专利名称：人白细胞介素-22突变体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人白细胞介素-22，具体地说涉及人白细胞介素-22突变体及其 构建方法和应用。
技术背景白细胞介素22 (英文名称为Interleukin 22，.简写为:IL22)是于2000年 发现的一种细胞因子，属于白细胞介素10家族成员，它由活化的T细胞，NK细胞 分泌(Dumoutier L等，J Immunol 2000; 164:1814 9.)，但其受体却位于皮 肤，肾脏，消化系统，呼吸系统的实质细胞上，而对免疫系统却不产生作用(Wolk K等，Immunity 2004:21:241 - 54.)，生物学研究表明hlL22可以诱导上皮组织 如肺脏、肠道、皮肤抗微生物多肽的表达，增强这些细胞对抗病原微生物的侵 袭，抑制上皮细胞的分化，增强其增殖和迁移，因而IL22被认为在病原体防御， 创伤愈合及组织重构中起重要作用(Boniface K等，J Immunol 2005; 174:3695 702)。在肝脏和胰腺中人白细胞介素22 (英文名称:human Interleukin 22， 简写为hlL22)可以诱导急性期反应蛋白以及PAP1的产生，保护这些组织并且 增强其再生作用(Aggarwal S等，J Interferon Cytokine Res 2001 ;21:1047 - 53. Dumoutier L等，Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:10144 9)。hlL22是一种分泌型蛋白，由179个氨基酸组成，切除信号肽后以146个氨基 酸的形式分泌(Xie， M. H.等，J. Biol. Chem. 275， 31335 31339.)，氨基酸 序列对比发现hlL22与hlL10有22.8X的同源性与鼠IL22有80.8X的同源性， 工L22的模型是一个不对称的二聚体，包括单体A， 142个氨基酸(Ser38 —11e179) 和单体B， 141个氨基酸(his39 — lle179)以及189个水分子，hlL22的每一个单 体由6个a螺旋组成，形成一个紧密的团束。根据初级结构的预测，hlL22有两 个糖基化位点(Asn-Xaa-Thr/Ser)定位于helixA (Asn54-Arg55-Thr56)， 1。opAB(Asn68-Asn69-Thr70， helixC(Asn97-Phe98-Thr99) 。 hlL22双聚体是一种 不对称的亚单位，通过同源模建将IL22与hlFN-Y/hlFN-YRa以及hL10 / hL10Rl复合物进行比对，发现IL22可能的受体结合位点由helixA， loopAB，helixF组成(Ronaldo Alves Pinto Nagem, 1, 2 Didier Colau， Crystal Structure of Recombinant Human Interleukin-22 Structure, Vol. 10， 1051 - 1062， August, 2002)，然而还不能精确推断哪个结合位点与CRF2 — 9 结合，哪个位点与CRF2 — 4结合。如果能确定其真正的受体结合位点，那么就可以对IL22蛋白进行有目的的 改造，以便能在制备治疗疾病的药物上发挥更大的作用。 发明内容本发明在己知IL22晶体结构基础上(Ronaldo Alves Pinto Nagem， 1, 2 Didier Col叫 Crystal Structure of Recombinant Human Interleukin-22 Structure, Vol. 10， 1051 - 1062， August, 2002)，借助计算机分析，利用 Homology程序(InsightlI2000软件包，0ctane"图形工作站)从理论上模拟IL22 胞外段三维结构，通过表观静电分布、可及性表面积分析，结合细胞因子结构 特征，对IL22参与结合受体区域进行了分析，并将受体结合区定位于lo叩AB的N 末端，随后通过对受体结合位点实行点突变，构建了一系列突变体，然后通过 对系列突变体生物活性变化的分析，准确地确定了受体结合位点，并且构建了 高活性的hlL22突变体，以此发现为基础构成了本发明。本发明的目的之一是提供一种人白细胞介素一22突变体。 本发明的另一目的是提供人白细胞介素一22突变体的用途。 本发明的还一目的是提供人白细胞介素一22突变体蛋白的制备方法。 实现本发明的技术方案为本发明一种人白细胞介素一22突变体，就是通过对SEQ N0:1的氨基酸序列 中第67 72位氨基酸的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和添加突变所产生 的多肽，且该多肽与人白细胞介素一22具有相同或相似的功能。上述人白细胞介素一22的第67 72位氨基酸序列为 Asp-Asn-Asn-Thr-Asp-Val。上述人白细胞介素一22突变体，具有SEQN0:2、 SEQN0:3、 SEQ N0:4或SEQ N0:5的氨基酸序列。上述人白细胞介素一22突变体，具有SEQ N0: 5的氨基酸序列。 上述人白细胞介素一22突变体多肽对应的抗体或者拮抗剂等 上述人白细胞介素一22突变体多肽在制备治疗肝病、肾病、胰腺等疾病药物上的应用。本发明人白细胞介素-22突变体的制备方法，包括如下步骤 上述人白细胞介素一22突变体的制备方法，按照如下步骤进行(1) 将人新鲜外周血液用含2鹏ol/L EDTA的PBS稀释2倍，然后铺于等 体积淋巴细胞分离液上，在700 1000rpm条件下离心，吸出离心所产生的灰白 层细胞，再用Hanks液洗涤灰白层细胞2 3次，并将灰白层细胞悬浮于1640 培育基中，然后在37°C、 5%(^培养箱中培养24h;再向培养基中加入ConA(2mg/ml);和anti-CD., (4mg/ml)共刺激细胞；然后在37°C、 5。