专利名称：病原真菌致病性新基因pcg16及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。
背景技术：
稻痕菌(Magnaporthe oryzae)是子囊菌亚门的真菌,能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，导致瘟病。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10%，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病是我国水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害。稻瘟菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。稻瘟菌的一部分菌丝在生长过程中分化为分生孢子梗。分生孢子梗顶端细胞膨大形成第一个分生孢子，此后， 顶端的极性向一边偏移进而依次产生另外的分生孢子。稻瘟菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。一般5至9个分生孢子以合轴的方式从一个分生孢子梗的顶端产生。分生孢子释放后，在分生孢子梗上留下屈膝状的疤痕。释放后的分生孢子吸附到叶片上，经过萌发形成附着胞，成熟的附着胞内产生与累积膨胀压；然后，附着胞下产生侵染钉直接穿透植物表皮，并在植物细胞内形成侵染性菌丝；最后侵染性菌丝在植物细胞内和细胞间扩展、定植。 稻瘟菌侵染感病寄主时，侵染性菌丝在植物组织内扩展形成直径2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，这些病斑中的侵染菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的冲刷下释放、附着，重新引起植物的再侵染。稻瘟菌从分生孢子附着到分生孢子再产生的周期一般所需时间为3-5天；在植物的生长季节，如果条件适宜，能够多次侵染，造成危害。综上所述，分生孢子的形成是稻瘟菌侵染植物所必需的过程，稻瘟病的严重度与稻瘟菌分生孢子的产生量呈正相关。如果能阻断稻瘟菌的分生孢子形成，就可以控制稻瘟病的发生。
发明内容
本发明的目的是提供病原真菌致病性蛋白Pcgl6及其编码基因PCG16的新用途。 所述蛋白Pcgl6为序列表序列3所不的蛋白质,其编码基因PCG16为序列表序列I中第1991 位至第2530位所示的核苷酸序列。本发明所提供的新用途之一是序列表序列3所示的蛋白质可用于调控稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生,或调节序列表序列3所示的蛋白质表达量的物质用于调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生。实验证明，病原真菌致病性蛋白Pcgl6的表达量降低时，稻瘟菌 (Magnaportheoryzae)分生孢子的产生量减少。基于该实验,本发明提供了一种调控稻痕菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法。所述调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法,包括调控所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。所述调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法具体可为降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法,包括降低所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或降低所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。进一步的实验证明，稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生量减少,所述稻痕菌对寄主植物的致病力减弱。基于该实验，本发明提供一种降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)对植物致病力的方法。该方法包括抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因表达的步骤。本领域技术人员可根据实际需要，通过筛选或鉴定调控所述蛋白质表达量的物质来实现稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生量的调控,最终控制植物稻痕菌病害的发生和危害。下述以稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示的蛋白质或其编码基因为靶点筛选或鉴定植物稻瘟菌杀菌剂的方法均属于本发明的保护范围本发明提供的筛选植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法,包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。本发明提供的筛选植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法,包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质的编码基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质编码基因转录的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。本发明提供的鉴定或辅助鉴定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法，包括如下步骤检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质表达，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3 所示的蛋白质表达，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。本发明提供的鉴定或辅助鉴定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法，包括如下步骤检测待测物质能否抑制稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。下述以物质在制备植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用均属于本发明的保护范围本发明保护具有如下I) -4)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用I)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达；2)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达；3)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录；
4)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录。本发明还保护具有如下5)-8)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用5)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达水平；6)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达水平；7)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录水平；8)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录水平。本发明还保护具有如下功能的物质在制备植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用使序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质失活或使将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质失活。本发明提供一种敲除载体和重组稻瘟菌，所述敲除载体为敲除稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因的重组载体；所述敲除载体具体可按照包括如下步骤的方法得到将序列表序列I的第867位至第1864位核苷酸片段连接到质粒pKNH的BamHI和 EcoRI位点间，并将序列表序列I的第2595位至第3469位核苷酸片段连接到质粒pKNH的 HindIII和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述敲除载体；所述重组稻痕菌为将稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因敲除得到的重组菌，所述重组稻瘟菌具体可通过包括如下步骤的方法得到将所述敲除载体导入所述稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中，敲除所述稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所不蛋白质的编码基因。本发明保护所述敲除载体在敲除稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3 所示蛋白质编码基因中的应用。本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列I中的第I 位至第1990位所示的核苷酸序列。本发明保护所述DNA分子在作为启动子中的应用。实验证明，蛋白Pcgl6的编码基因PCG16被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)置换后得到的敲除体X3产生分生孢子极少，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上不能形成病斑，而 PCG16基因的互补体W6与野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子产生量相同，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上均能形成病斑。更进一步地说，基因PCG16的缺失即蛋白Pcgl6不表达,可导致稻痕菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子产生量减少,对水稻的侵染能力丧失。本发明所提供的方法和应用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意义。
