漾濞大泡核桃几丁质酶基因JsCHI1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研宄领域，特别是具有抗真菌活性 的漾濞大泡核桃几丁质酶基因及应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题。兴起于20世纪初期的经典遗传学 使人们能够通过杂交育种成功培育出新的抗病品种，大幅度地提高粮食产量。近年来，随着 分子生物学理论和技术的不断发展完善，可通过基因工程这一现代生物技术直接、快速和 高效地培育抗病作物品种，是提高植物抗病性的一种新方法。
[0003] 几丁质酶（chitinase)普遍存在于细菌、真菌、昆虫、植物中，可以水解几丁质中 的β _1，4糖苷键产生几丁质单糖-N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine, NAG)。典 型的植物几丁质酶氨基酸序列包括一个N端信号区（也称催化区）和一个C端结构域（只 存在于液泡几丁质酶中）。部分几丁质酶在N端信号区之后还包含一个到多个几丁质结合 结构域（chitin-binding domain, CBD)，且在CBD与N端催化区之间存在一个可变连接区。 每个结构域都有不同的功能（Xu F, Fan C, He Y. Chitinases in Crjza saiira ssp. Japonica and Arabidopsis thaliana. Journal of genetics and genomics. 2007， 34: 138 - 150.)〇
[0004] 根据等电点的差异，几丁质酶被分为酸性和碱性几丁质酶。根据作用位点的不同， 几丁质酶被分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。基于蛋白质结构特性的分类则经过多次修 正，现如今，根据初级结构特性、底物专一性、催化机制以及对抑制剂的敏感性，几丁质酶被 分为七类：Class I~Class VII。Class I几丁质酶结构较为典型，包含一个富含半胱氨酸 的N端结构域，可以与几丁质结合，大多定位于液泡并对真菌生长有很强的抑制作用。Class II几丁质酶一般为酸性，并在合成后分泌到胞外。可以水解真菌菌丝中的几丁质并释放出 真菌激发因子，作为植物应对真菌侵害的第一步防御反应。Class III几丁质酶同样为胞 外水解酶，但其催化区的氨基酸序列与Class I和II几丁质酶不同，具有一个含4个天冬 氨酸和谷氨酸残基的特异活性部位。Class III几丁质酶同时具有溶菌酶和几丁质酶活性 (Liliane BDA, Sachetto-Martins G, Contarini MG, Sandroni M, Ferreira RDP, de Lima VM, Cordeiro MC, de Oliveira DE, Margis-Pinheiro M. Arabidopsis thaliana class IV chitinase is early induced during the interaction with Xanthomonas CaffijDe1Siri1S. FEBS letters. 1997, 419: 69 - 75·)。Class IV 几丁质酶在几丁质结合区 有缺失，合成后分泌到胞外。Class V几丁质酶与其它几丁质酶相比，多一个小的插入结构 域。Class VI和VII几丁质酶与其它几丁质酶的相似性较低，且成员较少。
[0005] 植物几丁质酶基因的表达受多种内外因子的诱导。拟南芥（JraMiZoASi1S class V几丁质酶基因，的表达受脱落酸和茉莉酸的诱导（Ohnuma T, Numata T, Osawa T, Mizuhara M, Lampela 0, Juffer AH, Skriver K, Fukamizo T. A class V chitinase from AraMdopsis thaliana'. gene responses, enzymatic properties, and crystallographic analysis. Planta. 2011，234: 123 - 137.) 〇 主要 在红花（Crocks1 ras)根和球垄中表达的几丁质酶基因的表达受真菌激发因 子、茉莉酸甲醋、物理伤害以及真菌侵染的诱导（L0pez RC，G0mez-G0mez L Isolation of a new fungi and wound-induced chitinase class in corms of Crocus sativus. Plant physiology and biochemistry. 2009, 47: 426 - 434.)〇
[0006] 几丁质是一些真菌细胞壁的主要成分之一，因此植物体内可以催化几丁质水解的 几丁质酶在其抵御病原真菌入侵过程中有着重要的作用（Xu F，Fan C，He Y. Chitinases in Oryza sativa ssp. Japonica and Arabidopsis thaliana· Journal of genetics and genomics. 2007，34: 138 - 150.)。而且病原真菌入侵过程中几丁质酶的表达量及 表达时间与植株的抗性强弱呈正相关（Shrestha CL, Ofia I，Muthukrishnan S，Mew TW. Chitinase levels in rice cultivars correlate with resistance to the sheath blight pathogen Rhizoctonia solani. European journal of plant pathology. 2008， 120: 69 - 77.) ^从沙棘（历>/7(9/7力^9 rAa備感病叶片中提取纯化的几丁质酶可以有 效地抑制沙棘干缩病原菌的生长（Sun YL，Hong SK. Effect of chitinase on resistance to fungal pathogens in sea buckthorn, Hippophae rhamnoides, and cloning of Class I and III chitinase genes. Biochemical genetics. 2012，50: 600 - 615.) 〇大 多水稻几丁质酶基因被人们用来构建抗真菌的转基因植株。Ignacimuthu 和Ceasar通过农杆菌介导法将水稻几丁质酶基因 chill转入糁子， 使转基因植株获得对稻瘟病菌的强抗性（Ignacimuthu S， Ceasar SA. Development of transgenic finger millet {Eleusine coracana (L) Gaertn.) resistant to leaf blast disease. Journal of biosciences. 2012，37: 135 - 147.)。He等人通过强毒株农杆菌EHA105介导将包含水稻几丁质酶基因的重组质 粒Pbil21/ri^A77/转入成熟的芋头愈伤组织中，并通过进一步 诱导获得转基因幼苗。病原菌侵染实验表明，多拷贝和单拷贝的转基因幼苗对齐整小菌核 ra/fsii)的抗性均有所增强（He X，Miyasaka SC, Fitch MMM，Moore PH， Zhu YJ. Agrobacterium tumefaciens~mediated transformation of taro {Colocasia esculenta (L) Schott) with a rice chitinase gene for improved tolerance to a fungal pathogen Sclerotium rolfsii. Plant cell reports. 2008，27: 903 - 909.) 〇
[0007] 本发明中几丁质酶来自漾濞大泡核桃（/收Dode)。漾濞 大泡核桃是目前云南主要的核桃栽培品种，具有果大、壳薄、仁白、味香、出油率高、营养丰 富等优点，并且对病原真菌胶孢炭疽菌具有较强的抗性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种从漾濞大泡核桃中克隆获得具有抗真菌活性的几丁质 酶的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，该基因全长为1147 bp， 包含一个960 bp的开放阅读框、30 bp的5'非翻译区（untranslated regions，UTR)及 157 bp的3' UTR，编码如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白质。
[0009] 本发明所述几丁质酶基因的编码区是序列表SEQ ID NO :1中第31-990位 所示的核苷酸序列。
[0010] 本发明分离克隆漾濞