/。CC^培养箱中 培养24h，用总RNA提取试剂盒提取总RNA;(2) 以总RNA为模板，以fl和rl为引物 fl:5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'; rl:5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3'进行RT-PCR，扩增得到野生型hlL22;反应体系为总RNA， 5ul; RNase抑制 剂，0.5u]; Oligo(dT)， 0.5ul; DEPC处理水，6. 5ul;总计12ul; 70。C 5min 至4。C; RT:在上述体系加入5Xbuffer， 4ul; 2.5mMdNTP， 2ul; AMV， lul; RNase抑制剂，lul; 42°C lh， 85°C 5min至4。C;以反转录产生的第一链cDNA为模板，以fl和rl为引物进行PCR反应，所 述的PCR反应体系如下10PCR反应Xbuffer 2. Oul， 2. O腿ol/L dNTP 2. Oul， 5pmol/ul fl 2. Oul， 5pmol/ul rl 2.0ul，反转录产物4. Oul， TaqDNA聚合酶 0. 5ul，ddH20 7. 5ul，共20ul; PCR反应条件为94。C预变性3min; 94。C30S, 50°C 30S, 72°C 30S，30个循环;72'C延伸7min; PCR产物用1. 2%的琼脂糖凝 胶分离；(3) 利用限制性内切酶fcoRI和将RT-PCR产物与质粒pBV220在 37'C水浴中酶切3. 5h;然后将两者按10 4: 1比例混合，加入T4连接酶，在 16'C进行连接反应12h，再用电转化或CaCl2法将连接产物转化宿主细胞(见《分 子克隆实验指南》第三版96 99)，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆，提取 相应质粒，酶切鉴定，测序，得重组质粒pBV220/hlL22;(4) 以重组质粒pBV220/hlL22为模板，进行重叠PCR扩增，其中重叠PCR 方法所用的引物需要四种，第一对引物扩增含突变位点及其上游序列的DNA片 段，正向引物(FM)含有野生型模板DNA的突变位点；反向引物含有(R2)含有野生型序列；第二对引物用来扩增含希望引入突变位点及其下游序列的DNA 片段，反向引物(RM)含有希望引入模板的DNA的突变位点；正向引物F2含有 野生型序列；得含有突变位点的hlL22的DNA序列；(5)用电转化或CaCL法将重组质粒转化宿主细胞；转化菌落3(TC过夜活 化，次日以1 2 %体积百分比接种于LB培养基，在30'C培养2 3h;然后置 于在42。C水浴摇床上、180 220 rpm条件下培养4 hr，再在4。C、 12， 000 rpm 条件下离心15 min，去上清，将沉淀物以质量体积比1:8 10重悬于PB溶液 中，用超声波破碎菌体，用2 mol/L尿素洗涤经超声处理后得到的包涵体2 4 次，再用8 mol/L尿素变性溶解包涵体；接着以S印hacryl-200(S-200)为柱填 料，对溶解上清进行凝胶过滤层析，将纯化产物置于复性缓冲液中，在4'C稀 释复性72hr，然后以PEG 6000缓慢浓縮得本发明多肽。上述PB溶液为终浓度为100腿ol/L Na2HP04， 100腦ol/L NaH2P(^的混合 液。见《分子克隆实验指南》第三版1568页。上述淋巴细胞分离液可从巿场上直接购买，如可从上海华精生物公司购买。 卜.述Hanks液可从市场上直接购买，如可从天润善达公司购买。上述1640培养基可从市场上直接购买，如可从天润善达试剂公司购买。上述总RNA提取试剂盒可从市场上直接购买，如可从Promega公司购买。上述宿主细胞是￡ coA' DH5 a 、 HB101或JM109等。上述步骤(4)引物设计方法见《分子克隆实验指南》第三版第十二章1109页上述步骤(4)所述的引物可以是下述引物组 (1 ) 第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' 正向FM: 5' AGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3' 第二对引物反向RM: 5' GCAGCTGCAGCTGCAGCTCGTCTCATTGGGGAGAAA3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';或(2 )第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'正向FM: 5' 第二对引物:反向RM: 5' 正向F2: 5' 或(3 )第一对引物:反向R2: 5' 正向FM: 5'第二对引物:反向RM: 5' 正向F2: 5' 或(4 )第一对引物: 反向R2: 5'止向FM: 5' 第二对引物:反向RM: 5' 正向F2: 5'GTCTGTAGCTGCATCAGCCAAGCTAGCCTC3'GCTGATGCAGCTACAGACGTTCGTCTCATT3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3 AACGTCTGTATCAGCCAAGCTAGCCTC 3'TTGGCTGATACAGACGTTCGTCTCATT3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA 3' AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3'GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3' 上述步骤(5)所述的宿主细胞是￡ co乃'DH5a、 HB101或JM109等。 