一种来源于长柄石杉的l-赖氨酸脱羧酶基因序列的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶 基因序列。
【背景技术】
[0002] 石杉科植物属古老的蕨类植物，普遍含有石杉碱甲（Huperzine A)，石杉碱甲是 一种高效、高选择性的中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗中老年痴呆及重症肌无力具有显 著疗效而引起世界广泛关注。由于石杉碱甲目前尚未能人工合成，药品生产完全依赖野 生资源，石杉科植物生长缓慢、生物量小，野生资源远不能满足需求，石杉碱甲生物合成成 为生产石杉碱甲最有潜力的途径之一。石杉碱甲生物合成的起始物已经被证实为L-赖 氨酸，L-赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC)为石杉碱甲生物合成途径上第一 个关键限速酶，对该酶基因的克隆及分析将有助于阐明石杉碱生物合成代谢途径。本发 明首先对南方地区石杉科植物中资源储量大的广布种长柄石杉（/fcperzia serraiarar. 的总RNA进行提取再反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用RT- PCR技术 扩增获得长柄石杉LDC基因，采用RACE技术获得的长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因全长序 列。并预测了其蛋白质结构，为进一步阐明石杉科植物石杉碱甲生物合成途径奠定基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，及其 氨基酸序列，是人们对石杉科植物LDC基因的研宄除蛇足石杉外的一种新的植物(长柄石 杉系蛇足石杉的一个变种，福建省及周边地区广布种)，是研宄石杉碱甲生物合成的基础。 长柄石杉LDC基因序列的获得丰富了为数不多的石杉科植物石杉碱生物合成与代谢调控 途径中涉及到的关键酶基因序列，同时也为L-赖氨酸脱羧酶基因的转导技术夯实了基础。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，所述基因序列如SEQ ID NO. 1所 示。所述氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 制备方法包括如下： (1)总RNA的提取和纯化： 取长柄石杉新鲜材料，使用康为世纪TRIzon RNA试剂盒提取总RNA。
[0006] (2) LDC基因中间片段的克隆 A.中间片段cDNA第一链的合成 以步骤（1)长柄石杉叶片总RNA作为模板，利用Promega公司的M-MLV反转录酶，按照 该试剂盒说明书提供的反应条件和步骤进行实验操作，将RNA反转录成第一链互补链DNA (cDNA)。
[0007] B. PCR 扩增 以步骤A所得的中间片段的cDNA第一链作为模板，对LDC基因进行扩增，引物为 LysD-F : 5' -GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'，LysD-R : 5' -TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
[0008] 反应体系：cDNA 2.5 yL，10 X Buffer 5.0以1^1(^111〇1/1上下游引物各 1.25yL, dNTP mix (10 mM each) I. 5 μ L，25 mM MgC12 4· 5 μ L，5u. μ L-ITaq 酶 0· 75 μ L，终体积为30. 0 μ L。
[0009] 反应程序：95 °C预变性3 min ;然后进行32个循环：95 °C变性30 s，50. (TC退火 30 s，72°C延伸45 s;循环结束后72°C延伸反应5 min，4°C条件下保存。
[0010] (3)长柄石杉LDC基因全长的调取 采用RACE技术获得长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因全长序列，所用引物见(表1)。RACE 结果经过纯化回收，连接载体，转化后提取质粒测序。5' -RACE测序结果与3' -RACE测序 结果经过DNAman软件拼接后得到L-赖氨酸脱羧酶基因全长序列。
[0011] 该技术关键在于： 1、长柄石杉LDC基因的中间片段的获得。
[0012] 2、长柄石杉LDC基因的3'端的克隆。
[0013] 3、长柄石杉LDC基因的5'端的克隆。
[0014] 4、基因序列的拼接及克隆。
[0015] 本发明的优点在于：该序列是一种新的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，使人们对该基 因的认识进一步拓展到长柄石杉。并且根据L-赖氨酸脱羧酶是一种将L-赖氨酸脱羧生成 1，5_戊二胺（尸胺）的关键酶，1，5_戊二胺是重要的医药中间体和尼龙材料前体。因此在 长柄石杉中对该基因序列的解明，将为探析L-赖氨酸脱羧酶工作机制提供依据，为1，5-戊 二胺的富集提供基础，在生物制药、农业、高聚物制备上将有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因目的条带。
[0017] 图 2 RACE 产物电泳图。M 为 DNA Marker ;1 为 5'- RACE ; 2 为 3'- RACE。
[0018] 图3 L-赖氨酸脱羧酶三级结构预测。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 (1)总RNA的提取和纯化： 取长柄石杉新鲜材料，使用康为世纪TRIzon RNA试剂盒提取总RNA。
[0020] (2) LDC基因中间片段的克隆 A.中间片段cDNA第一链的合成 以步骤（1)长柄石杉叶片总RNA作为模板，利用Promega公司的M-MLV反转录酶，按照 该试剂盒说明书提供的反应条件和步骤进行实验操作，将RNA反转录成第一链互补链DNA (cDNA)。
[0021] B. PCR 扩增 以步骤A所得的中间片段的cDNA第一链作为模板，对LDC基因进行扩增，引物为 LysD-F : 5' -GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'，LysD-R : 5' -TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
[0022] 反应体系：cDNA 2.5 μ L，10 X Buffer 5.0 μ L，10 ymol/L 上下游引物各 1.25yL, dNTP mix (10 mM each) I. 5 μ L，25 mM MgC12 4. 5 μ L，5u. μ L-ITaq 酶 0· 75 μ L，终体积为30. 0 μ L。
[0023] 反应程序：95 °C预变性3 min ;然后进行32个循环：95 °C变性30 s，50. (TC退火 30 s，72°C延伸45 s;循环结束后72°C延伸反应5 min，4°C条件下保存。
[0024] (3)长柄石杉LDC基因全长的调取 采用RACE技术获得长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因全长序列，所用引物见表1。RACE 结果经过纯化回收，连接载体，转化后提取质粒测序。5' -RACE测序结果与3' -RACE测序 结果经过DNAman软件拼接后得到L-赖氨酸脱羧酶基因全长序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0025] 表1 L-赖氨酸脱羧酶基因调取的扩增引物
【主权项】
1. 一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，其特征在于：所述基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. 根据权利要求1所述的一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，其特征在 于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种如权利要求1所述的来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列的制备方法， 其特征在于：所述方法包括如下：（1)总RNA的提取和纯化；（2) LDC基因中间片段的克隆； (3)长柄石杉LDC基因全长的调取。
4. 根据权利要求3所述的所述的来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列的制备 方法，其特征在于：步骤（2)中采用的PCR扩增引物为LysD-F :5'-GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'， LysD-R : 5'-TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
【专利摘要】本发明涉及一种来源于长柄石杉的L-赖氨酸脱羧酶基因序列，所述序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该序列是一种LDC基因序列，是人们对石杉科植物LDC基因的研究除蛇足石杉外的一种新的植物（长柄石杉系蛇足石杉的一个变种，福建省及周边地区广布种），是研究石杉碱甲生物合成的基础。长柄石杉LDC基因序列的获得丰富了为数不多的石杉科植物石杉碱生物合成与代谢调控途径中涉及到的关键酶基因序列，同时也为L-赖氨酸脱羧酶基因的转导技术夯实了基础。
【IPC分类】C12N15-60, C12N15-10
【公开号】CN104878032
【申请号】CN201510294528
【发明人】张君诚, 宋育红, 陈作毅, 张杭颖
【申请人】三明学院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月2日