专利名称：高粱抗盐基因SbSAP14及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及高粱抗盐基因SbSAPM、含有SbSAPM基因的重组表达载体、基因编码的蛋白，以及基因在提高植物抗盐性能上的应用。
背景技术：
非生物胁迫，诸如干旱、盐、极端温度、高光、重金属等，影响了作物的生长和产量，对农业生产造成巨大威胁，严重影响了农业的可持续性发展。非生物胁迫是全球范围内作物减产的主要原因，几种最主要的作物平均减产高达50%以上(Vij and Tyagi 2007)。随着作物栽培扩大到一些并不适宜作物生长的地区，培育出具有抗逆性的植物品种变得越来越重要(Kathuria et al. 2007)。转基因方法为提高植物对非生物胁迫的耐受力提供了新途径。因而，克隆、鉴定抗逆相关基因，利用转基因技术改良和创造作物抗逆新种质，对选育抗逆植物新品种具有重要的促进意义。高粱(Sorghum bicolor L. Moench)是禾本科高粱属的一年生草本植物，是全世界种植的第五大禾谷类作物，具有C4植物高光效特征。作为粮食作物，高粱抗旱、耐盐碱和贫瘠土壤，在干旱和半干旱农业生产中占有及其重要的位置。除此之外，它也是重要的饲料植物和酿造业原料。高粱遗传多样性丰富，杂种优势强，杂优利用广泛。基于高粱自身的优点，从高粱中克隆到相关的抗逆基因，并对其进行功能鉴定、明确基因功能，可为作物的分子育种提供理论上的指导，并为创制具有耐 旱、耐盐性转基因水稻和高粱作物等新种质、新材料提供了研究基础，也为改良和提高干旱、半干旱及盐碱地区生长的作物抗逆性提供了候选基因资源。胁迫相关蛋白(Stress Associated Protein, SAP),是一类涉及胁迫应答和胁迫调控的锌指蛋白，该家族的典型特征是含有特异性的A20/AN1锌指结构域。近年研究发现SAP蛋白在植物中具有抗非生物胁迫的功能，因而日渐受到重视。2004年，Mukhopadhyay等人从籼稻中克隆到一个含有A20和ANl锌指结构的基因，A20和ANl锌指分别位于N端和C段。这个基因被命名为OsiSAPl，是植物中发现的第一个SAP基因，超表达OsiSAPl的转基因烟草抵抗多种非生物胁迫的能力增强(Mukhopadhyay et al. , 2004) oVi j等人应用实时定量PCR技术分析了非生物胁迫对水稻SAP家族基因表达的影响，结果发现所有的水稻SAP基因均受到一种或几种非生物胁迫的诱导(Vij and Tyagi 2006)。在此之后，水稻中另外两个SAP基因取得了与OsiSAPl相似的研究结果。受到热、冷、盐、干燥、重金属等多种胁迫诱导。超表达的转基因烟草和水稻植株，对盐、干旱和冷胁迫的耐受力在种子萌发期和幼苗期均明显提高，表现在萌发率、胁迫恢复后鲜重获得量等方面(Kannegantiand Gupta 2008)。值得一提的是，转基因水稻在开花期对盐和干旱具有抗性，而且与未受胁迫的转基因植株相比产量上没有损失。超表达Z/P777的转基因烟草植株对低温和高温胁迫的耐受力增强，但同时对盐和干旱胁迫敏感性增强(Huang et al. 2008)。上述研究结果揭示SAP基因家族在植物应答不同的非生物胁迫过程中发挥不同的功能。超表达该家族基因可以增强植物的抗逆性，表明SAP基因家族是通过基因工程提高作物抗胁迫能力的具有应用价值的有效基因。同一家族的基因在不同植物中表达的时间和空间存在差异，而且功能也有所不同。不同的植物可能采用不同的分子机制来调控植物对各种生物胁迫和非生物胁迫的应答，因此，研究高粱中的基因在整个胁迫应答调控网络中所起的作用，以及说产基因在抗逆过程的作用，对于对将来利用高粱产基因来改良重要的粮食作物和经济作物得到抗逆能力增强的新品种具有十分重要的实践意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供高粱抗盐胁迫基因SbSAPM及其在提高植物抗盐性能上的应用。本发明所采用的技术方案是
高粱抗盐蛋白SbSAP14，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。高粱抗盐基因SbSAPM,其编码SEQ ID NO: 2所示的蛋白。高粱抗盐基因SbSAPM,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。含有高粱抗盐基因·SbSAPM的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。重组表达载体中的载体为pCAMBIA1390表达载体。高粱SbSAPM基因在提高植物抗盐性能上的应用。所述植物为禾本植物。所述禾本植物为水稻、高粱、大麦、玉米。一种抗盐转基因植物的培育方法，是将高粱抗盐基因SbSAP 14导入目的植物中，得到抗盐性能有所提高的转基因植物。所述目的植物为水稻、高粱、大麦或玉米。本发明的有益效果在于
本发明克隆得到了高粱抗盐胁迫基因SbSAP 14，并且验证高粱基因在提高植物抗盐性能上的作用。本发明可以为研究基因在水稻、高粱等禾本植物在抗盐胁迫过程中的作用提供理论基础，并为高粱的逆境信号转导途径网络的建立提供理论依据，并可为将来利用SbSAPM基因来改良高粱或其他重要的粮食作物和经济作物，得到抗盐植物新品种提供新的基因资源。
