专利名称：一种用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的方法
技术领域：
本发明属于低聚糖的技术领域，涉及蔗果低聚糖的发酵生产方法，具体涉及一种米曲霉全细胞生产蔗果低聚糖的方法。
背景技术：
低聚糖是以2-10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低聚合度的碳水化合物，其中功能性的低聚果糖，又称鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides,缩写为F0S),是由I 3个果糖基通过β_1，2糖苷健与蔗糖结合而生成蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物。FOS具有促进肠道内例如双歧杆菌的增殖，排毒清洁肠道，提高人体免疫力，改善脂质代谢，能预防蛀牙，不被消化道吸收利用等优异性能，现被广泛用于保健食品配料中。目前生产蔗果低聚糖有两种方法:(1)液体深层发酵法；(2)固定化酶法。两种方法各有优缺点。液体深层发酵法需要投入大量的发酵设备及其附属设备，前期投入非常大。液体深层发酵法，利用能分泌果糖基转移酶的微生物，从培养液分离收集菌丝体后，投入到蔗糖溶液中，在一定的条件下转化为F0S。固定化酶的方法，因为固定后的酶容易游离，且底物和产物要不断穿过载体屏障，产率会受到很大的影响。专利号为01128345.9的中国发明专利主要利用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖，先培养出大量的菌丝体，将菌丝体破壁后将酶分离纯化，再将酶与有机高聚物进行交联固定化后，用分批或柱式反应法进行固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖。该方法的不足之处是步骤繁多，酶容易失活，转化率低，由于蔗糖和转化后的产物要穿过固定化的颗粒，传质均匀性受到限制。由于酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体结构环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法反应成本较高，这些方面均严重制约了其的工业化应用。固定化细胞法，即用海藻酸钙凝胶将产酶菌体包埋起来的方法，该法不足之处是对生产环境和条件要求苛刻(例如空气净化)。
发明内容
本发明针对现有蔗果低聚糖转化的酶制剂及其工艺上的不足，经过多年攻关和探索，目的在于提供一种用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的方法。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化。这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:一种用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的方法，包括以下步骤:(2)米曲霉全细胞催化剂的制备；(2)利用米曲霉全细胞催化剂生产蔗果低聚糖。包括如下步骤:第一步:将米曲霉孢子接种到液体种子培养基中，接种量为I X IO5 101°个/L，于25_35°C,转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液为种子液；
第二步:以体积比为5 10:100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25°C 35°C，转速为100r/min 300r/min的条件下培养16 24h后的菌体溶液为全细胞菌体溶液；第三步:收集第二步所得的全细胞菌体溶液，用无菌的200目 400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、脱水干燥去除水分，得到具有转化活性的全细胞。第四步:以重量体积比为flO:100 (m/V)的比例，将第三步所得的全细胞FOS酶至于反应体系中，于pH5.0-7.5、温度45°C 55°C和转速为100r/min 300r/min的条件下进行转化24h 48h。第五步:反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。利用高压色谱法检测反应体系中蔗果低聚糖的含量，所得的蔗果低聚糖总量在50%以上。所述的液体种子培养基为；20g/L 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麦芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L 100g/L的酵母提取物或其中两种，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/LNaN03或其中的两种。所述的产酶诱导剂包括糖类化合物、无机盐(K2HPO4, MgSO4.7H20、NaNO3)、酵母膏中的两种或二种。所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:10g/L 70g/L鹿糖，15g/L 55g/L玉米粉，20g/L 50g/L酵母提取物，Og/L 12g/L K2HP04，Og/L 1.5g/L MgS04.7H20，3g/L lOg/L NaN03。所述米曲霉是指由米曲霉CICC2134(Asperrgilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)。所述洗涤为用NaCl生理盐水溶液。第三步采用真空冷冻干燥或真空干燥的方法去除水分，得到具有转化活性的全细胞FOS酶。所得到的全细胞是能将蔗糖转化为蔗果低聚糖。第四步采用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列缓冲液调节反应体系的pH为5.0-7.0。所述的反应体系是重量百分比为40%_60% (w/w)的蔗糖溶液。本发明与现有的技术相比具有如下的优点:(I)本发明制作方法简单，不涉及到酶的繁杂分离纯化的过程，简化了设备的投资。(2)米曲霉所需要的营养低，易培养，易操作，制作工艺简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步骤。(3)简化了蔗果低聚糖的生产工艺，直接将全细胞投入到反应液中，减少了液体深层发酵培养中发酵罐及其附属设备的投入。(4)将全细胞FOS酶投入到FOS的反应体系中，所得的FOS糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中总低聚糖的含量> 50%的FOS糖浆，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。
图1为本发明 实施例1中利用米曲霉全细胞制备蔗果低聚糖的高效液相色谱图
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。实施例1第一步将米曲霉CICC 2134(Aspergilusoryzae2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为1父105个/1，于331:，转速为150r/min的摇床上培养16h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取粉，2g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步:以体积比为5:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于33°C，转速为150rpm的摇床上培养24h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步:收集第二步所得的全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的全细胞。第四步:以重量体积比为1:100 (m/V)的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞FOS酶至于反应体系为重量百分比为50% (w/w)的鹿糖溶液中,将反应体系pH调为5.0、于温度为45°C和转速为150r/min的条件下进行转化24h。