高通量的多年生黑麦草农杆菌转化体系及其专用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高通量获得多年生黑麦草农杆菌转化的 试剂盒和转化方法。
【背景技术】
[0002] 多年生黑麦草（Lolium perenne L.)是世界上最重要的温带牧草之一（Jauhar 1993)，仅新西兰的种植面积就已超过700多万公顷（Siegal et al. 1985)。同时多年生黑 麦草又是一种异型杂交、风媒和高度自交不亲和的物种（Thorogood et al. 2002)。因其高 度自交不亲和性使得传统杂交育种在黑麦草优良品种的培育面前显得无计可施。而迅速崛 起的生物技术育种度身定造般的弥补了此类空缺。通过高通量的农杆菌介导技术获得多年 生黑麦草优良品种，对于改善动物的营养均衡、提高牛奶的产量和品质、增大乳品行业的利 益，乃至改良人工草坪、防风固沙、保持水土、改善人类生存环境等都具有举足轻重的作用。
[0003] 与其他单子叶植物相似，黑麦草属不是农杆菌的天然宿主。而农杆菌介导法比其 他物理轰击法能更高效地获得了具备低拷贝、完整引入、稳定表达特性的转基因植株（Luo et al. 2003 ;Han et al. 2005)。到目前为止有关农杆菌转化多年生黑麦草的成功案例少之 又少（Bettany et al. 2003 ;Wu et al. 2005 ;Bajaj et al. 2006 ;Zhang et al. 2012)。随着 其他单子叶植物转化体系的突破，筛选组培效应敏感的基因型、优化培养基配方、简化转化 流程，以期获得高效、稳定的遗传转化体系，为甄别影响产业性状的目标基因奠定了基础。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术中无法用农杆菌对多年生黑麦草进行转化的缺陷，本发明提供一 种多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒和转化方法。本发明的第一个目的为提供一种多年生 黑麦草农杆菌转化的试剂盒，其具体组成如下：
[0005] 本发明所述试剂盒依次包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养 基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基Π 、再生培养基和生根培养 基；
[0006] 所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；
[0007] 所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 22. 6 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0008] 所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 9 μ M的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μ M的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂 ;
[0009] 所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 4. 4 μ M的6-节氨基腺嗓呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂 ;
[0010] 所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 8. 8 μ M的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0011] 所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L 的葡萄糖和50g/L的蔗糖；
[0012] 所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9 μ M 的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、400 μΜ的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄 糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0013] 所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 9 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特 美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；
[0014] 所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 9 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特 美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0015] 所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 4. 4 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L 的凝固剂；
[0016] 所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。
[0017] 本发明中，所述凝固剂为植物凝胶。
[0018] 本发明中，所述侵染液和共培养基的pH值为5. 2,所述其他各培养基的pH值均为 5. 8〇
[0019] 本发明中所述的试剂盒可应用于多年生黑麦草农杆菌的转化。
[0020] 本发明的另一目的为以所述试剂盒为基础，提供一种多年生黑麦草农杆菌的转化 方法，其步骤优选如下：
[0021] 1) ''Impact" 和 "Evening Shade" 的品系的遴选：
[0022] 将多年生黑麦草品种"Impact"和"Evening Shade"的各1000粒种子进行脱壳和 表面消毒后置于所述发芽培养基中培养，得到分生组织；将分生组织纵向解剖一分为二置 于所述诱导培养基I上，诱导出黄色致密的胚性愈伤组织；将所述黄色致密的愈伤组织移 至所述分化培养基上，遴选出再生良好的品系；
[0023] 2)胚性愈伤组织的诱导：
[0024] 将所述遴选出的再生性良好的品系的愈伤组织上分化出的绿头移至所述保持培 养基上，得到丛生芽；将所述丛生芽的分生组织横向切下，依次接种于所述诱导培养基I和 所述诱导培养基II上进行培养，得到胚性愈伤组织；
[0025] 3)制备侵染用菌液：
[0026] 先将重组农杆菌悬浮在所述侵染液中得到重悬菌液，再将所述重悬菌液中添加终 浓度为400 μM的乙酰丁香酮，得到侵染用菌液。
[0027] 4)转化和筛选
[0028] 将所述胚性愈伤组织和所述侵染用菌液混匀、连续摇动，将所述胚性愈伤组织取 出晾干，得到侵染后的胚性愈伤组织，将所述侵染后的胚性愈伤组织在所述共培养培养基 中进行共培养，共培养后依次移至所述筛选培养基I、II上，得筛选后的愈伤组织；将所述 筛选后愈伤组织在所述再生培养基进行分化再生，至长出绿苗；
[0029] 5)生根和壮苗
[0030] 将所述长出绿苗的愈伤组织转至所述生根培养基上进行生根培养，待生根后进一 步称移栽至土壤中壮苗，即得到转基因多年生黑麦草。
[0031] 本发明步骤1)中所述脱壳和表面消毒的具体操作为：将种子浸泡在体积百分含 量20 %~100 %的硫酸溶液中振摇10~30分钟进行脱壳，将脱壳后的种子用流水洗涤1-5 小时，然后在30~60°C培养10~30分钟以杀死内生真菌，最后将种子用有效氯质量百分 含量为3%~10%的次氯酸钠溶液表面消毒10~30min，所述次氯酸钠溶液中滴加10微 升Tween20 ;所述脱壳和表面消毒的操作优选为：将种子浸泡在体积百分含量50%的硫酸 溶液中振摇20分钟进行脱壳，将脱壳后的种子用流水洗涤3~4小时，然后在56°C培养15 分钟以杀死内生真菌，最后将种子用有效氯质量百分含量为5%的次氯酸钠溶液表面消毒 20min，所述次氯酸钠溶液中滴加10微升Tween20
[0032] 本发明步骤1)中，在所述发芽培养中的培养条件为22-25 °C黑暗培养5-9天和 22-25°C光照培养1-3天；优选为为24°C黑暗培养7天和24°C光下培养2天；
[0033] 在所述诱导培养基中的培养条件为22-25°C黑暗培养2-7周；优选为为24°C黑暗 培养4-5周；
[0034] 在所述分化培养基中的培养条件为22_25°C光照培养2-7周；优选为24°C光照培 养4周；
[0035] 本发明步骤2)中，在所述保持培养基中的培养条件为22_25°C光照至长出丛生 芽；优选为24°C光照培养至长出丛生芽；
[0036] 在所述诱导培养I中培养的条件为22~25°C黑暗培养4周，优选为24°C黑暗培 养4周；
[0037] 在所述诱导培养II中的培养条件为22~25°C黑暗培养，并于转化前2-10天继代 一次；优选为24°C黑暗培养4周，并于转化前5-7天继代一次；
[0038] 本发明步骤3)中，所述重悬菌液中菌的浓度为OD_= 0. 6-0. 8。
[0039] 本发明步骤4)中，在所述共培养基上的培养条件为22-25 °C暗培养2-5天，优选为 24 °C暗培养4天；
[0040] 在所述筛选培养Ι、π上的培养的条件均为22-25°C黑暗培养1-3周，优选为24°C 黑暗培养2周。
[0041] 本发明步骤5)中，在所述生根培养基中的培养条件为22-25°C光照培养2周，所述 壮苗的条件为