专利名称：一种肠道病毒检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一种肠道病毒检测试剂盒，尤其涉及一步法四重荧光定量RT-PCR在同一个反应管内同时检测患者粪便或者咽拭子标本中CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒核酸检测方法，可应用于CoxBl、 CoxB2、CoxB3和肠道病毒引起的暴发疫情的实验室应急诊断及临床诊断。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CV)是由 Dalldoff 和 Sickles 于 1948 年首次从纽约市柯萨奇镇的一名类脊髓灰质炎患者的粪便中分离得到。它属小RNA病毒科的肠道病毒属(enteroviruses),对乳鼠的敏感性很高,根据它们感染乳鼠产生的病灶不同,柯萨奇病毒可以分为A、B两组。其中A组有23型病毒，B组有6型病毒。1956年Javett首次报道病毒性心肌炎(viral myocardit, VMC)主要由柯萨奇病毒引起。心肌炎是一种心肌局灶性或弥漫性病变，其特征为间质性炎性细胞浸润， 心肌坏死及变性。心肌炎与多种病毒及发病因素有关。病毒的直接作用和机体的免疫反应是病毒性心肌炎的主要发病机制，临床上以病毒性心肌炎最多见。临床上病毒性心肌炎最常见的发病方式为一般型，发病前1-2周常有肠道或呼吸道感染史，如腹泻、感冒等，然后出现乏力、面色苍白、精神不振、胸闷气短等症状，检查可发现心脏扩大，心律不齐或早搏等心脏异常体征。另外暴发型和隐匿型对患儿的威胁最大，必须引起重视。目前对病毒性心肌炎的临床诊断，主要依靠临床症状及常规生化检查和心电图，血生化检查中最常用的指标是心肌酶谱和心肌肌钙蛋白。但是由于病毒性心肌炎发病初期的症状不典型，往往出现临床症状时已经累及心肌，引起心肌不可逆的损伤，造成严重后果。另外，医院内感染越来越受到重视，一巳发生院内感染的爆发，后果无疑是非常严重的。因此，早期、及时、准确的诊断病原刻不容缓。传统的诊断病毒感染的方法主要是病毒分离和血清学方法。病毒分离操作复杂， 耗费时间长，容易导致污染，不便于临床应用。在临床病原学诊断上，常规的血清学方法检测抗体仅是一个反映感染的间接指标，不能替代直接的病原学检测，无法明确诊断感染病毒的种类。实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、可以实时定量，并且有效解决了扩增产物污染等优势，克服了以往临床传统诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床病原诊断提供了一种有效、快速的检测手段。随着技术的改进及方法的不断完善，此技术已越来越多地应用于临床各科室，为临床诊断提供了准确、及时、高效的实验室依据。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。本发明采用的单管一步法四重荧光定量RT-PCR，不仅能够同时检测CoxBI、CoxB2、 CoxB3以及其他肠道病毒，同样具备较高的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠道病毒检测试剂盒，是一种一步法四重荧光定量 RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、弓I物探针混合液、标准品 (CoxBU CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、阳性对照品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、阴性对照品，盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、标准品管(CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、阳性对照品管(CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、 阴性对照品管。其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等、引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，且引物探针混合液管为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为CoxBl、CoxB2、 CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品。
测用上游引物_下》引《3队具相fi的特异性擇针评列如下=
上翻tt Co^l-F: 5、CACTCACGGTCCGAiffCRTCCA-y
CoxEUR y-TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGT<3GCJff-3，
持异性探针 Co54Bl-P 5' -FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3’
上勝引物 G :B2-F' S1-GATCAGCATGTGTGTTrTACACGA^r
下齡引_ Coy32-R: 5*-GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA-3*
ft 昇性探针 C xB21. 5\CY5-TACACCAACAGCAAAAJffGCAGCCAA-BHQ2-3'
上—引CoxBS-F^ St-CCAGTAMCAGATAAAGTCGiffTCRTA-S1 了勝引W CokB3-R: S-AGGAARGGTATEGACATGCGTd
浦性腿 CoxBB-P S^HEX-CCAAGTGTCTTCTCtGACAGACtGGTAATGC-BHQ I- J J游引_RiI婦毒-F: 5'- CCCTGAATGCGGCTAAtCC-T 下—■丐陳藤道病釋-Rj 5’，.ATTGTCACCiffAAGCAfiOU 待异性探针ISiI病莓-P: .1DX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC.BHQ2.上述标准品包括CoxBl、CoxB2、CoxB3及肠道病毒标准品，其保守区基因序列如下CGGTCCGAiff
CTATGCCACA
TGTCTGTHT
GAAGTTTGCG
ATAAAGTGGA
TGGACAGAGG
TGG
fXGCmMVC
TCGTAACGGG
TCCTTTTATC
CGTCCiaTGA
TACACCAATA
ACACGACATA
ACATGGAAGG
TfCKTKTGlA
GTAMGCACC
CAACTGCGGA TAACTCTGCA TTTStATTG G
AAATTTCCTG
ACTCAGAAAA
CACCAACAGC
TGAGTGTTAG
TGGCAAACTT
ACCACGCATG
GCACACc3CCC
GCGGAACCGA
CTGCTTMOG
CoxBl 序列 ACGTGAAAAA CTACCACTCA TGCCGGTCTG CCTGTGTiffA GGGGTTTGCA G AG 了 GG<JTTA 标Itfi序列为s ATTTCCTTGC ACGMCAGCA AAAAATGCAG CCAJJtGAAAA ACAGGCTGCA CAACTGA CoxBS标*SS序/_丨为I ACCAGGGGGT CCAGTACCAG CCACGAACCC AAGTGTGTTC TCC 織 CCTT TCCTGAGCiff . 痛脅标権Sff.列为-AGTCCTCCGG CCCCTGAATG ACAACfCCAGC GCiOTACtTGTG CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TGACAATTAA AGAATT