上述步骤(5)所述的复性缓冲液组成成分及比例为100 mmol/L Na2HP0h 100 ,1/L腿m、 0. 1画1/L GSSG、 1翻1/L GSH、 0. 1 % PEG。 本发明中确定人白介素一22受体结合位点的过程(1) 借助已有的hlL22晶体结构，利用Homology程序(InsightlI2000软件 包，0ctan^图形工作站)从理论上模拟hlL22胞外段三维结构(见图l);(2) 通过PDB二级结构分析，对其空间构象进行预测(见图2);(3) 利用表观静电分布、可及性表面积分析，结合细胞因子结构特征，对HL22 参与结合受体区域进行了预测，结果表明LoopAB为暴露在表面静电分布合适的 区域(见图3);(4) 进一歩分析，确定Lo叩AB的N-端为受体结合区域(见图4，图5)(5) 受体结合位点的氨基酸序列为67 72位氨基酸，氨基酸序列为Asp-Asn-Asn-Thr-Asp-Val。本发明的优点(1)确定了 IL22的受体结合位点，为IL22的利用提供了 基础；(2)本发明提供一种结合活性升高的突变体蛋白，通过白介素22突变体 可以更好地发挥IL22所具有的作用；(3)本发明提供了 IL22突变体蛋白的制 备方法，该方法产量高，成本低，适于大规模的生产和应用。
图l模拟hlL22胞外段三维结构图。图2预测hlL22空间构象图。图3 LoopAB为暴露在表面静电分布合适的区域。图4 Lo叩AB的N-端为受体结合区域图。图5 LoopAB的N-端为受体结合区域图。图6 hlL22总RNA的电泳图。图7六个氨基酸全部突变为丙氨酸(Ala)的DNA电泳图。 图8第68. 69位Asn变为Ala的突变体2丽的DNA的电泳图。 图9第68和69位Asn缺失的突变体2ND的DNA的电泳图。 图10第67和71位Asp变为Ala的突变体2DM的DNA电泳图 图11 hlL22及其突变体蛋白促进L02细胞的增殖活性曲线图。
具体实施方式
实施例1:野生型hlL22基因的钓取和重组表达载体的构建 1.1总RNA的提取用含2mmol/L EDTA的PBS将lml新鲜外周血稀释2倍，然后铺于等体积淋 巴细胞分离液(购于上海华精生物公司)上，800r/min离心使之分层，然后用 毛细血管吸出灰白层细胞。用Hanks液洗涤3次后，用1640培育基(购于天润 善达试剂公司)悬浮细胞在37°C， 5%(^培养箱中培养24h后，用ConA(2mg/ml， 购于夏斯生物公司)；和anti-CD:, (4mg/ml购于上海我武生物科技有限公司) 共刺激细胞然后在37"C， 5。/。C02培养箱中继续培养24h后，用Promega公司的总 RNA提取试剂盒提取总RNA，操作按说明书进行，电泳检测提取结果(见图6) 说明得到总RNA;1.2引物EcoRI fl:5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'BamHI rl:5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3' 以总RNA为模板，利用上述引物进行RT-PCR，扩增得到野生型hlL22。 反应体系为RNA， 5uL; RNase抑制剂；0.5uL; Oligo(dT)， 0.5uL; DEPC 处理水，6. 5ul;总计12ul; 70°C 5min至4。C; RT:在上述体系加入5Xbuffer， 4ul; 2. 5mMdNTP， 2ul; AMV， lul; RNase抑制剂，lul; 42。C lh， 85°C 5min 至4。C;以反转录产生的第一链cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系如下10PCR反应X buffer2. 0ul2.0mmol/L dNTP2.0ul5pmol/ulL fl2.0ul5pmol/uL rl2. OuL反转录产物4. OulTaqDNA聚合酶0. 5ulddH207. 5ul±fc 乂人20ulPCR反应条件为94。C预变性3min; 94°C 30S， 50°C 30S， 72°C 30S， 30个循环； 72°C延伸7min。 PCR产物用1. 2%的琼脂糖凝胶分离。 1.3重组质粒的构建RT-PCR产物用限制性内切酶v5boRI和fey^I (购自Promega公司)消化， 与经过同样处理的质粒pBV220连接，转化￡ c^/DH5 a ，利用氨苄青霉素抗性 筛选重组克隆；提取阳性克隆的质粒DNA，进行fcoRI和万3/^il双酶切鉴定及 琼脂糖凝胶电泳分析；将初步鉴定正确的重组子克隆送交大连宝生物公司进行 序列分析。其中质粒DNA的提取、酶切反应、连接反应、感受态的制备及转化 等操作均参照《分子克隆实验指南》。其氨基酸序列见SEQ NO:l.实施例2:系列hlL22突变体的构建构建将受体结合位点六个氨基酸(DNNTDV)全部突变为丙氨酸(Ala)的突变 体6M第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'正向FM: 5' AGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3':对引物反向RM: 5' GCAGCTGCAGCTGCAGCTCGTCTCATTGGGGAGAAA3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3' PCR反应体系如下pBV220 — hlL22正向引物R2 (或RM) 1Oumo1/1 反向引物FM(或F2) lOumol/110X buffer2. 