专利名称：鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别欧洲牛肝菌近缘种Boletus appendiculatus与B.pseudoregius的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B. pseudoregius进行快速辨别的方法。
背景技术：
隶属牛肝菌目Boletales 下 Boletus 属的 Appendiculati Konrad & Maubl.ex Lannoy & Estades 类群包括了 Boletus appendiculatus Schaeff. : Fr.、B.subappendiculatus Dermek, Lazebn. & J. Veselsky> B. fechtneri Velen.、B.pseudoregius (Huber) Estades 和 B. regius Krombh.五个 Boletus 近缘种。这五个近缘种均起源于欧洲，其共同特征为子实体的菌柄上或多或少有网纹，全菌柄呈一致黄色，菌管和菌孔经常变蓝；菌肉变蓝或不变蓝，但口尝总具温和口感；许多种在菌柄基部呈些许粉红色彩。对近缘种B. appendiculatus与B. pseudoregius标本辨别的典型特征是B.appendiculatus的菌盖颜色为浅色到深褐色,不带有粉红色彩。而B. pseudoregius的菌盖颜色为粉红色、暗红色、或带有粉红、淡红色彩的米色到赭黄色。宏观上的菌盖颜色差异是辨别这二个近缘种的唯一特征。但由于颜色差异易受生境、气候、土壤、子实体生长期、生理状况等的影响而常常导致主观判别上的偏差，而对于长期保藏的干标本，特别是对古老标本、模式标本的重新鉴别研究，仅凭颜色差异更是难以准确鉴定。因此，在大型真菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助鉴定的重要手段。真菌核糖体基 因rRNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)的保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这一特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。对B. appendiculatus和B. pseudoregius的ITS区测序数据显示，B.appendiculatus 和 B. pseudoregius 的 ITS1-5. 8S-1TS2 序列长度均为 600 690 bp,很难利用通用引物对(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别。对二个种的ITS序列比对显示二者的局部序列存在较大差异，这为设计ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，以方便用于这二个近缘种的分子辅助鉴定提供了可能性。
发明内容
本发明目的是提供一种可鉴别欧洲牛肝菌近缘种B. appendiculatus和B.pseudoregius的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B. pseudoregius进行快速鉴别的方法。本发明采用的技术方案是一种鉴别欧洲牛肝菌Boletus appendiculatus和B. pseudoregius的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下
上游引物5'-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3'下游引物5'-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3'该引物对是采用PCR技术，经过对欧洲牛肝菌标本B. appendiculatus和B.pseudoregius的核糖体基因rRNA的ITS区序列的克隆测序，以得到的ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计ITS特异性引物对。以该引物对对B. appendiculatus和B.pseudoregius进行PCR扩增，可从B. pseudoregius中获得481 bp大小的特异性片段。本发明还涉及所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus 和 B. pseudoregius 中的应用。本发明还涉及一种利用所述分子特异性标记引物鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B. pseudoregius的方法,所述方法包括提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. pseudoregius,若电泳结果未出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. appendiculatus ；所述分子特异性标记引物序列为上游引物5'-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3'下游引物5'-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3'所述方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B. pse udoregius的鉴别，即待测标本是限定为欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus和B. pseudoregius的范围内的,本领域普通技术人员可根据子实体形态特征和颜色先进行初步的判断,再将判断为B. appendiculatus或B. pseudoregius的牛肝菌标本用本发明方法进行鉴别。B. appendiculatus 和 B. pseudoregius 是同属于 Boletus 属内 Appendiculati类群的二个近缘种，同起源于欧洲，有着一些共同的形态特征。对B. appendiculatus与B.pseudoregius的辨别主要通过二者菌盖颜色上的些许差异，但对颜色差异的判别具有很强的主观性，常常出现偏差，而且对于干标本，特别是古老标本已很难通过颜色差异来准确鉴定。采用本发明方法，可对B. appendiculatus和B. pseudoregius进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别的有效辅助。所述PCR扩增反应体系组成如下(总体积25 μ L):PCR Buffer终浓度为IX
dNTPs0.8 mM
MgCl22.0 mM
Taq DNA 酶卜2 U
上、下游引物各0.4 μ M
模板DNA50 丨OOng
余量为ddH20;PCR反应条件如下94°C预变性 6min 后；94°C变性 40s，65°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。具体的，所述方法如下(I)取待测牛肝菌标本子实体O. 2 g，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA ；(2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增PCR反应体系每25 μ L组成如下
IO X PCR Buffer2.5 μ L
IOmMdNTPs2 uL
25 mM MgCl22 μ L
5 U/μ L Taq DNA 酶 0.3 μ L ΙΟμΜ上、下游引物各l[iL 17 Hg/ μ L 模板 DNA3 \xL
ddH20 补足至 25 μ L;PCR反应条件如下94°C预变性 6min 后；94°C变性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C ； (3)取步骤(2)扩增产物5 μ L，与I μ L O. 25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于I XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. pseudoregius,若电泳结果未出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. appendiculatus。PCR Buffer终浓度为I X，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与I XPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10 XPCR Buffer。10XPCR Buffer 成分为100 mM Tris-HCl (pH8. 5)、500 mM KCl,25 mM MgC12 和1. 0%Triton-X-100，溶剂为 ddH20。本发明的有益效果主要体现在本发明分子特异性标记引物可对近缘种B.appendiculatus和B. pseudoregius进行快速的分子鉴定,方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别牛肝菌二种的有效辅助。
