专利名称：：提高植物耐盐及抗旱性的基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种核苷酸编码序列和另一种按植物偏爱密码子人工合成的核苷酸编码序列,本发明还涉及所述核苷酸编码序列在改良植物对盐、干旱胁迫抗性上的应用。
背景技术：
：Deinococcusradiodurans(D.radiodurans)是至今已知生物中最高的辐射抗性的生物之一。该菌具有对致死剂量的电离辐射、UV辐射以及DNA损伤试剂的极端抗性，能将电离辐射造成上百个DNA双链断裂的基因组完整恢复如初，且不发生突变的能力。其极端的耐辐射能力及其DNA损失修复分子机制引起科学界的极大兴趣，不仅对探索DNA修复分子机理的基础学科有着十分重要意义，而且对促进新的DNA技术的发展以及在环境保护和生物修复、人类健康、生物技术，乃至地外空间的开发和利用等方面的具有极大潜在应用前景。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了D.radiodurans基因组全序列(White1999)。但现有技术中，未见D.radiodurans可提高植物对盐、干旱胁迫的抗性的任何有关报道。
发明内容本发明的目的是发现并人工合成提高植物耐盐及抗旱性的DNA序列，并将该序列转入植物中，培育耐盐及抗旱性的转基因植物。本发明发现如SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的DNA序列均具有提高植物耐盐及抗旱性功能。其中序列SEQIDNO:l来源于D.radiodurans其中的一段；SEQIDNO:2是源于SEQIDNO:l，并按植物偏爱密码子人工合成的序列。本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQIDNO:l所述的DNA或包含SEQIDNO:2所述的DNA。本发明用上述重组载体转化宿主细胞，这些宿主包括原核细胞，也包括真核细胞。常用的原核宿主细胞包括JM109，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞和其它植物细胞。在本发明举出的应用实例中，宿主细胞是E.coliJM109和烟草。在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将SEQIDNO:l或SEQIDNO:2可操作地连于表达调控序列，形成SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成重组细胞；(3)在适合表达SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白活性的基本纯的多肽，序列为SEGIDNO:3。本发明还提供了一种利用转基因技术将SEQIDNO:1或SEQIDNO:2转化入植物的方法，以提高植物对盐、干旱胁迫抗性，其步骤如下(1)将SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示序列可操作地连于植物表达调控序列，形成植物表达载体；(2)将步骤(l)中的表达载体转入植物细胞；(3)经筛选获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。上述"可操作地连于"表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明的一个实例中，将步骤(l)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28。C条件下，暗培养l-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。经实验证实，上述转基因植株对植物盐、干旱胁迫具有增强的抗性作用。上述载体可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的核酸分子。本发明还提供了检测样品中是否存在SEQIDN0:1或SEQIDN0:2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于SEQIDNO:l或SEQIDN0:2核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。在本发明中，"SEQIDN0:1或SEQIDNO:2"指编码具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDN0:1或SEQIDN0:2同源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQIDN0:2所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQIDNO:l核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO:l中的核苷酸序列的同源性至少89%,较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95。/。的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的SEQIDN0:1或SEQIDN0:2相同功能的蛋白的SEQIDNO:l中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地l-60个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，"基本纯的"蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(以上各百分比均指按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本发明中，SEQIDN0:3蛋白或多肽指具有SEQIDNO:l编码的蛋白活性多肽。该术语还包括具有与天SEQIDNO:3的相同功能的变异形式。这些变异形式包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为IO个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SEQIDNO:3蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的SEQIDNO:2多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与SEQIDNO:l或SEQIDNO:2杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用SEQIDNO:3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SEQIDNO:3多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括SEQIDNO:3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有SEQIDNO:3多肽序列的至少约IO个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。在本发明中，"SEQIDNO:3保守性变异多肽"指与SEQIDNO:3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1氨基酸替换表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>发明还包括SEQIDNO:3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SEQIDNO:3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。