤T细胞上，起初研究α-GalCer诱导天然杀伤T细胞对抗肿瘤细胞的反应的能力[2]。未变异的天然杀伤T细胞也能诱导B细胞活化，增强B细胞增殖和抗体产生[3，4]。近年来证明，α-GalCer能用作各种共同给予的蛋白质抗原的佐剂[5]。已证明，α-GalCer与经辐射的子孢子或表达疟抗原的重组病毒共同给予能提高小鼠的保护性抗疟免疫力水平[6]。也证明，α-GalCer可用作编码HIV-I gag和env基因的DNA疫苗的佐剂[7]。
然而，并非所有疫苗都含有蛋白质抗原。几种市售疫苗含有糖抗原。例如，PneumovaxTM是含有23种肺炎球菌血清型的糖抗原的疫苗。MencevaxTM和MenomuneTM是含有脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)A、C、Y和W-135的糖抗原的脑膜炎球菌疫苗。因此，需要将α-GalCer的佐剂应用延伸至糖抗原。
尽管α-GalCer成功用作DNA和蛋白质抗原的佐剂，但本发明者惊讶地发现，它不能用作一些糖抗原的佐剂。相反，发现α-GalCer与这些抗原一起给予会导致相对于无佐剂对照抗体滴度显著降低。本发明的目的是克服存在α-GalCer时抑制抗-糖抗体应答反应的问题。
发明内容
令人惊讶地发现，如果将糖抗原偶联于运载体可逆转α-GalCer存在下对抗-糖免疫应答的此种抑制，甚至可以增强对糖抗原的免疫应答。因此，本发明提供了一种组合物，其包含(a)偶联于运载体的糖抗原；和(b)α-糖基神经酰胺佐剂。
α-糖基神经酰胺佐剂本发明组合物中包含的佐剂可以是本领域已知的任何合适α-糖基神经酰胺。该α-糖基神经酰胺佐剂优选为式(I)化合物 式中，R1代表H或OH，X代表1-30的整数，R2代表选自(a)-(e)的取代基(式中Y代表5-17的整数)；(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，R3代表H、OH、NH2、NHCOCH3或单糖，R4代表OH或单糖，R5代表H、OH或单糖，R6代表H、OH或单糖，和R7代表H、CH3、CH2OH或单糖。
X优选为7-27，更优选为9-24，更优选为13-20。
Y优选为7-15，更优选为9-13。
当R3是单糖时，它优选选自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
当R4是单糖时，它优选选自β-D-呋喃半乳糖或N-乙酰α-D-吡喃半乳糖。
当R5是单糖时，它优选选自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
当R6是单糖时，它优选选自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
当R7是单糖时，它优选选自甲基α-D-吡喃半乳糖苷、甲基β-D-吡喃半乳糖苷、甲基α-D-吡喃葡糖苷或甲基β-D-吡喃葡糖苷。
优选地，R5和R6不同。优选地，R5和R6中一个是H。
参考文献2中提供了适合包含于本发明组合物中的α-糖基神经酰胺佐剂的其它例子。
α-糖基神经酰胺佐剂优选为α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)(即R3＝OH、R4＝OH、R5＝OH、R6＝H和R7＝CH2OH)。本发明组合物中包含的α-GalCer可直接分离自海绵动物，或者可以是化学合成产物。参考文献8中提供了适合用于本发明组合物的α-半乳糖基神经酰胺的例子。优选的α-半乳糖基神经酰胺是KRN7000，它具有式(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1，3，4-octadecanetriol)。参考文献8中描述了KRN7000的合成。
α-糖基神经酰胺佐剂也可以是α-GalCer的截短类似物，其中与α-GalCer相比脂族酰基链和/或鞘氨醇链被截短。参考文献9提供了α-GalCer的截短类似物的例子。α-GalCer的优选截短类似物是′OCH′，其中与优选的α-GalCer相比脂族酰基链截短了两个烃基和鞘氨醇链截短了9个烃基(即R1＝H，X＝21，R2＝CH(OH)(CH2)4CH3，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH)。α-GalCer的其它优选截短类似物包括与α-GalCer相比脂族酰基链截短了两个烃基和鞘氨醇链截短了7个或3个烃基的类似物(即R1＝H，X＝21，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH，R2是CH(OH)(CH2)6CH3或CH(OH)(CH2)10CH3)。
糖抗原优选地，本发明组合物中包含的偶联于运载体的糖抗原是细菌糖，具体是细菌荚膜糖。
本发明组合物中可以包含的细菌荚膜糖的例子包括来自脑膜炎奈瑟球菌(血清型A、B、C、W135或Y)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(血清型4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(可分型菌株a、b、c、d、e或f)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等的荚膜糖。本发明组合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖)和真菌荚膜糖，如来自新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)荚膜的荚膜糖。
脑膜炎奈瑟球菌血清型A(MenA)荚膜是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位置上部分O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清型B(MenB)荚膜是(α2→8)-连接的唾液酸的均聚物。脑膜炎奈瑟球菌血清型C(MenC)荚膜糖是(α2→9)连接的唾液酸的均聚物，在7位和/或8位上具有可变的O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清型W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖单元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]组成的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上具有可变的O-乙酰化[10]。脑膜炎奈瑟球菌血清型Y糖类似于血清型W135糖，除了该二糖重复单元用葡萄糖代替了半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。它在唾液酸的7位和9位上也具有可变的O-乙酰化。