第五步:反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。 根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中中的方法，利用高压色谱法检测反应体系中蔗果低聚糖的含量，如图1所示，蔗果三糖、四糖和五糖的出峰时间分别为13.441min、18.314min和25.015min，百分比分别为26.08%,25.92%和4.81%，所得的蔗果低聚糖总量为56.81%,果糖、葡萄糖和鹿糖的出峰时间分别为6.908min、7.552min和9.248min,百分含量分别为4.76%,24.69%和13.74%。本发明制作方法简单，不涉及到酶的繁杂分离纯化的过程，简化了设备的投资。米曲霉所需要的营养低，易培养，易操作，制作工艺简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步骤。简化了蔗果低聚糖的生产工艺，直接将全细胞投入到反应液中，减少了液体深层发酵培养中发酵罐及其附属设备的投入。将全细胞投入到FOS的反应体系中，所得的FOS糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中总低聚糖的含量^ 50%的FOS糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖的非强制性标准，整个工艺简单，操作方便,生产成本明显降低。实施例2第一步将米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为I X IOltl个/L，于28°C，转速为100r/min的摇床上培养24h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:50g/L蔗糖，7g/L麦芽粉，10g/L蛋白胨，3g/L的NaCl ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步:以体积比为10:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于28°C，转速为IOOrpm的条件下培养16h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:70g/L蔗糖，35g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，12g/L K2HPO4,1.5g/LMgS04.7H20,10g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步:收集第二步所得的全细胞菌体溶液，用无菌的400目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的全细胞。第四步:以重量体积比为1:100的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞FOS酶至于反应体系为重量百分比为60%的鹿糖溶液中，将反应体系pH调为6.0、于温度55°C和转速为200r/min的条件下进行转化24h。第五步:反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法检测，所得蔗果低聚糖(FOS)总量为54.30% (重量百分比)。实施例3第一步将米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为1父106个/1，于251:，转速为120r/min的摇床上培养20h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:30g/L蔗糖，5g/L麦芽粉，7g/L蛋白胨，50g/L的酵母提取物，1.5g/L NaCl, 1.5g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为8:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于25°C，转速为300rpm的摇床上培养20h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:10g/L蔗糖，50g/L酵母提取物，20g/L玉米粉，6g/LK2HPO4,0.5g/LMgS04.7H20，6.5g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步 所得的全细胞菌体溶液,用无菌的300目的滤布过滤,用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的全细胞。第四步以重量体积比为5:100 (m/V)的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞至于反应体系为重量百分比为40% (w/w)的鹿糖溶液中，将反应体系pH调为7.5、于温度50°C和转速为300r/min的条件下进行转化36h。第五步反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法检测，所得蔗果低聚糖(FOS)总量为54.92% (重量百分比)。实施例4第一步将米曲霉CICC 2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为1父107个/1，于351:，转速为200r/min的摇床上培养18h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:40g/L蔗糖，10g/L玉米粉，3g/L麦芽粉，5g/L蛋白胨，70g/L酵母提取物，2g/L NaCl，1.0g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为7:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于30°C，转速为200r/min的条件下培养18h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:50g/L蔗糖，40g/L酵母提取物，55g/L玉米粉，3.5g/L K2HPO4,0.8g/LMgS04.7H20，5.5g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的全细胞菌体溶液，用无菌的250目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的全细胞。第四步以重量体积比为8:100 (m/V)的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞酶制剂至于反应体系为重量百分比为55% (w/w)的鹿糖溶液中中，将反应体系pH调为
