整合子In1085的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与大肠埃希 菌耐药性密切相关的整合子。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一，给人类的健康和畜牧业的发 展造成了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用，但随着抗菌药物 的广泛应用，导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现，大肠杆菌的耐药问题已 成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。
[0003] 整合子（integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞 外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统。整合子依据整合酶序 列的不同可分成多种不同的类型。I类整合子至今发现在革兰阴性菌中广泛分布、检出率最 多。I类整合子的基本结构由3部分组成，两端是高度保守序列，分别称作5 '保守端（5 ' -CS) 和3'保守端（3, -CS)，5' -CS长约I. 4kb，3' -CS长约2kb，5' -CS和3' -CS之间的区域称 作可变区，可变区由一个或多个基因盒组成，基因盒一般含抗菌药物耐药基因。整合子是一 种可移动的基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引 起耐药基因的高效、快速转移，造成同种或不同菌种之间的扩散，从而表达对不同抗生素的 多重耐药性。
[0004] 临床抗菌药物大量应用是细菌整合子分子进化和捕获更多耐药基因的重要原因， 故应加强抗菌药物的合理应用，以减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多 药耐药菌株的发生。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为Inl085,其序列如SEQ ID NO. 1所示。该整合子含有aacA4基因盒、WaoxiwS因盒、catB3基因盒、arr-3基因盒 和dfrA27基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗 生素药物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β内酰胺类抗生素、磺胺类抗 生素、氯霉素类抗生素以及利福平类抗生素。
[0006] 常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0007] 常见的β内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头 霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。
[0008] 常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑（SIZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺嘧啶 (SD)、磺胺甲恶唑（SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶（SMM)、柳氮磺吡啶（SASP)、磺胺米隆（SML)、磺胺 嘧啶银、磺胺醋酰（SA)、以及复方新诺明（甲氧苄啶+磺胺甲恶唑）。
[0009] 常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
[0010] 常见的利福平类抗生素包括：利福平、利福喷汀。
[0011] 本发明的整合子是通过以下方法获得的：
[0012] (1)在台州市立医院泌尿外科病人尿液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲 松、阿米卡星、复方新诺明耐药的细菌。
[0013] (2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法 (补充药敏纸片）进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希氏菌菌，将其命名为 Eco336。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著耐药性。
[0014] (3)将EC0336菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。
[0015] (4)将步骤（3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段 长度为5, 668bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化 法转入感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0016] 本发明还提供了一种含有整合子Inl085序列的重组质粒。所述质粒包含整合子 Inl085序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子Inl085序列和pET32a 载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的 空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知 的常规方法。
[0017] 本发明还提供了一种含有整合子Inl085的接合菌株。为了研宄整合子的耐药性， 本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子Inl085的功能，将Ec 〇336菌株与E. coli J53 Azk(对叠氮化钠耐药）菌株共培养，通过含叠氮化钠（300mg/L)和阿米卡星（0. 06mg/ L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐药性。其中，所用阿米卡 星可用下列药物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明。
[0018] 本发明还提供了一种含有整合子Inl085的重组菌株。为进一步证实上述接合 菌株的抗性来源于Ec 〇336菌株中的整合子，本发明将该整合子Inl085克隆入pET32a载 体中，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E. coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆（含有pET32a-整合子的细菌）。将阳性克隆做 药敏试验，结果显示Eco336菌株中的整合子Inl085可以使重组E. coli JM109菌株对以下 药物耐药：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明、氯霉素。
[0019] 本发明的优点和有益效果：
[0020] (1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO. 1的包括多种耐药基因盒的整合子 Inl085,该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。
[0021] (2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上 减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆 发性流行。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的整合子Inl085的结构示意图。
[0023] 具体的实施方式
[0024] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0025] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 实施例1整合子Inl085的鉴定
[0028] l、Eco336菌株的分离和鉴定
[0029] I. 1 材料
[0030] 细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨 苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、 环丙沙星、厄他培