5画1 d證Pyrobest高保真酶水第一轮PCR反应得到R2-FM与RM-F2两个片段 二轮PCRlul 2ul 2ul 5ul 4ul 0. 5ul 加至50ul 随后以这两片断为模板进行R2-FM lulRM-F2 lul正向引物R2 1Ourao1/1 2ul反向引物F2lOumol/1 2ul10X buffer 5ul2. 5誦o1 dNTP 4ulPyrobest高保真酶 0. 5ul水 加至50ul第一轮PCR反应体系均为94°C 5min， 94°C 30s， 50°C 30s, 72°C 30s;72°C 7min第二轮PCR反应体系为 95°C 5min， 70°C 5min; 94°C 30s， 50°C 30s， 72°C 30s;扩增结果见图7，最终所得氨基酸序列见SEQ N0:2。 实施例3构建将68和69位Asn变为Ala的突变体2丽72°C 7min第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' 正向FM: 5' GTCTGTAGCTGCATCAGCCAAGCTAGCCTC3' 第二对引物反向RM: 5' GCTGATGCAGCTACAGACGTTCGTCTCATT3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 反应体系及参数同前扩增结果见图8，艽氨基酸序列见SEQ N0: 3 。 实施例4构建将将68和69位Asn缺失的突变体2ND 第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' 正向FM: 5' AACGTCTGTATCAGCCAAGCTAGCCTC 3' 第二对引物反向画5' TTGGCTGATACAGACGTTCGTCTCATT3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3'反应体系及参数同前，扩增结果见图9，其氨基酸序列见SEQ NO: 4。 实施例5将67和71位Asp变为Ala的突变体2DM 第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' 正向FM: 5' AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3' 第二对引物反向RM: 5' GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3' 反应体系及参数同前，扩增结果图IO，.其氨基酸序列见SEQ NO: 5 。 .实施例6WL22及其系列突变体在大肠杆菌中的表达与纯化 按CaCl2转化法将表达载体pBV220/hlL22， pBV220/6M， pBV220/2醒， pBV220/2ND， pBV220/2DM转化￡ c^i DH5 a 。转化菌落经30。C过夜活化，次 曰以2 Q/。比例接种于LB培养基，3(TC培养至对数生长期(0D ,=0. 4 0. 6)，立即转入42'C水浴摇床，200 rpm培养4 hr，诱导目的蛋白在￡ co力'DH5 a中表 达。诱导表达培养物于4'C， 12,000 rpm离心15 min，将沉淀按1/8质量体积 比重悬于PB(100 ramol/L Na2HPa, 100腿ol/L NaH2P0》中，以超声波破碎菌体， 超声处理后得到的包涵体经2 mol/L尿素洗涤2次，8 mol/L尿素变性溶解， 以S印hacry1-200(S-200)为柱填料，对溶解上清进行凝胶过滤层析。纯化的样 品在复性缓冲液(100 mmol/L N&HP0个100 mmol/L關肌0. 1 mmol/L GSSG ， 1 mmol/L GSH， 0.1 % PEG)中4。C稀释复性72hr，之后以PEG 6000缓慢浓縮 得到一定浓度的蛋白样品。 实施例7hlL22及其突变体对L02细胞的促增殖作用L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养至细胞至生长状态良好， 收集细胞，以1Xl(f个细胞/ mL接种于96孔细胞培养板中，50til/孔；再依 次加入一定量的重组hlL22及其突变体蛋白溶液，每种蛋白的终浓度分别为 0.1、 1、 2.5、 10、 50、 100、 1000、 2000、 4000和8000ng/m]，以无细胞的空 白对照及有细胞但不加重组蛋白的阴性对照，在37t:、5呢CO培养箱中培养72 hr， 之后采用MTT法测细胞密度。采用Bradford法测得五种蛋白浓度分别为hlL22(57 mg/L) ，6M(105 mg/L )， 2丽(239 mg/L)， 2ND(98mg/L)， 2DM(156 rag'/L)，将其分别稀释成所需浓度。应用MTT法检测重组hlL22及其突变体蛋白对L02细胞的增殖活性。结果 (见图ll)同标准品hlL22相比，6M， 2丽，2ND重组蛋白对L02细胞促增殖活 性明显下降，而突变体2DM对L02细胞促增殖活性要高于标准品hlL22蛋白， 说明将可能的受体结合位点全部突变为丙氨酸后，突变体蛋白对L02细胞的促 增殖活性明显下降，这些结果说明了这一区段对人白介素22与其受体的结合乃 至活性的维持至关重要。