B型流感嗜血杆菌荚膜(Hib)糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物[′PRP′，(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)]。
本发明组合物可含有糖抗原偶联物的混合物。优选地，本发明组合物包含来自一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清型的糖抗原，如，组合物可含有来自血清型A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶联物。优选组合物包含来自血清型C和Y的糖偶联物。其它优选组合物包含来自血清型C、W135和Y的糖偶联物。
当混合物包含来自血清型A的脑膜炎球菌糖和至少一种其它血清型糖时，MenA糖与任何其它血清型糖的比率(w/w)可能大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。来自血清型A∶C∶W135∶Y的糖的优选比率(w/w)为1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。
本发明的其它优选组合物包含Hib糖偶联物和来自至少一种脑膜炎奈瑟球菌血清型，优选来自一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清型的糖偶联物。例如，本发明组合物可包含Hib偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的偶联物。
本发明还包括包含肺炎链球菌糖偶联物的组合物。该组合物优选包含来自一种以上肺炎链球菌血清型的糖偶联物。优选组合物包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物(7价)。组合物还可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1和5的糖偶联物(9价)或可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、3和7F的糖偶联物(11价)。
其它优选的本发明组合物包含肺炎球菌糖偶联物和来自Hib和/或脑膜炎奈瑟球菌的糖偶联物。优选地，本发明组合物可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物和Hib糖偶联物。优选地，本发明组合物可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶联物。本发明组合物也可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物，Hib糖偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶联物。
优选的是，组合不会去除单个糖抗原偶联物的保护功效，尽管可能降低实际免疫原性(如ELISA滴度)。
荚膜糖抗原的制备荚膜糖抗原的制备方法是熟知的。例如，参考文献11描述了脑膜炎奈瑟球菌的糖抗原的制备。参考文献12的第14章描述了流感嗜血杆菌的糖抗原的制备。本领域描述了肺炎链球菌的糖抗原和偶联物的制备。例如，PrevenarTM是7-价肺炎球菌偶联物疫苗。参考文献13和14中详细描述了无乳链球菌的糖抗原的制备方法。
可化学修饰糖抗原。例如，可修饰它们，以用封端基团取代一个或多个羟基。这尤其可用于脑膜炎球菌血清型A，可用封端基团取代乙酰基以防止水解[15]。这种修饰糖仍然是本发明含义内的血清型A糖。
荚膜糖可以寡糖形式应用。通过纯化的荚膜多糖的片段化(如通过水解)方便地形成寡糖，片段化后通常纯化所需大小的片段。
优选进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30。可通过离子交换色谱或比色测定方便地测定DP[16]。
如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[17]。可用各种方式，如超滤后进行离子交换色谱实现此目的。对于血清型A，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖，对于血清型W135和Y，优选去除聚合程度小于约4的寡糖。
运载体运载体优选蛋白质。本发明组合物中糖抗原偶联的优选运载体蛋白是细菌毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。合适的运载体蛋白包括白喉毒素的CRM197突变体[18-20]、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[21]、合成肽[22，23]、热激蛋白[24，25]、百日咳蛋白[26，27]、细胞因子[28]、淋巴因子[28]、激素[28]、生长因子[28]、包含多个来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[29]如N19蛋白[30]、流感嗜血杆菌的蛋白D[31，32]、肺炎球菌表面蛋白PspA[33]、肺炎链球菌溶血素[34]、摄铁蛋白[35]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[36]等。
优选通过(例如)运载体蛋白中赖氨酸残基或精氨酸残基侧链中的-NH2基团将糖抗原连接于运载体。当糖具有游离醛基时，它可与运载体中的胺反应，通过还原性胺化形成偶联物。也可通过(例如)半胱氨酸残基侧链中的-SH基团进行连接。
当该组合物含有一种以上糖抗原时，可能(例如)采用一种以上运载体，以降低运载体抑制的风险。因此，不同运载体可用于不同糖抗原，如脑膜炎奈瑟球菌血清型A糖可偶联于CRM197，而C型糖可偶联于破伤风类毒素。也可能将一种以上运载体用于一种具体糖抗原。糖可分为两类，一些偶联于CRM197，另外一些偶联于破伤风类毒素。然而，通常，优选对所有糖采用相同运载体。
一种运载体蛋白可携带一种以上糖抗原[37，38]。例如，一种运载体蛋白偶联的糖可以来自不同病原体或来自同一病原体的不同血清型。为了实现这个目标，可在偶联反应前混合不同糖。然而，通常，优选使各血清型形成不同偶联物，偶联后混合不同糖。不同偶联物可基于同一种运载体。
优选糖蛋白比率(w/w)为1∶5(即蛋白质过量)-5∶1(即糖过量)的偶联物。优选比率为1∶2-5∶1，以及1∶1.25-1∶2.5。
偶联物可与游离运载体联用[39]。当给定的运载体蛋白以游离和偶联形式存在于本发明组合物中时，未偶联形式优选不多于组合物中运载体蛋白总量的5％，更优选小于2重量％。
偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等[也参见参考文献40和41等]。