图I为野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131及其突变体CD8069的菌落。其中，左图为野生型稻瘟菌菌株P131的菌落，右图为突变体CD8069的菌落。图2为突变体⑶8069中的T-DNA在PCG16启动子区域的插入位置示意图。其中， 黑色矩形代表外显子，L和R分别代表T-DNA的左边缘和右边缘，Bg和H分别代表BglI和 Hindlll，各位置以PCG16的转录起始位点为基准，T-DNA片段大小为5kb。图3为突变体⑶8069的Southern杂交图。其中，从左至右的泳道依次为HindIII 酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因组、HindIII酶切突变体⑶8069的基因组、BglI酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因组和BglI酶切突变体⑶8069的基因组；第2泳道有杂交信号的条带大小为9. Okb，第4泳道有杂交信号的条带大小为7. Okb。图4为敲除载体pZ2的构建示意图。其中，C、B、E、H、K分别代表限制性内切酶 ClaI、BamHI、EcoRI、Hindi 11、KpnI，hph代表潮霉素磷酸转移酶基因，上方为野生型稻瘟菌菌株P131的基因组片段，下方为敲除载体pZ2的基因片段。图5为PCG16基因敲除体X3的Southern杂交验证。其中，左侧泳道为ClaI酶切的野生型菌株P131的基因组，右侧泳道为ClaI酶切的敲除体X3的基因组，左侧杂交带大小为3，664bp，右侧杂交带大小为7，173bp。图6为PCG16基因的敲除体X3和互补体W6的RT-PCR验证。其中，P131为野生型，X3为PCG16的敲除体，W6为PCG16敲除体X3的互补体，Actin为对照。图7为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌落生长外观。图8为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌落直径大小。图9为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌丝及分生孢子产生量。 其中，A为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的分生孢子梗以及分生孢子产生情况，标尺为50微米；B为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的分生孢子产生量。图10为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6对水稻侵染能力的比较。图11为PCG16的表达情况。其中，左列DIC为相差视野下明视场下拍摄，右列GFP 为荧光视野下暗视场蓝光下拍摄，标尺长度为20微米;A为含有PCG16-GFP融合载体的互补体W6的分生孢子，B为含有PCG16-GFP融合载体的互补体W6的附着胞。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131、pKNH、 pKNTG和水稻(Oryzae sativa)小种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu)与如下文献中所使用的相同，公众可从中国农业大学获得Jun Yang et al. A Novel ProteinComl Is Required for Normal Conidium Morphology and Full Virulence inMagnaporthe oryzae. Mol Plant Microbe Interact. 2010Jan ；23(1) :112-23.实施例I、稻瘟菌PCG16基因的克隆
一、突变体的筛选与鉴定I、分生孢子的制备使用涂菌产孢的方法制备分生孢子，具体方法如下将野生型稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的各根癌农杆菌介导(ATMT) 的转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基平板上，26°C -28°C培养， 当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26°C _28°C光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的稻瘟菌孢子。西红柿汁燕麦片培养基的配制取150ml西红柿汁、30_50克燕麦片煮沸30分钟过滤后的滤液和20克琼脂,用水定容至I升。2、分生孢子产孢量相关突变体的筛选将各ATMT转化体通过步骤I的方法制备得到的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球记数板在显微镜下测定其分生孢子数；并以野生型稻瘟菌菌株P131为对照，筛选产孢量有显著差异的菌，结果获得一个产孢量显著降低的突变体CD8069。取野生型菌株P131和突变体⑶8069各6皿进行产孢量测定，结果发现突变体 CD8069的产孢量显著降低，只有野生型菌株的7% (见表I)，其菌落生长速度较野生型菌株P131也有了明显的下降，为P131的87% (图1)，图I为各菌株在西红柿汁燕麦片培养基平板上活化后，采用打孔器分别挖取大小一致的菌丝块，继续转移到西红柿汁燕麦片培养基板上，28°C培养120小时后照相。表I.突变体与野生型菌分生孢子产量的区别
权利要求
1.序列表序列3所示的蛋白质在调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生中的应用。
2.调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法,包括调控所述稻痕菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。
3.降低稻痕菌(Magnaporthe oryzae)对植物致病力的方法,包括抑制所述稻痕菌中序列表序列3所不蛋白质的编码基因表达的步骤。
4.一种筛选植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法,包括以所述稻痕菌中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤；或，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质编码基因转录的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定植物稻痕菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法,包括如下步骤检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；或，检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。
6.具有如下1)-4)中至少一种功能的物质在制备植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂中的应用.1)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达；.2)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/ 或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达；.3)抑制序列表序列3所不氣基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录；.4)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录。
7.具有如下5)-8)中至少一种功能的物质在制备植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂中的应用.5)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达水平；.6)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达水平；.7)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录水平；8)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且、具有调控稻痕菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录水平。
8.具有如下功能的物质在制备植物稻痕菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂中的应用 使序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质失活或使将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质失活。
9.敲除载体、重组稻痕菌或应用，所述敲除载体为敲除稻痕菌(Magnaportheoryzae) 中序列表序列3所示蛋白质编码基因的重组载体；所述重组稻瘟菌为将稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因敲除得到的重组菌；所述应用为所述敲除载体在敲除稻痕菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因中的应用。
10.DNA分子或应用，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列I中的第I位至第1990 位的核苷酸序列；所述应用为所述DNA分子在作为启动子中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。该基因PCG16表达的蛋白质如序列表序列3所示，该蛋白可用于调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生。实验证明，蛋白Pcg16的编码基因PCG16被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)置换后得到的敲除体X3产生分生孢子极少，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上不能形成病斑，而PCG16基因的互补体W6与野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子产生量相同，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上均能形成病斑。更进一步地说，基因PCG16的缺失即蛋白Pcg16不表达，可导致稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子产生量减少，对水稻的侵染能力丧失。本发明所提供的方法和应用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102586168SQ201210048248
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者左玉山, 张燕, 彭友良, 杨俊 , 王大伟, 赵文生 申请人:中国农业大学