序列表SEQ NO:l〈110〉中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 〈120〉人白细胞介素-22突变体及其构建方法和应用〈160〉 5<170〉 Patentln version 3. 3〈210〉 1〈211〉 147〈212〉 PRT〈213〉 Homo sapiens<400〉 1Met Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin15 10 15Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser20 25 30Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe35 40 45His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu50 55 60Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe Gin 65 70 75 80Pro Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg85 90 95Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn100 105 110Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu115 120 125lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn130 135 140Ala Cys lie 145SEQ NO:2〈210〉 2〈211〉 147〈212〉 PRT〈213〉 Artificial〈220〉〈223〉第67-72位点的六个氨基酸全部突变为丙氨酸(Ala)的突变体 <■〉 2Met Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin15 10 15Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser20 25 30Leu Ala Met Met Met Met Met Met Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe35 40 45His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu50 55 60Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe Gin65707580Pro Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg859095Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn100105110Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu115120125lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn130 135 140Ala Cys lie 145SEQ NO:3〈210〉 3〈211〉 147〈212〉 PRT〈213> Artificial〈220>〈223〉 第68和69位Asn变为Ala的突变体 〈400〉 3Met Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin6515 10 15Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser20 25 30Leu Ala Asp Met Met Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe35 40 45His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu50 55 60Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe Gin70 7580Pro Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg85 9095Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn100 105 110Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu115 120 125lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu LeiT Phe Met Ser Leu Arg Asn130 135 140Ala Cys lie 145SEQ NO:4 〈210〉 4〈211> 145〈212〉 PRT〈213〉 Artificial<220〉〈223〉第68和69位Asn缺失的突变体 〈400〉 4Met Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg 1 5Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe20 25 Leu Ala Asp Thr Asp Val Arg Leu