可采用任何合适的偶联反应，需要时使用任何合适接头。
一般在偶联之前使糖活化或官能化。活化可包括(例如)氰基化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[42，43等])。其它合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献44的引言)。
可用任何已知方法，如参考文献45和46所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的胺基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[47，48]。其它接头包括B-丙酰胺基[49]、硝基苯基-乙基胺[50]、卤代酰基卤化物[51]、配糖键[52]、6-氨基己酸[53]、ADH[54]、C4-C12部分[55]等。作为采用接头的替代方式，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括多糖的氧化，然后用蛋白质还原性胺化，如参考文献56和57所述。
优选包括以下步骤的方法将氨基引入糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生化，并与运载体蛋白反应。
偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等[也参见参考文献58和59等]。
当本发明组合物包含解聚的糖时，优选在偶联之前进行解聚。
本发明组合物的其它抗原性组分本发明组合物至少包含一种偶联于运载体的糖抗原。然而，除上述偶联于运载体的糖抗原以外，本发明组合物可包含一种或多种以下抗原-脑膜炎奈瑟球菌血清型B的蛋白抗原，如参考文献60-66所述，尤其优选蛋白′287′(见下)和衍生物(如′ΔG287′)。
-脑膜炎奈瑟球菌血清型B的外膜泡囊(OMV)制剂，如参考文献67、68、69、70等所述。
-肺炎链球菌(如PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133，如参考文献71所述)的蛋白抗原。
-甲肝病毒，如失活病毒的抗原[如72、73；参考文献78的第15章]。
-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[如73、74；参考文献78的第16章]。
-丙肝病毒抗原[如75]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，也任选地与百日咳杆菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3联用[如参考文献76和77；参考文献78的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献78的第13章]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献78的第27章]。
-淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原[如60、61、62]。
-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原[如79、80、81、82、83、84、85]。
-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[如86]。
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[如87]。
-脊髓灰质炎抗原[如88，89；参考文献78的第24章]如IPV。
-狂犬病抗原[如90]如冻干的失活病毒[如91，RabAvertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献78的第19、20和26章]。
-幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原如CagA[92-95]、VacA[96、97]、NAP[98、99、100]、HopX[如101]、HopY[如101]和/或脲酶。
-流感抗原[如参考文献78的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如102]。
-无乳链球菌(B型链球菌)的蛋白抗原[如103、104]。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[如104、105、106]。
-金黄色葡萄球菌抗原[如107]。
-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(RSV[108、109])和/或副流感病毒(PIV3[110])的抗原。
-炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原[如111、112、113]。
-黄病毒属病毒，如黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的四种血清型、蜱传播性脑炎病毒、西尼罗河病毒的抗原。
-瘟病毒抗原，如经典的猪热病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或边界病病毒的抗原。
-细小病毒，如细胞病毒B19的抗原。
该混合物可包含一种或多种这些其它抗原，需要时可对它们进行解毒(如用化学和/或遗传方法使百日咳毒素解毒)。
当该混合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。
混合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引起抗该抗原的免疫应答。
作为混合物中采用蛋白抗原的替代方式，可采用编码该抗原的核酸。因此，混合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式)取代。相似地，本发明组合物可包含模拟糖抗原的蛋白质如模拟表位[114]或抗-独特型抗体。
药物组合物的制剂本发明偶联物和α-糖基神经酰胺佐剂尤其适合包含在免疫原性组合物和疫苗中。因此，本发明方法可包括将偶联物和α-糖基神经酰胺佐剂制成免疫原性组合物或疫苗的步骤。本发明提供了可用此方式获得的组合物或疫苗。