图1是cDNA PCR扩增产物电泳图(M :DNA DL 2000分子量标准；1-4 :PCR产物)；
图2是表达载体质粒酶切鉴定图(M: Marker;1:表达载体质粒2 :表达载体质粒双酶切产物);
图3是21d龄Ub1::SbSAPM水稻苗的SbSAPM表达水平的RT-PCR检测结果图(WT 日本晴；1..Ub1::SbSAPM-1 ； 2 M1: :SbSAP14~2 ；3 M1: :SbSAP14~3 ；4 -Mb1::SbSAP 14~4 ；5 ..Ub1::SbSAP 14-5 ·, XX) -Mb1::SbSAP 14-10 ；16 -Mb1::SbSAP14~16 ；24 -Mb1::SbSAP14~24 ；27 M1: :SbSAP14-27)；图4是14d龄的油水稻盐胁迫3d后的表型(左图对照，正常条件下培养3d后的水稻苗；右图250mMNaCl胁迫处理3d后的水稻苗；WT:日本晴；#1:Ub1::SbSAP 14-1 ；#4 M1: :SbSAP14~4 ；#27 M1: :SbSAP14~27)；
图5是21d龄的Ub1::SbSAPM水稻盐胁迫IOd再恢复浇水7d后的表型(上图对照，正常条件下继续培养的水稻苗；下图250mM NaCl胁迫下的水稻苗；从左至右依次为日本晴；Ub1::SbSAPM-1 ·’ Ub1::SbSAP 14~4 ； Ub1::SbSAP14~27)；
图6是21d龄的Ub1::SbSAPM水稻受250mM NaCl胁迫IOd再恢复浇水7d后的存活率统计图(WT :日本晴；#1 M1::SbSAPM-1 ；#4 M1: :SbSAP14~4 ；#27 M1: :SbSAP14~27 ;*代表/7 < O. 05，** 代表/7 < O. 01)
图7是Ub1::SbSAPM水稻种子在不同浓度NaCl胁迫下萌发率的统计图(CK代表对照组即正常培养条件下；WT :日本晴；#1 -.Ub1::SbSAPM-1 ；#4 -Mb1::SbSAP 14~4 ；#27 Ub1: :SbSAP14-27 涔< O. 05，** 代表/7 < O. 01)
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京科学出版社)。实施例1`
一、高粱SbSAPM基因的克隆1、引物设计
以GenBank数据库公布的水稻基因序列作为查询探针，采用同源序列比对的方法，在高粱基因组信息库(http://genome.jgi_psf.org/ Sorbil/ Sorbil. home, html)获得了与相似性极高的候选基因，并将其命名为A其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所编码的蛋白质如SEQ ID N0:2所示。根据基因序列特征，利用Primer Premier 5. 00辅助设计特异性引物(表I )。
权利要求
1.高粱抗盐蛋白SbSAP14，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.高粱抗盐基因SbSAP14其编码权利要求1所述的蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.含有权利要求2或3所述的高粱抗盐基因SbSAP14的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中的载体为PCAMBIA1390表达载体。
6.权利要求2或3所述的高粱SbSAP14基因在提高植物抗盐性能上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本植物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述禾本植物为水稻、高粱、大麦、玉米。
9.一种抗盐转基因植物的培育方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗盐性能有所提高的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的培育方法，其特征在于，所述目的植物为水稻、高粱、大麦或玉米。
全文摘要
本发明公开了高粱抗盐基因SbSAP14及其应用。高粱抗盐基因SbSAP14的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明还验证了高粱抗盐基因SbSAP14能够提高植物抗盐性能，为SbSAP14基因在高粱的抗盐胁迫过程中的作用提供理论基础，并为高粱的逆境信号转导途径网络的建立提供理论依据，并可为将来利用SbSAP14基因来改良高粱或其他重要的粮食作物和经济作物，得到抗盐植物新品种提供新的基因资源。
文档编号C12N15/63GK103044535SQ201210553688
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者王小菁, 王瑛华, 孙姝兰, 彭建宗 申请人:华南师范大学