本发明提供的荧光定量试剂盒需于_20°C储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。本发明的另一个目的是提供上述的一种肠道病毒检测试剂盒在检测CoxBl、 CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒中的应用。本发明试剂盒的使用方法在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用高温高压灭菌的DEPC水稀释为IXIO3-IXiO8 Copies/ml O粪便样品核酸的提取取0. 2g或200 便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置lOmin，以SOOOiVmin离心5min。吸取200 0上清加入到 EP 管中，米用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction Kit II 或 QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini KU，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。核酸的检测取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25吣其中定量RT-PCR反应液12 5|11，酶混合液I 4，引物探针混合液(20umol/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种种荧光探针)共6 0，模板5 0，加水补足至25 M^lo在ABI7500荧光定量PCR仪(或者其他四色荧光以上的PCR仪)上进行检测，反应参数为反转录50°C， 30min ；95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40 个循环。荧光定量结果报告①CoxBl、CoxB2. CoxB3及肠道病毒检测的各自Ct值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本Ct值为40、0和无数值时，报告为阴性。②检测样本Ct值 < 35时若肠道病毒Ct值< 35，同时CoxBl或CoxB2或CoxB3病毒的Ct值< 35，报告为 CoxBl或CoxB2或CoxB3阳性；单独肠道病毒Ct值< 35，报告为肠道病毒阳性。③检测样本Ct值> 35且小于40的样本，建议复检，复检结果Ct值< 37者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本各种病毒的量(Copies/ml)。
本发明的有益之处是运用一步法四重荧光定量RT-PCR技术，采用CoxBl、CoxB2、 CoxB3和肠道病毒高度特异的引物和荧光标记探针，开发研制用于CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从标本中同时检测出CoxBl、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量 PCR方法更简便、快速；尤其对属于肠道病毒属的CoxBl、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，对临床上疑似肠道病毒感染的患儿，特别是小儿病毒性心肌炎患儿提供早期明确诊断，区分病毒感染的种类及滴度，为临床治疗方案的制定提供参考依据。
图I为本试剂盒结构示意图。图2为本试剂盒同时检测四种病毒阳性的实例。图3为本试剂盒检测CoxBl病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为IO8UO7UO6, 105、104、103 Copies/ml。图4为本试剂盒CoxBl病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度(Copies/ml)的对数值，纵坐标为Ct值。图5为本试剂盒检测CoxB2病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、106、 105、104、103 Copies/ml。图6为本试剂盒CoxB2病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度(Copies/ml)的对数值，纵坐标为Ct值。图7为本试剂盒检测CoxB3病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、106、 105、104、103 Copies/ml。图8为本试剂盒CoxB3病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度(Copies/ml)的对数值，纵坐标为Ct值。图9为本试剂盒检测肠道病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、106、105、 104、103 Copies/ml。图10为本试剂盒肠道病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线，其中横坐标为标准品浓度(Copies/ml)的对数值，纵坐标为Ct值。
具体实施例方式下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例I
参见图I，一种肠道病毒检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、阳性对照品(CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒)、阴性对照品，盒体7设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管I、酶混合液管2、引物探针混合液管3、阴性对照品管4、标准品管5 (包括CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒标准品， 共4管)、阳性对照品管6 (包括CoxBl、CoxB2、CoxB3、肠道病毒阳性标准品，共4管)。其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等、引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，且引物探针混合液管为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为CoxBl、CoxB2、 CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品。本发明提供的荧光定量试剂盒需于_20°C储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。实施例2
I.材料与方法
I.I临床标本与病毒核酸
CoxBU CoxB2、CoxB3和肠道病毒的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、湖州市中心医院以及浙江省内其他几家医院近期患者的粪便或咽拭子标本，样本采集后运送到实验室。阳性核酸均通过基因测序确认。I. 2引物与探针