除偶联于运载体蛋白的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂以外，本发明免疫原性组合物和疫苗一般包含′药学上可接受的运载体′，其包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适运载体一般是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[115]、脂质聚集体(如油滴或脂质体)和失活的病毒颗粒。这些运载体是本领域普通技术人员熟知的。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助性物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲性物质等。药学上可接受的赋形剂的全面讨论见参考文献116。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的糖抗原，以及所需的任何其它上述组分。′免疫有效量′指以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体的量能有效治疗或预防。该量依待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的制剂、主治医生对医学状况的评价和其它相关因素而不同。预计该量属于可由常规试验确定的相对宽的范围。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。
该疫苗可与其它免疫调节剂联用。在本发明免疫原性组合物中，α-糖基神经酰胺用作佐剂。疫苗可包含其它佐剂。这些佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐类，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献117的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附性化合物。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[118]。
磷酸铝佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mgAl3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μgAl3+/偶联物/剂。采用磷酸铝并且不需要将抗原吸附于佐剂时，在溶液中包含游离的磷酸根离子(如采用磷酸盐缓冲液)比较有利。
B.油乳剂适合用作发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献117的第10章；也参见参考文献119](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献117的第22章]皂苷制剂也可用作本发明佐剂。皂苷是在大量植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组合。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了使用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生成QS21的方法参见参考文献120。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[121]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献117的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献121-123中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[124]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献125和126。
D.病毒小体和病毒样颗粒病毒小体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂组合或配制入磷脂中的病毒蛋白。它们通常是非病原性、非复制性的，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒小体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在参考文献127-132中有进一步描述。病毒小体在(例如)参考文献133中有进一步描述。
E.细菌或微生物衍生物适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰化单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献134中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在除菌过滤时通过0.22μm膜[134]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC-529[135，136]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂质A衍生物。(例如)参考文献137和138中描述了OM-174。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。
CpG可包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献139、140和141公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献142-147中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[148]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或它可更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献149-151中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选为CpG-AODN。
优选地，构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献148和152-154。