lie35 40 Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr50 55 Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro 65 70 Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu85Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp 100Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys 115 120Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin 10 15 Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser30Gly Glu Lys Leu Phe His Gly 45Leu Met Lys Gin Val Leu Asn Phe 60Gin Ser Asp Arg Phe Gin Pro Tyr75 80 Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser90 95 Leu His lie Gin Arg Asn Val Gin 105 110 Leu Gly Glu Ser Gly Glu lie Lys125Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys 130 135 140lie 145SEO NO:5〈210〉 5〈211〉 147〈212〉 PRT〈213〉 Artificial<220>〈223〉 第67和71位Asp变为Ala的突变体 〈400〉 5Met Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin15 10 15Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser20 25 30Leu Ala Met Asn Asn Thr Met Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe35 40 45His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu50 55 60Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe Gin65 70 75 80Pro Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg85 90 95Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn100 105 110Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu115 120 125lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn130 135 140Ala Cys lie 14权利要求
1、一种人白细胞介素-22突变体，其特征在于是通过对SEQ NO1的氨基酸序列中第67～72位氨基酸的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和添加突变所产生的多肽，且该多肽与人白细胞介素-22具有相同或相似的功能。
2、 按照权利要求1所述的突变体，其特征在于所述的多肽具有SEQN0:2、 SEQ N0:3、 SEQ N0:4或SEQ N0:5所示的氨基酸序列。
3、 按照权利要求2所述的突变体，其特征在于具有SEQNO: 5所示的的氨 基酸序列。
4 、权利要求1、 2或3所述的突变体对应的抗体或者拮抗剂等
5、权利要求l、 2或3所述的突变体在制备治疗肝病、肾病、胰腺等疾 病药物上的应用。
6 、权利要求1或2所述的突变体的制备方法，按照如下步骤进行(1) 将人新鲜外周血液用含2腿ol/L EDTA的PBS稀释2倍，然后铺于等 体积淋巴细胞分离液上，在700 1000rpm条件下离心，吸出离心所产生的灰白 层细胞，再用Hanks液洗涤灰白层细胞2 3次，并将灰白层细胞悬浮于1640 培育基中，然后在37°C、 5%<:02培养箱中培养24h;再向培养基中加入ConA(2mg/ml);和anti-CD:, (4mg/ml)共刺激细胞；然后在37。C、 5。/。C(U音养箱中 培养24h，用总RNA提取试剂盒提取总RNA;(2) 以总RNA为模板，以fl和rl为引物 fl:5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'; rl:5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3'进行RT-PCR，扩增得到野生型hlL22;反应体系为总RNA， 5ul; RNase抑制 剂，0.5ul; Oligo(dT)， 0.5ul; DEPC处理水，6.5ul;总计12ul; 70°C 5min 至4。C; RT:在上述体系加入5Xbuffer， 4ul; 2.5mMdNTP， 2ul; AMV， lul; RNase抑制剂，lul; 42°C lh， 85°C 5min至4。