一种细菌ⅰ型整合子的荧光定量pcr检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及整合子的PCR检测，具体涉及一种细菌I型整合子的荧光定量PCR检 测试剂。
【背景技术】
[0002] 整合子是一种能识别并俘获移动性基因盒，具有位点特异的基因重组系统。抗生 素的应用压力不断增强，导致越来越多的耐药基因盒出现，携带重组基因盒的整合子能够 随机插入到接合性质粒或转座子中，导致了更大范围的耐药性水平传播。整合子的传播借 助于转化、转导及接合，不仅发生于细菌之间，还可以跨越菌属的界限，在真菌和细菌间进 行，同时有证据表明细菌整合子在细菌中也呈逐年递增的趋势。因此，开展实验室快速检测 整合子，类似于细菌药敏报告产ESBL-样，是随着细菌耐药机制研宄不断深入提出的新方 法，通过避免细菌所携带的未表达耐药基因相应抗生素的使用，来减缓细菌更多耐药性的 产生。目前对细菌I型整合子的检测方法主要包括基因杂交方法、酶切分析，基因测序，聚 合酶链式反应（PCR)技术等。如授权公告号为CN101948909的发明专利，就公开了检测细 菌I、II、III型整合子的PCR方法，I型整合子的PCR检测具有较好的敏感性和特异性，但需 要进行DNA电泳等PCR后处理，检测时间较长，同时接触有毒试剂溴化乙锭，安全性较差，易 发生交叉污染而造成假阳性结果，检测结果准确性较差。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌I型整合子的荧光定量PCR检测试 剂，该检测试剂具有特异性高、敏感性强、检测快速、安全和结果准确的优点。
[0004] 本发明系选择细菌I型整合子的整合酶基因的保守片段为靶目标，应用primer Express3. 0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实 验，得到最合适的引物和探针。
[0005] 本发明所述的一种细菌I型整合子的荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引 物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为200bp，引物和探针序列为：
【主权项】
1. 一种细菌I型整合子的荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性 荧光探针，扩增目标片段长度为200 bp，其特征是引物和探针的核苷酸序列分别为： 引物：intgernol -F: CGTAGAAGAACAGCAAGG intgernol -R ： ACGCTACTTGCATTACAG 探针：FAM - ACCGAACAGGCTTATGTCCACT-TAMRA 其中荧光报告基团FAM标记于探针5'端，不发荧光的淬灭基团TAMRA标记于探针3' 端。
【专利摘要】本发明公开了一种细菌Ⅰ型整合子的荧光定量PCR检测试剂，是将PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率高和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规PCR费时、易污染、准确性较差以及扩增后需电泳检测等缺点，可对细菌中的Ⅰ型整合子进行快速、准确、安全的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点，可减少DNA或PCR产物污染的风险；常规PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在3小时之内，可判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值，可同时进行大量样品检测，具有高通量性。
【IPC分类】C12Q1-06, C12Q1-68
【公开号】CN104531855
【申请号】CN201410783510
【发明人】王建峰, 于纪棉, 王春, 劳华均, 孙萍, 倪健波, 李如松, 黄素文
【申请人】宁波检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月18日