还可用Northern印迹法技术分析SEQIDN0:1或SEQIDN0:2基因产物的表达，即分析SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。SEQIDNO:1或SEQIDNO:2RNA的Northern印迹分析和SEQIDNO:3特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实SEQIDNO:1或SEQIDN0:2在生物样本中的表达。此外，根据本发明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选SEQIDNO:l或SEQIDN0:2同源基因或同源蛋白。为了得到与SEQIDN0:1或SEQIDN0:2基因相关的D.radioduranscDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选D.radioduranscDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用"P对SEQIDNO:l或SEQIDN0:2的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自D.radiodurans的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与SEQIDN0:1或SEQIDN0:2相关的基因家族的核苷酸序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明D.radiodurans的SEQIDNO:2蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。图1是含有SEQIDN0:1表达载体的大肠杆菌在含0.75MNaCl的培养基中生长状况，证明SEQIDN0:1具有耐盐及抗旱性功能。图中5个试管中内容物如下1号是E.coliJM109菌株;2号是空pMD18T载体的E.coliJM109;3号、4号和5号是含有SEQIDNO:l序列表达载体的E.coliJM109菌株。图2，图3和图4是含SEQIDNO:2核苷酸序列的表达载体在烟草细胞中进行真核细胞表达。其中图2是转基因烟草在MS2培养基上生长状况，生长状态良好；图3是在MS3培养基中转基因烟草阴性苗与阳性苗的根系生长状况，转基因烟草的根系生长良好，图4是转基因无菌苗移入珍珠岩中的生长情况，生长状态良好。图5是部分经PCR检测的阳性转基因烟草植株的Northernblot分析结果，杂交结果表明SEQIDNO:2核苷酸序列能在转基因烟草中表达。图6、图7是含SEQIDNO:2核苷酸序列的转基因植株的耐盐及抗旱性鉴定结果对比。其中图6是在0mmolNaCl的培养基上转基因烟草和非转基因烟草生长对比，图7是在250mmolNaCl的培养基上培养15天后转基因烟草和非转基因烟草生长对比，转基因烟草能在含250mmo1的NaCl的培养基上正常生长，非转基因烟草在含250mmo1的NaCl的培养基不能生长。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1SEQIDNO:l核苷酸序列在大肠杆菌中的表达和耐盐及抗旱性性能分析1.核苷酸序列SEQIDNO:l的克隆根据己公布的Deinococcusradiodurans基因组序列涉及一对PCR特异性引物，从D.radiodurans基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列。2.构建大肠杆菌表达载体及分子验证用将上述克隆片段用Ndel和SacII双酶切消化，与含E.coli通用启动子groE的载体pTtSacB连接，取代SacB基因，以产生基因的大肠杆菌表达载体。转化E.coliJM109,涂布于含Amp的LB固体培养基上，挑取白色菌落碱裂解法提质粒筛选不同的重组子，BglII酶切及测序验证，得到一株含该核苷酸序列表达载体的E.coliJM109菌株。酶切分析表明，含groE启动子的基因片段为1.2kb。3.大肠杆菌表达载体的耐盐及抗旱性性功能验证将OD值相同的含有SEQIDNO:l核苷酸序列表达载体的E.coliJM109菌株，对照pMD18T和对照宿主菌株E.coliJM109以1%的接菌量分别接种于含有0.75MNaCl的MM培养基中，37'C振荡培养15个小时，于550nm波长测定0D值。从图1中可看出含有SEQIDNO:l核苷酸序列表达载体的E.coliJM109菌株能耐受0.75MNaCl，生长状况良好，而只含空载体的E.coliJM109菌株和E.coliJM109菌株在0.75MNaCl的培养基中不能生长。实施例2SEQIDNO:2核苷酸序列的人工合成根据己SEQIDNO:l核苷酸序列，首先分7个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的7个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成7个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的基因。该合成的DNA片段的两端含Xbal和Sacl位点。将上述人工合成的5'和3，端酶切位点为Xbal和Sacl位点SEQIDNO:2，用于下面高耐盐及抗旱性基因植物表达载体的构建。实施例3SEQIDNO:2核苷酸序列在烟草细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的耐盐、抗旱性鉴定(一)含目的基因表达载体的构建根据全长编码序列(SEQIDNO:.2)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将序列cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和pCAMBIA2200)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。(二)利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落,接种于2mlYEB液体(Sm+,Kan+),28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min;3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的00600=0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28。C暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6—BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28。C光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。图2是转基因烟草在MS2培养基上生长状况，生长状态良好，图3是在MS3培养基中转基因烟草阴性苗与阳性苗的根系生长状况，转基因烟草的根系生长良好，图4是转基因无菌苗移入珍珠岩中的生长情况，生长状态良好。(三)利用Northernblot检测SEQIDNO:2在转基因烟草植株中的表达1.RNA的提取制备参考《分子克隆》(Sarabrook等，1989)2.RNA的定量:参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测0026。