细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选地，该蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献155中描述了将解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献156中描述了将用作胃肠外佐剂。毒素和类毒素优选包括A和B亚单位的全毒素形式。优选地，A亚单位含有解毒突变；B亚单位优选不突变。佐剂优选是解毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献157-164中描述了将ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。氨基酸取代基的编号优选根据参考文献165中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比，该参考文献的全部内容被特别纳入本文作为参考。
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[166]等)[167]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘着剂和粘膜粘着剂生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[168]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[169]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即直径约100nm-150μm，更优选直径约200nm-30μm，最优选直径约500nm-10μm的微粒)，微粒经任选处理而具有带负电的表面(例如用SDS处理)或正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
I.脂质体(参考文献117第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献170-172所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[173]。这种制剂还包含聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂和辛苯糖醇[174]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[175]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)参考文献176和177中描述了PCPP制剂。
L.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物适合用作本发明佐剂的咪唑喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献178和179所述。
本发明也包括一种或多种上述佐剂的组合。例如，本发明中可使用以下佐剂组合物(1)皂苷和水包油乳剂[180]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[181]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)[182]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[183]；(6)SAF，含10％角鲨烷、0.4％吐温80TM、5％普流罗尼嵌段聚合物L121，及thr-MDP，经微流体化成为亚微米乳剂或经涡旋产生粒度较大的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)含2％角鲨烷、0.2％吐温80以及单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)中一种或多种细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；以及(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS无毒衍生物(例如3dMPL)。
参考文献117第7章中公开了用作免疫刺激剂的其它物质。
医学方法和用途配制好后，可将本发明组合物直接给予对象。待治疗对象可以是动物；具体说，可治疗人类对象。该疫苗尤其可用于接种儿童和青少年。可通过全身和/或粘膜途径递送它们。
一般将该免疫原性组合物制备为注射剂，如溶液或悬液；也可制备适合在注射前用液体载体溶解或悬浮的固体形式。也可将该制剂乳化或包裹在脂质体中，以增强佐剂作用。通常通过胃肠道外(如皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或递送至组织间隙)直接递送该组合物。也可将该组合物给予伤口。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂、以及透皮或经皮施用(参见例如参考文献184)、针头和无针注射器。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。
本发明疫苗优选无菌。它们优选为无热原。优选将它们缓冲至(例如)pH 6-pH 8，通常约pH 7。当疫苗包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[185]。
本发明疫苗可包含低水平(如＜0.01％)的去污剂(如吐温，如吐温80)。本发明疫苗可包含(如)约15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是在冻干情况下。
可凭经验评价单一抗原的最优剂量。然而，通常，将以每剂每种糖0.1-100μg的剂量给予本发明糖抗原，剂量体积一般是0.5ml。剂量一般是每剂每种糖5-20μg。这些值均以糖计。
本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即在感染后治疗疾病)，但一般是预防性。
本发明提供了药用的偶联于运载体蛋白的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂。
本发明也提供了在患者中产生免疫应答的方法，该方法包括给予患者本发明疫苗。具体说，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，该方法包括给予患者偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂。所述免疫应答优选为使患者保护性抵抗脑膜炎球菌病、肺炎球菌病或流感嗜血杆菌，可包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。患者可以是成人或儿童。患者年龄可以是0-6月、6-12月、1-5岁、5-15岁、15-55岁或大于55岁。患者优选为儿童。在已经用脑膜炎球菌、肺炎球菌或流感嗜血杆菌初敏的患者中，该方法可产生增强应答。
