温度22-25°C、光照强度145-155 ymol/mVs、光周期16/8h培养3. 5-4. 5周， 优选为温度24°C、光照强度150 ymol/mVs、光周期16/8h培养4周。
[0042] 本发明中，所述重组农杆菌为将质粒pCAMBIA1305. 1转入根瘤农杆菌EHAlOl中得 到的重组农杆菌。
[0043] 有益效果：
[0044] 本发明从黑麦草品种"Impact"和"Evening Shade"的1000个基因型品系中挑选 出5个组培效应敏感的基因型，标记为11、12、13和E1、E2。利用Il和El丛生芽分生组织 诱导的胚性愈伤作为外植体，经过农杆菌转化、筛选、再生和生根培养获得了多年生黑麦草 的转基因植株，平均转化效率为8. 5%，PCR阳性率超过90%。
[0045] 本发明所述试剂盒和培养方法能够高通量、高效、稳定的获得多年生黑麦草的转 基因植株，并通过保持培养基的不断扩繁能够无限获得可用于转化的优质外植体。为后续 大批量功能基因导入奠定了基础，为黑麦草的品种改良提供了强有力的助推作用。同时，整 套遗传转化体系的摸索过程也为其他不能通过常规育种改良的牧草提供了指导路线。
【具体实施方式】
[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0047] 实施例1
[0048] 本实施例涉及一种多年生黑麦草农杆菌转化体系
[0049] 一、转基因黑麦草的试剂盒制备
[0050]用于制备多年生黑麦草农杆菌转化体系的试剂盒包括发芽培养基、诱导培养基I、 II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、II、再生培养基和生根培养 基。
[0051] 各培养基的组分及制备方法如下：
[0052] 1)发芽培养基
[0053] 发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L 的蔗糖和3g/L凝固剂；
[0054] 上述发芽培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基并在其中中添加最终浓 度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高 压灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度为170 μ M的苯菌灵，倒90X 15mm 平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0055] 2)诱导培养基I
[0056] 诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 22. 6 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0057] 上述诱导培养基I按照如下方法制备：配制MS基本培养并在其中添加终浓度为 22. 6 μ M的2,4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加 终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压灭菌20min，倒90X 15mm平板，35mL每板，制成固体 培养基。
[0058] 3)诱导培养基II
[0059] 诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9 μΜ 的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μ M的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0060] 上述诱导培养基II按照如下方法制备：配制MS基本培养并在其中添加终浓度为 9 μ M的2,4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终 浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度 为0. 44 μ M的6-苄氨基腺嘌呤，倒90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0061 ] 4)分化培养基
[0062] 所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为 4. 4 μ M的6-节氨基腺嗓呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂 ;
[0063] 上述分化培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为 30g/L的麦芽糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压 灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度为4. 4 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤，倒 90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0064] 5)保持培养基
[0065] 持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8. 8 μ M的 6_苄氨基腺嘌呤，30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0066] 上述保持培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度 为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压 灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度为8. 8 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤，倒 90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0067] 6)侵染液
[0068] 侵染液由MS基本培养基、葡萄糖、蔗糖和水组成，葡萄糖在侵染液中的终浓度为 l〇g/L，蔗糖在侵染液中的终浓度为50g/L ;
[0069] 上述侵染液按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为IOg/ L的葡萄糖，终浓度为50g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 2,过滤灭菌后保存在-4°C。
[0070] 7)共培养基
[0071] 共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9 μΜ的 2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、400 μΜ的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、 70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0072] 上述共培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基并在其中中添加终浓度为 9μΜ的2,4_二氯苯氧乙酸，终浓度10g/L的葡萄糖，终浓度为70g/L的蔗糖，加水定容， 调pH至5. 2,添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压灭菌20min，待培养基温度降至 55°C左右时添加终浓度为0. 44 μ M的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为400 μ M的乙酰丁香酮，倒 90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0073] 8)筛选培养基I
[0074] 筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9 μ M 的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、 30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；
[0075] 上述筛选培养基I按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度 为9 μ M的2, 4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终 浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度 为0. 44 μ M的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为50mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀， 倒90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0076] 9)筛选培养基II
[0077] 筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9 μΜ 的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μΜ的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、 30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
[0078] 上述筛选培养基II按照如下方法制备：在MS基本培养基中添加终浓度为9 μ M的 2, 4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终浓度为3g/ L的植物凝胶，121 °C高压灭菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度为0. 44 μ M 的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为75mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀，倒90 X 15mm 平板，35mL每板，制成固体培养基。
[0079] 10)再生培养基
[0080] 再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4. 4 μ M 的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固 剂；
[0081] 上述再生培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为 30g/L的麦芽糖，加水定容至1L，调pH至5. 8,添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121°C高压灭 菌20min，待培养基温度降至55°C左右时添加终浓度为4. 4 μ M的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度 为25mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀，倒90 X 15mm平板，35mL每板，制成固体培 养基。
[0082] 11)生根培养基
[0083] 生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/ L的蔗糖和3g/的L凝固剂。
[0084]