7.0、于温度48°C和转速为100r/min的摇床上进行转化30h。第五步反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法检测，所得蔗果低聚糖(FOS)总量为53.47% (重量百分比)。实施例5第一步将米曲霉CICC 2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为1父108个/1，于301:，转速为300r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:45g/L蔗糖，20g/L玉米粉，7.5g/L蛋白胨，60g/L酵母提取物，1.2g/LNaCl, lg/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为9:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于35°C，转速为250r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:45g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，35g/L玉米粉，9.0g/L K2HPO4,1.0g/LMgS04.7H20，5.0g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得 的全细胞菌体溶液，用无菌的350目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的全细胞。第四步以重量体积比为7:100 (m/V)的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞FOS酶至于为重量百分比为53% (w/w)的蔗糖溶液中，将反应体系pH调为5.5、于温度47°C和转速为250r/min的条件下进行转化40h。第五步反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法检测，所得蔗果低聚糖(FOS)总量为50.57% (重量百分比)。实施例6第一步将米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)的孢子接种到液体种子培养基中，接种量为1\109个/1，于291:，转速为180r/min的条件下培养22h后的菌体溶液制成种子液；所述液体种子培养基配方为:35g/L蔗糖，15g/L玉米粉，5g/L麦芽粉，8g/L蛋白胨，1.0g/LNaCl, 1.2g/LNaN03 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为6:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体培养基中，于29°C，转速为160r/min的摇床上培养24h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为:60g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，30g/L玉米粉，
9.0g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的全细胞。
第四步以重量体积比为9:100 (m/V)的比例，将第三步所得的蔗果低聚糖的全细胞酶制剂至于反应体系为重量百分比为50% (w/w)的鹿糖溶液中,将反应体系pH调为5.3、于温度52°C和转速为180r/min的条件下进行转化45h。第五步反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法检测，所得蔗果低聚糖(FOS)总量为55.11% (重量百分比)。本发明米曲霉全细胞催化剂制备及利用其生产蔗果低聚糖的工艺流程如下: 米曲霉孢子一种子活化液体培养基一种子活化菌液一酶诱导液体培养基一菌丝体一收集菌体一过滤一洗涤一过滤一真空冷冻干燥一米曲霉全细胞一反应液一FOS糖浆—浓缩一成品。
权利要求
1.一种用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤: (i )米曲霉全细胞催化剂的制备；(2 )利用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述米曲霉全细胞的制备，包括如下步骤: (1)将米曲霉孢子接种到液体种子培养基中，接种量为IX IO5个/L 101°个/L，于25V -35°C,转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液为种子液； 所述的液体种子培养基的配方为:20 50g/L鹿糖，3g/L 7g/L麦芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L 100g/L的酵母提取物或其中两种，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/L NaNO3或其中的两种；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用； (2)以体积比为5 10:100的比例，将第一步所得的种子液接种至产酶诱导剂的液体发酵产酶培养基中，于25°C 35°C，转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液制成全细胞菌体溶液； (3)收集(2)所得的全细胞菌体溶液，用无菌的200目 400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、干燥去除水分，得到具有转化活性的全细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的种子液体培养基为:20 50g/L蔗糖,3g/L 7g/L麦芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L IOOg/L的酵母提取物或其中两种，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/L NaNO3或其中的两种。
4.根据权利要 求1、2所述的方法，其特征在于，所述的产酶诱导剂包括蔗糖、淀粉、无机盐(K2HPO4、MgSO4.7H20、NaNO3)和酵母提取物中的两种或三种或四种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含产酶诱导剂的液体培养基:10g/L 70g/L 鹿糖，15g/L 55g/L 玉米粉,20g/L 50g/L 酵母提取物,0g/L 12g/L K2HPO4,0g/L 1.5g/L MgSO4.7H20，3g/L 10g/LNaN03。
6.权利要求1或2或3或4或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述洗涤为用NaCl生理盐水溶液。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的步骤如下: (I)以重量体积比为I 10:100的比例，将第三步所得的全细胞FOS酶至于FOS反应体系中，于PH5.0-7.5，温度45°C 55°C，转速为100r/min 300r/min的条件下进行转化24h 48h ； 第(2)反应完成后，用板框过滤器过滤反应液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。利用高压色谱法检测反应体系中蔗果低聚糖的含量，所得的鹿果低聚糖总量在50%以上。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的方法，其特征在于，所述米曲霉是指米曲霉CICC2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址:北京市朝阳区霄云路32号，邮编:100027)。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列缓冲液调节反应体系的 pH 为 5.0-7.0。
全文摘要
本发明公开了一种用米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖的方法，它包括两部分(1)全细胞催化剂的制备，是将米曲霉孢子接种至种子培养基中，在一定的条件下制成种子液，再将种子液接种至产酶诱导剂的液体发酵产酶培养基中，在一定条件下制成全细胞菌体溶液；收集菌体，菌体经过200-400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、真空冷冻干燥后制成米曲霉全细胞；(2)利用上述的米曲霉全细胞催化生产蔗果低聚糖，在一定条件下进行转化，转化结束后的所得的糖液经过过滤和真空浓缩得到蔗果低聚糖糖浆。本发明得到的产品经高压液相色谱法检测，固形物中总低聚糖的含量≥50%，本发明的工艺简单，操作方便，酶活性高，转化效率高，具有重要的工业价值。
文档编号C12R1/69GK103194506SQ20121055211
公开日2013年7月10日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者刘冬梅, 周康, 范梦柯, 叶嘉伦, 韦健军, 周伟文, 韦胜军 申请人:中山市比克生物科技有限公司