；RNA含量计算10D26。=40pg/ml。3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml25*电泳缓冲液，假如117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液张，于微波炉里加热融化，转入55。C水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55。C的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA30ug溶解于15mlRNA稀释溶液中，在55。C-65。C下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入211110*上样缓冲液，混匀。9)在电泳液未盖过胶的条件下点样，80V电压电泳10分钟，待样品全部进入胶后，加电泳液盖过胶面约半厘米。80-100V电泳5小时。4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用1(^SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2承SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80。C烘烤1-2小时。5.膜上RNA的检测1)将膜浸在^SSC中IO分钟，取出膜置滤纸上吸去多余的液体，将膜放入预杂交液中(50%甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(Ph6.4)5*Dendart0.1%SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA),42°C下预杂交过夜。2)到出预杂交液，换入等量的杂交液，将用"P标记的DNA探针在沸水中变性5分钟，加入杂交液(50%甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(Ph6.4)10%葡聚糖硫酸月旨，l*Dendart，0.1%SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)中，于42°C杂交24-48小时。3)取出膜，置洗膜液I(1*SSC，1%SDS)中，于42。C漂洗3次，每次5分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1%SDS)中，于55°C-65°C漂洗1-3次。用X光片压片l-7天，然后显影、定影。图5是部分经PCR检测的阳性转基因烟草植株的Northernblot分析结果。图5的杂交结果表明SEQIDNO:2核苷酸序列能在转基因烟草中表达。(四)含SEQIDNO:2核苷酸序列的转基因植株的耐盐及抗旱性鉴定鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行耐盐及抗旱性和抗旱性鉴定。用含有Oramol、250mrno1的NaCl的培养基培养转基因烟草植株和非转基因烟草植株，研究其对植株的存活率和发育进度；通过5d、10d和15d的观察。从图6，图7上可知转基因烟草可在250mmol的NaCl培养基上正常生长，非转基因烟草在250ramo1的NaCl培养基上不能生长，结果证明，该序列对盐的胁迫确有抗性。序歹樣SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>提高植物耐盐及抗旱性的基因及其应用<130>07-12<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉933<212〉DNA<213〉deinococcusradiodurans<400〉1atggggcc犯肪gctaaagctgaagcctccaagccccacccccaaa/tccctgttaagctc60ccattcgtgaccgcccccgacgccctcgccgccgccaaagccaggatgcgcgacctggcg120gcggcctacgtggcggccctgcccggacgcgacacccacagcctgatggcgggggtgccc180ggcgtagacctcaaattcatgccgctcggctggcgcgacggggcgttcgaccccgagcac240aacgtcatcctcatcaactcggcggcccgccccgaacgccagcgcttcaccctcgcccac300gaaatcgggcacgcgattttactcggcgacgacgacctgctctccgacatccacgacgcc360tacgagggcg3gcggctcg33caggtC3tcg朋acgctgtgc朋cgtggcggcggcggcg420attttgatgcccgaacccgtcatcgcggaaatgctggaacgcttcggccccaccgggcgc480gccctcgccgaactcgcc犯gcgggccg犯gtcagcgcgtcgtcggcgctctacgccctg540accgagcagaccccggtgcccgtcatctacgcggtctgtgcgccgggcaagcctccgcgt600gagcaggccgcaagcgscgaggacgctggcccaagcacag幼a犯gtcctgacggtccgc660gccagcagctcgacgcggggcgtcaagtacaccctggcgagcggcacgccggtacccgcc720gaccacccggcggcgcttgccctcgccacgggcatggaagtgcgcgagga犯gctacgtg780ccctttcgctcgggccggaaaatgaaggcggaggtggacgcctacccgtcgcgcggcatc840gtggccgtcagtttcgagttcgaccccgcccgcctgggccgcaaggacagcgagcaggcc900gaccgggacg3gccgcaggacgctgcacsgtga933〈210〉2<211〉933<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉2atgggtcc肌aggct肌ggctgaggcttctaagccacatccacaaattccagttaagctt60ccattcgttactgctccagatgctcttgctgctgct卿gctagaatgagagettcttgct120gctgcttacgttgctgctcttccaggaagagatactcattctcttatggctggagttcca180ggagttgatcttaagttcatgccacttggatggagagatggagctttcgatccagagcat240aacgttattcttatteiactctgctgctagaccagagagacaaagattcactcttgctcat300gagattggacatgctattcttcttggagatgatgatcttctttctgatattcatgatgct360tacgagggagagagacttgagcaagttattgagactctttgcaacgttgctgctgctgct420attcttatgccagagccagttattgctgagatgcttgagagattcggacc犯ctggaaga480gctcttgctgagcttgctaagagagctgaggtttctgcttcttctgctctttacgctctt540actgagcaaactccagttccagttatttacgctgtttgcgctccaggaaagccaccaaga600ga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