图1 为对 B. appendiculatus 和 B. pseudoregius 进行 PCR 扩增的结果；M :Marker,即 DNA 分子量标准；C :阴性对照；Ba B. appendiculatus ；Bp B. pseudoregius ；图1所指为编号为Ba的B. appendiculatus标本未扩增出分子量为481 bp的特殊DNA条带，而编号为Bp的B. pseudoregius标本扩增出了该条带。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :(I)牛肝菌 标本基因组DNA的提取取待测牛肝菌标本子实体0. 2g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得标本的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer,杭州，中国)后,通过1. 5%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。0D26Q/0D28Q>1. 8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于_20°C冰箱贮藏备用。(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5 '-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3'和下游引物 5' - GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3'，由上海生物工程技术有限公司合成。(3) ITS特异引物的PCR扩增PCR反应体系10XPCR Buffer 2. 5 μ L, 10 mmol/L dNTPs 2μ L,25 mmol/L MgCl2 2μ L,5 U/μ L Taq DNA 酶(λ 3 μ L，10 μ mol/L 上下游特异引物各 I μ L，17 ng/μ L 模板 DNA 3 μ L，ddH20 14. 2 μ L，反应总体积为25 μ L。扩增反应在杭州博日公司的TC-XP型扩增仪上进行，反应条件94°C预变性6 min后；94°C变性40 s，65°C退火40 s，72°C延伸2 min，共30个循环；最后于72°C补平7 min,终止温度为4 °C。(4)电泳检测取步骤(3) PCR扩增产物5ul，与Iul 0. 25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含
O.5 μ g/ml EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。按照上述方法，分别对 B. appendiculatus 和 B. pseudoregius 标本(B.appendiculatus和B. pseudoregius标本皆来自于比利时国家植物园National BotanicalGarden of Belgium)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号为1、2、3、4、5、6、7的B. appendiculatus标本未扩增出分子量为481 bp的特殊DNA条带,而编号为8、9、10、11、12 的 B. pseudoregius 标本扩增出了该条带。
权利要求
1.一种鉴别欧洲牛肝菌B. appendiculatus和B. pseudoregius的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下 上游引物5' -TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3' 下游引物5, -GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3,。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B. pseudoregius 中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述分子特异性标记引物鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B. pseudoregius的方法,所述方法包括提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. pseudoregius,若电泳结果未出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. appendiculatus ； 所述分子特异性标记引物序列为 上游引物5' -TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3' 下游引物5, -GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3,。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下94°C预变性6min后；94°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法如下 (1)取待测牛肝菌标本子实体O.2 g，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA ； (2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增 PCR反应体系每25 μ L组成如下·10XPCR Buffer2.5 μ L·10 mM dNTPs2 μ L·25 mM MgCl22 μ L ·5 U/ μ L Taq DNA 酶0,3 μ L ΙΟμΜ上、下游引物各IuL·17 ng/μL 模板 DNA3 \iL ddH20 补足至 25 μι; PCR反应条件如下 ·94°C预变性6min后；94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C ； (3)取步骤(2)扩增产物5μ L，与I μ L 0. 25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于I XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析 仪上照相，若电泳结果出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. pseudoregius,若电泳结果未出现481 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B. appendiculatus。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别欧洲牛肝菌近缘种Boletus appendiculatus与B. pseudoregius的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B. appendiculatus和B. pseudoregius进行快速辨别的方法。所述分子特异性标记引物序列为上游引物5′-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3′下游引物5′-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3′本发明分子特异性标记引物可对近缘种B. appendiculatus和B. pseudoregius进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别牛肝菌二种的有效辅助。
文档编号C12Q1/68GK103045735SQ201210553260
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者丁红梅, 葛尔宁, 盛振华 申请人:浙江中医药大学