从美国的NCBI基因库下载了涵盖国内外CoxBl、CoxB2、CoxB3以及肠道病毒的多条基因序列。利用DNAMAN软件对其进行了同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用 Primer Express 3. 0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针、引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下，
上游獅 CosBl-F 5' - CACTCACGGTCCGAiffCRTCCA-B*
下網 _ Crnm -Ri 5 * - mYTGACiTTR.TTRGTtiTATGTGGCiff-3*
待异性探针 CoxBl-P 5*-FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3*
Jlll弓 Bi C&A2-F. 5LGATC；AGCATGTGTGTTrTACACGAl TI#猶 cokB2-r. Si-Gcctgtctaacactcaccttcca-S*
待异性擇针 € :B2^P. 5' -CY5^TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCiy^BHQ2冊3*
上游引物 Co B3.F 5' -CCAGTAMCAGAmAAGTGGiTTClTA-3f 下+游弓 Cc.a3-R 5-AGGAARGGTATRG農CATGCGTG-y
待异性探针 CosB3-P| y-HE3C-CCAA<3TGTGTTCTCIGACAGAG03mATGC%BHQl-3’
上游弓_臟講*F 5'. CCCTGAATGCGGCTAATCC-3'
不游引廳澧鑕霉-R y- ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'
待异性Ii针IiiI綉毒-P. 5*-ROX-AACCGACTACTTTGGCTGTCCGTGTTTC--BHQ2-3*
以上引物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司和上海生工生物工程有限公司合成。I. 3病毒核酸的提取与标准品定量标准
取0. 2g或200叫粪便样本加到EP管中，加入I. 5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次 10s，然后室温静置IOmin,以8000r/min离心5min。吸取200叫上清加入到EP管中，采用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction Kit II 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini KU，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。合成各病毒基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMD19-T Simple Vector (TaKaRa公司)。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。I. 4四重荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化
反应总体积为25叫，其中定量RT-PCR反应液12. 5 |ll，酶混合液I叫，引物探针混合液(20i!mOl/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种种荧光探针)共6屮，模板5叫， DEPC水补足至25 |11。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为反转录50°C， 30min ；95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40 个循环。结果判断选择荧光检测模式FAM、HEX、ROX、CY5荧光基线选取3_15个循环时的荧光信号，以阈值线稍高于阴性对照品的最高点作为阈值，若样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性；若无典型的扩增曲线，则判断为阴性。体系的优化试验，在以同一浓度阳性核酸作为模板的反应体系中，引物浓度从I 20ii mol/1,探针浓度从I 20ii mol/1,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(△ Rn)选择最佳引物和探针浓度。I. 5四重荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
选择CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)和近期来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、湖州市中心医院以及浙江省内其他几家医院的临床样本提取核酸，用CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒四重荧光定量RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷贝数(Copies/ml)的CoxBl (IO8 Copies/ml)、CoxB2 (IO8 Copies/ml)、CoxB3 (IO8 Copies/ml)和肠道病毒(IO8 Copies/ml) 分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的阳性核酸稀释液作6次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。2 结果
2.I四重荧光定量RT-PCR反应体系及条件
该方法的反应总体积为25叫，其中其中定量RT-PCR反应液12.5叫，酶混合液I 0 引物探针混合液(20i!mOl/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种荧光探针)共bpl ，模板5 M-IjDEPC水补足至25叫。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为反转录50°C，30min ;95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测， 共进行40个循环。可获得最低Ct值和最高荧光强度。2. 2特异性试验
本发明建立的一步法四重荧光定量RT-PCR方法对CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒具有较好的特异性，近期采集的临床标本也检测出阳性反应。CoxBl、CoxB2、CoxB3引物探针与其他病毒如轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均无交叉反应，肠道病毒通用引物探针与以上除EV71、CoxAie肠道病毒的其他病毒均无交叉反应。该方法同时检测四种病毒阳性的结果参见图2，其中I为肠道病毒，2为 CoxB2，3 为 CoxBl,4 为 CoxB3。2. 3敏感性试验