可同时、连续或分别给予糖抗原偶联物和α-糖基神经酰胺佐剂。例如，可在给予糖抗原偶联物之前或给予糖抗原偶联物之后给予α-糖基神经酰胺佐剂以致敏哺乳动物，加强该哺乳动物对该偶联物的免疫应答。在给予一种以上糖抗原偶联物时，可同时给予α-糖基神经酰胺佐剂，其中分别、同时或连续给予α-糖基神经酰胺佐剂与糖抗原偶联物混合物。
产生免疫应答的方法可包括给予第一剂量的偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂，随后任选给予无佐剂第二剂量的偶联于运载体的糖抗原。可同时、连续或分别给予第一剂量的糖抗原偶联物和α-糖基神经酰胺佐剂。
本发明也提供偶联于运载体的糖抗原在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答，其中所述药物与α-糖基神经酰胺佐剂一起给予。
本发明也提供α-糖基神经酰胺佐剂在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答，其中所述药物与偶联于运载体的糖抗原一起给予。
本发明也提供偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答。
本发明也提供偶联于运载体的糖抗原在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答，其中患者经α-糖基神经酰胺佐剂预治疗。
本发明还提供α-糖基神经酰胺佐剂在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答，其中患者经偶联于运载体的糖预治疗。
本发明也提供偶联于运载体的糖抗原在药物生产中的应用，所述药物在患者中产生免疫应答，其中所述患者经偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂预治疗。
所述药物优选为免疫原性组合物(如疫苗)。所述药物优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌引起的疾病(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎、心包炎、脑膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、肺炎等)。因此，优选预防和/或治疗细菌性脑膜炎。
可用标准动物模型检测疫苗(参见例如参考文献186)。
本发明还提供了一种药盒，其包括a)偶联于运载体的糖抗原和b)α-糖基神经酰胺佐剂。
定义术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
附图简要说明
图1A)用肺炎链球菌多糖与或不与α-GalCer组合的小鼠免疫方案。用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer，3)3.5μg-10μg获自肺炎链球菌23种不同血清型的多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5μg-10μg Streptopur(SP)和0.1μg α-GalCer，免疫四组六周龄雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl体积进行肌肉内免疫。初敏4天、8天和12天后(4dp1、8dp1、12dp1)将小鼠放血，用ELISA测定血液中抗肺炎链球菌的抗体水平。初敏10周或12周后，用仅3.5μg-10μg SP的加强剂量免疫所有小鼠。加强4天、8天和12天后(4dp2、8dp2、12dp2)将小鼠放血，用ELISA测定血液中抗肺炎链球菌的抗体水平。初敏18-22周后，处死小鼠并用Elispot测定肺炎链球菌特异性B细胞的数量。
B)用肺炎链球菌多糖与或不与α-GalCer组合的小鼠免疫方案。如图1A，但免疫采用3.5μgSP的50μl溶液。
C)用单独的、与蛋白质运载体偶联或混合的不同多糖，与和不与α-GalCer组合的小鼠免疫方案。在第0天用1)PBS，2)0.1μg与α-GalCer组合，3)10μg MenC多糖，4)20μg CRM蛋白质运载体，5)30μg MenC-CRM偶联物，6)与CRM蛋白质运载体混合的10μg MenC多糖，或3)-6)和α-GalCer的组合物(第7-10组)，使10组野生型C57BL/6小鼠初敏。初敏2周和4周后，用与初敏所用相同的组合物加强免疫小鼠。初敏2、4和6周后(2wp1、2wp2和2wp3)，将小鼠放血，测定抗MenC多糖和CRM运载体的抗体水平。
图2与仅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠肺炎链球菌-特异性抗体滴度较低。显示了仅用3.5μg Streptopur(SP)(黑柱)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(白柱)初敏后4天、8天和12天小鼠的肺炎链球菌-特异性IgM滴度(几何平均数)。(*指对仅有SP的p＜0.05，**指对仅有SP的p＜0.01)。
图3与仅用Streptopur初敏和加强的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏并用Streptopur加强的小鼠肺炎链球菌特异性抗体滴度较低。A)用3.5-11.5μgStreptopur和PBS初敏后8天(黑色)或用3.5-11.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏后8天(灰色)小鼠的肺炎链球菌特异性IgM滴度(几何平均数)的变化。(这些数据来自四次实验)。B)用3.5-11.5μg Streptopur加强后8天，同一小鼠的肺炎链球菌特异性IgM滴度(几何平均数)的变化。(这些数据来自所进行的实验18、19和29)。用黑色表示用3.5-11.5μg Streptopur初敏的小鼠的结果，用灰色表示用3.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏的小鼠的结果。
图4与用PBS初敏并用Streptopur加强的小鼠相比，用α-GalCer初敏并用Streptopur加强的小鼠中每106脾细胞中肺炎链球菌特异性B细胞数量较低。在第0天用0.1μg或1.0μg α-GalCer(aGC)初敏两组小鼠，12周后用11.5μg Streptopur(SP)免疫。在第0天用PBS免疫第三组小鼠，12周后用11.5μg SP 12免疫。在第0天和12周后用PBS免疫第四组小鼠12。初敏22周后，处死小鼠，用Elispot测定每106脾细胞中肺炎链球菌特异性B细胞的数量。