C;以反转录产生的第一链cDNA为模板，以fl和rl为引物进行PCR反应，所 述的PCR反应体系如下IOPCR反应X buffer 2. Oul， 2. Ommol/L dNTP2. Oul， 5pmol/ul fl 2. Oul， 5pmol/ul rl 2. Oul，反转录产物4. Oul， TaqDNA聚合酶 0. 5ul，d肌0 7. 5ul，共20ul; PCR反应条件为94。C预变性3min; 94。C 30S, 50°C 30S， 72°C 30S，30个循环;72。C延伸7min; PCR产物用1. 2%的琼脂糖凝胶分离；(3) 利用限制性内切酶fcoRI和5a/zHI将RT-PCR产物与质粒pBV220在 37。C水浴中酶切3.5h;然后将两者按10 4: 1比例混合，加入T4连接酶，在 16。C进行连接反应12h，再用电转化或CaCl2法将连接产物转化宿主细胞(见《分 子克隆实验指南》第三版96 99)，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆，提取 相应质粒，酶切鉴定，测序，得重组质粒pBV220/hlL22;(4) 以重组质粒pBV220/hlL22为模板，进行重叠PCR扩增，其中重叠PCR 方法所用的引物需要四种，第一对引物扩增含突变位点及其上游序列的DNA片 段，正向引物(FM)含有野生型模板DNA的突变位点；反向引物含有(R2)含 有野生型序列；第二对引物用来扩增含希望引入突变位点及其下游序列的DNA 片段，反向引物(RM)含有希望引入模板的DNA的突变位点；正向引物F2含有 野生型序列；得含有突变位点的hlL22的DNA序列；(5) 用电转化或CaCl2法将重组质粒转化宿主细胞；转化菌落3(TC过夜活 化，次日以1 2 %体积百分比接种于LB培养基，在3(TC培养2 3h;然后置 于在42。C水浴摇床上、180 220 rpm条件下培养4 hr，再在4。C、 12, 000 rpm 条件下离心15 min，去上清，将沉淀物以质量体积比1:8 10重悬于PB溶液 中，用超声波破碎菌体，用2 mol/L尿素洗涤经超声处理后得到的包涵体2 4 次，再用8 mol/L尿素变性溶解包涵体；接着以S印hacry1-200(S-200)为柱填 料，对溶解上清进行凝胶过滤层析，将纯化产物置于复性缓冲液中，在4'C稀 释复性72hr，然后以PEG 6000缓慢浓縮得本发明多肽。
7、按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的引物 可以是下述引物组(1 ) 第一对引物反向R2: 5' GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' 正向FM: 5' AGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3' 第二对引物反向RM: 5' GCAGCTGCAGCTGCAGCTCGTCTCATTGGGGAGAAA3' 正向F2: 5' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';或(2 )第一对引物反向R2: 5'正向FM: 5'第二对引物:反向固:5' 正向F2: 5' 或(3 )第一对引物: 反向R2: 5' 正向FM: 5'第二对引物:反向RM: 5' 正向F2: 5' 或(4 )第一对引物: 反向R2: 5' 正向FM: 5'第二对引物:反向RM: 5' 正向F2: 5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' GTCTGTAGCTGCATCAGCCAAGCTAGCCTC3'GCTGATGCAGCTACAGACGTTCGTCTCATT3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' AACGTCTGTATCAGCCAAGCTAGCCTC 3'TTGGCTGATACAGACGTTCGTCTCATT3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3';GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3' AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3'GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3' ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3' 8、按照权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞是 ￡DH5 a H、 B101或JM109等之一种。
全文摘要
本发明公开了白细胞介素-22的受体结合位点，为白细胞介素-22的利用提供了基础；并提供了一种第67和71位Asp变为Ala的结合活性升高的突变体蛋白，可以发挥比白细胞介素-22本身更大的作用；本发明还提供了白细胞介素-22突变体的构建方法，该方法产量高、成本低，适于大规模的生产和应用。
文档编号C07K14/435GK101225110SQ200710176220
公开日2008年7月23日 申请日期2007年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者深 刘, 吴伯灵, 涛 徐, 徐东刚, 旗 杨, 王园园, 欣 蔡, 邢微微, 邹民吉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所;北京益芝堂现代制药有限公司