对CoxBl、CoxB2、CoxB3和肠道病毒敏感性检测试验,将已标定拷贝数(Copies/ml) 的 CoxBl (IO8 Copies/ml )、CoxB2 (IO8 Copies/ml )、CoxB3 (IO8 Copies/ml)和肠道病毒 (IO8 Copies/ml)分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测。结果显示该方法检测CoxBl 病毒敏感性为IO3 Copies/ml，结果参见图3，其标准曲线参见图4 ;CoxB2病毒敏感性为IO3Copies/ml，结果参见图5，其标准曲线参见图6 ;CoxB3病毒敏感性为IO3 Copies/ml，结果参见图7，其标准曲线参见图8;肠道病毒敏感性为IO3 Copies/ml，结果参见图9，其标准曲线参见图10。2. 4重复性试验
分别取 CoxBl (终浓度为 IO6 Copies/ml )、CoxB2 (IO6 Copies/ml )、CoxB3 (IO6 Copies/ ml)和肠道病毒(IO6 Copies/ml),按10倍梯度稀释成3个不同的浓度,对每一个浓度的样本作6个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0. 09 0. 28之间，变异系数均低于I. 0%，具有较好的重复性(结果见表I)。
表I BI荧曼定畺FX^PCR检测痛粵核性
权利要求
1. 一种肠道病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合 液、引物探针混合液、CoxBl标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品、CoxBl 阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品，盒 体(7)设有容器孔，分別放置定量RT-PCR反应液管(1)、酶混合液管0)、引物探针混合液 管(3)、阴性对照品管(4)、标准品管(5)、阳性对照品管(6)，标准品管(5)有4管，分別放 置CoxBl标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品，阳性对照品管(6)有4管， 分別放置CoxBl阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品； 其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合 物，酶混合液含耐热iTaq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液含四 种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，引物探针混合液管需为棕色管， 阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸ニ乙酯处理水，阳性对照为CoxBl、CoxB2、CoxB3及肠道 病毒的阳性质粒样品；检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列为上游引物 CoxBl-F :5，-CACTCACGGTCCGAATCRTCCA-3，下游引物 CoxBl-R :5’ -TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT-3，特异性探针 CoxBl-P :5’ -FAM-TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT-BHQ1-3，上游引物 CoxB2-F :5’ -GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA-3’下游引物 CoxB2-R :5，-GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA-3，特异性探针 CoxB2-P :5，-CY5-TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA-BHQ2-3，上游引物 CoxB3-F :5，-CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA-3，下游引物 CoxB3-R 5-AGGAARGGTATRGACATGCGTG-3 ‘特异性探针 CoxB3-P :5’ -HEX-CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC-BHQ1-3’上游引物肠道病毒-F :5，-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3，下游引物肠道病毒 :5，-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’特异性探针肠道病毒-P :5’ -R0X-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3，CoxBl标准品序列为ACGTGAAAAA CTACCACTCA CGGTCCGAAT CGTCCATTGA AAATTTCCTG TGCCGGTCTG CCTGTGTATA CTATGCCACA TACACCAATA ACTCAGAAAA GGGGTTTGCA GAGTGGGTTA CoxB2标准品序列为ATTTCCTTGC ACGATCAGCA TGTGTGTTTT ACACGACATA CACCAACAGC AAAAATGCAG CCAAAGAAAA GAAGTTTGCG ACATGGAAGG TGAGTGTTAG ACAGGCTGCA CAACTGA CoxB3标准品序列为ACCAGGGGGT CCAGTAGCAG ATAAAGTGGA TTCATATGTA TGGCAAACTT CCACGAACCC AAGTGTGTTC TGGACAGAGG GTAATGCACC ACCACGCATG TCCATACCTT TCCTGAGCAT TGG 肠道病毒标准品序列为AGTCCTCCGG CCCCTGAATG CGGCTAATCC CAACTGCGGA GCACACGCCCACAAGCCAGC GGGTAGTGTG TCGTAACGGG TAACTCTGCA GCGGAACCGA CTACTTTGGG TGTCCGTGTT TCCTTTTATC TTTATATTGG CTGCTTATGG TGACAATTAA AGAATT。
2.根据权利要求I所述的一种肠道病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于-20°C，引物探针混合液需避光条件保存。
3.权利要求I所述的一种肠道病毒检测试剂盒在检测CoxBl、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒中的应用。
全文摘要
本发明提供一种肠道病毒检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明根据CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中同时检测出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒，并实时准确定量，尤其对属于肠道病毒属的CoxB1、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。
文档编号C12Q1/68GK102534051SQ20121004794
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者崔大伟, 李兰娟, 谢国良, 陈瑜 申请人:浙江大学