图5α-GalCer增强抗MenC-CRM偶联物中MenC多糖和CRM蛋白质运载体的特异性抗体应答。用10μg MenC多糖、20μg CRM蛋白质运载体、10μg与CRM蛋白质运载体混合的MenC多糖(MenC+CRM)或30μg MenC-CRM偶联物，或者含α-GalCer的相同组合物初敏野生型小鼠。初敏后2周和4周，用与初敏所用相同的组合物加强免疫小鼠。该图上面一排显示了第二次免疫后1周(1wp2)和第二次免疫后2周(2wp2)用单独的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶联物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶联物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的MenC特异性Ig滴度。该图的第二排显示了第二次免疫后2周(2wp2)和第三次免疫后2周(2wp3)用单独的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶联物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶联物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的CRM-特异性Ig滴度。
图6α-GalCer增强对Men A-CRM偶联物的免疫应答。用10μg MenA多糖或MenA-CRM偶联物与或不与α-GalCer组合免疫小鼠。在初敏后4天、8天和12天测定抗MenA多糖的抗体滴度，α-GalCer增强了对MenA多糖的免疫应答。
图7用α-GalCer和MenC-CRM偶联物免疫的小鼠中抗体应答增强。用30μgMenC-CRM偶联物与PBS(黑色)或α-GalCer的混合物免疫小鼠。各组小鼠免疫三次。在第二次免疫后1周(1wp2)和第三次免疫后1周(1wp3)测定MenC特异性滴度。
图8α-GalCer诱导对肺炎链球菌多糖反应的抑制需要未变异的NKT细胞。在A)野生型小鼠、B)Ja18-/-小鼠、C)mCD1d-/-小鼠和D)mCD1d-/+小鼠中，比较仅用3.5μg SP(灰色标识)或3.5μg SP和0.1μg α-GalCer(黑色标识)初敏小鼠后4天、8天和12天，肺炎链球菌特异性抗体的水平。与用Streptopur与α-GalCer组合免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，仅用Streptopur免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的抗体滴度没有显著性差异。
图9未变异的NKT细胞对肺炎链球菌多糖的抗体应答有负调节作用。比较了按照图1B所示方案仅用Streptopur初敏后4天、8天和12天小鼠的肺炎链球菌-特异性抗体(IgM滴度，几何平均数)水平。图9A比较了C57野生型小鼠的抗体滴度(方形)与C57mCD1d+/-小鼠的抗体滴度(三角形)。图9B比较了C57野生型小鼠的抗体滴度(方形)与C57mCD1d-/-小鼠的抗体滴度(三角形)。图9C比较了C57野生型小鼠的抗体滴度(方形)与C57Ja281-/-小鼠的抗体滴度(圆形)。野生型小鼠的抗体滴度低于Ja18-/-、CD1-/-和CD1+/-小鼠。
图10在3-8周龄小鼠中，α-GalCer抑制对Streptopur的免疫应答。仅用3.5μgStreptopur(SP)(白色)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(黑色)使2周龄(2W)、3周龄(3W)、4周龄(4W)、5周龄(5W)和6-8周龄(6-8W)的小鼠初敏后8天，比较肺炎链球菌特异性IgM抗体(几何平均数)水平。
图11用α-GalCer和Hib-HSA偶联物免疫的小鼠中抗体应答增强。用15μgHib-人血清白蛋白(Hib-HSA)偶联物与PBS(结果太低，以致于不能检测到)、α-GalCer(阴影)或MF59(灰色)的混合物免疫小鼠。各组小鼠免疫三次。在第二次免疫后1周(1wp2)和第三次免疫后1周(1wp3)测定Hib-特异性滴度。
实施本发明的方式实施例1α-GalCer抑制对糖抗原的免疫应答用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer、3)3.5-10μg获自肺炎链球菌的23种不同血清型的23种多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5-10μg Streptopur和0.1μg α-GalCer免疫四组(每组五只)六周龄雌性小鼠(品系C57BL/6)。用100μl体积进行肌肉内免疫。所有四组小鼠在12周后用3.5-10μg Streptopur加强免疫。免疫方案见图1A。
初敏后4天、8天和12天和加强免疫后4天、8天和12天，将小鼠放血，用ELISA测定血液中肺炎链球菌特异性抗体的水平。与仅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠显示出肺炎链球菌特异性抗体滴度降低(图2和3)，特别是给予第一个剂量之后(图3A)，这表明α-GalCer抑制对糖抗原的免疫应答。
18-22周后，处死小鼠并用Elispot测定其脾脏中肺炎链球菌特异性B细胞的数量。与用PBS初敏并用Streptopur加强的小鼠脾脏相比，用α-GalCer初敏并用Streptopur加强的小鼠脾脏中肺炎链球菌特异性B细胞的含量也较少(图4)。这些结果都提示，α-GalCer抑制对糖抗原的免疫应答。
进行进一步实验，以评价在Streptopur和α-GalCer免疫的小鼠中观察到对肺炎链球菌多糖较低的抗体应答是否需要未变异的天然杀伤T细胞。用1)PBS、2)0.1μgα-GalCer、3)3.5μg Streptopur(SP)或4)3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer，免疫四组六周龄雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl体积进行肌肉内免疫。初敏后4天、8天和12天将小鼠放血，用ELISA测定血液中肺炎链球菌特异性抗体的水平。免疫方案见图1B。
与仅用Streptopur初敏的CD57L/6野生型小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠显示出肺炎链球菌特异性抗体滴度降低(图8A)，这验证了α-GalCer抑制对肺炎链球菌糖抗原的免疫应答。
相反，与仅用Streptopur初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，用Streptopur与α-GalCer初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的肺炎链球菌-特异性抗体滴度没有显著性差异(图8B-D)。这些结果提示，α-GalCer-诱导的对肺炎链球菌糖应答的抑制需要未变异的NKT细胞。
与仅用Streptopur初敏的JA218-/-、CD1d-/-和CD1d-/+的抗体滴度相比，仅用Streptopur而不用α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠的肺炎链球菌-特异性抗体滴度较低(图9)。这些结果提示，即使在没有α-GalCer的情况下，未变异的NKT细胞可能对肺炎链球菌糖的抗体应答有负面作用，在α-GalCer存在下进一步加强此负面作用。
进一步实验证明，也在6-8周龄的小鼠中观察到，α-GalCer抑制对糖抗原的免疫应答(图10)。
实施例2a-GalCer能增强对糖抗原偶联物的免疫应答与α-GalCer和肺炎链球菌的糖抗原(Streptopur)一起给予时观察到抗体滴度降低相反，给予α-GalCer增强对偶联于运载体蛋白的糖抗原的抗体应答。
用Hib-人血清白蛋白偶联物(Hib-HSA)和α-GalCer免疫的小鼠显示出的Hib-特异性Ig滴度比用Hib-HSA偶联物和PBS免疫的小鼠高很多(图11)。相似地，与用MenC-CRM偶联物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶联物和α-GalCer免疫显示出MenC-特异性Ig滴度显著增加(图7，按照图1C方案进行免疫)。
如图5所示，虽然在仅用MenC免疫的小鼠中未曾观察到对MenC的抗体应答，但与用MenC-CRM偶联物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶联物和α-GalCer免疫的小鼠显示出MenC特异性抗体滴度显著增加。混合α-GalCer与偶联物增强了对糖和偶联物的抗体应答。
用MenA-CRM偶联物和α-GalCer进行免疫也导致MenA特异性Ig滴度增加(图6)。然而在同时进行的实验中，没有观察到α-GalCer对未偶联MenA糖的强烈抑制作用。
总之，虽然α-GalCer可抑制对糖抗原的免疫应答，但这种效果可被逆转，如果糖抗原偶联于运载体，可用α-GalCer增强对糖抗原的免疫应答。
应理解，仅以举例的方式描述本发明，可在不背离本发明构思和范围的情况下对详细内容进行修改。
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权利要求
1.一种组合物，其包含(a)偶联于运载体的糖抗原；和(b)α-糖基神经酰胺佐剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述α-糖基神经酰胺佐剂是α-半乳糖基神经酰胺。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述α-半乳糖基神经酰胺是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述糖抗原是细菌荚膜糖。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述细菌荚膜糖来自脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其包含一种以上糖偶联物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述运载体是蛋白质。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述运载体是细菌毒素如白喉类毒素或破伤风类毒素。
9.用于药物的偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂。
10.一种在患者中产生免疫应答的方法，其包括给予患者偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，同时、依次或分别给予所述糖抗原偶联物和α-糖基神经酰胺佐剂。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述免疫应答用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌引起的疾病(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎、心包炎、脑膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、肺炎等)。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗细菌性脑膜炎。
14.偶联于运载体的糖抗原在制造用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用，其中所述药物与α-糖基神经酰胺佐剂一起给予。
15.α-糖基神经酰胺佐剂在制造用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用，其中所述药物与偶联于运载体的糖抗原一起给予。
16.偶联于运载体的糖抗原和α-糖基神经酰胺佐剂在制造用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用。
17.偶联于运载体的糖抗原在制造用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用，其中患者经α-糖基神经酰胺佐剂预治疗。
18.α-糖基神经酰胺佐剂在制造用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用，其中患者经偶联于运载体的糖预治疗。
19.如权利要求14-18中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌引起的疾病(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎、心包炎、脑膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、肺炎等)。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗细菌性脑膜炎。
21.一种药盒，其包含(a)偶联于运载体的糖抗原；和(b)α-糖基神经酰胺佐剂。
全文摘要
本发明提供了含有以下组分的组合物和药盒(a)偶联于运载体的糖抗原；和(b)α－糖基神经酰胺佐剂。本发明还提供了利用该组合物进行治疗的方法。已发现，可通过将糖偶联于运载体逆转α－糖基神经酰胺对抗－糖免疫应答的抑制。
文档编号A61K39/39GK101035546SQ200580034409
公开日2007年9月12日 申请日期2005年9月7日 优先权日2004年9月7日
发明者G·盖利 申请人:启龙有限公司