专利名称：拟南芥基因AtMPK6在植物抗旱方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码拟南芥AtMPK6的基因At2g43790在植物抗旱作用机制分析、培育 抗旱转基因植物品种等方面的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
干旱和旱灾从古至今都是人类面临的主要自然灾害。水资源短缺现象日趋加剧， 严重限制植物生长发育，威胁世界范围内的粮食安全。随着分子生物学和基因工程研究的 深入，国际上很多实验室也试图寻找与植物抗旱相关的基因，拟通过基因工程技术改良作 物的抗旱性，但这方面的研究进展仍然很缓慢。 现有研究表明，当遭遇干旱胁迫时，植物体内会产生和积累大量的活性氧 (ReactiveOxygen Species,ROS) 。 AtMPK6是植物体内一种调节胁迫信号转导的重要激酶， 活性氧能够激活AtMPK6，同时AtMPK6也能够调节植物体内的ROS的产生，AtMPK6和ROS的 产生存在交叉调节作用。但其详细机理还未见报道。因此，分析植物中MAP激酶功能，并研 究其与植物抗旱的关系，具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供了拟南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的应用，以拓展 基因At2g43790的应用范围。 同时，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因At2g43790在培育抗旱转基因植 物方面的应用。 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了拟南芥基因At2g43790突变，研究
突变体在植物抗逆过程中的作用，结果发现，该基因在植物抗旱方面作用显著。所述的基因At2g43790基因的CDS长度为1188bp，编码395个氨基酸的蛋白，该蛋
白为一个MAP激酶，该基因编码的蛋白在细胞内的定位未知。 所述的At2g43790的基因编码一个MAP激酶，该基因编码的蛋白在细胞内的定位 未知。所述的At2g43790基因突变体从拟南芥资源中心(ABRC，Ohio State University)获得。 本发明的技术方案涉及拟南芥基因At2g43790在培育抗旱转基因植物方面的应 用。 将At2g43790基因突变或沉默获得忍受干旱胁迫相关的转基因植物。本发明利用从拟南芥资源中心获得的At2g43790基因T-DNA插入突变体
(Atmpk6)，研究发现突变体对干旱胁迫不敏感。 本发明编号为At2g43790的基因编码MAP激酶，该基因的功能缺失突变体对干旱 不敏感，表现出显著的抗旱现象。 本发明用激光共聚焦检测在胁迫激素ABA处理下野生型(WT)和突变体(Atmpk6)原生质体内ROS产生和积累情况，发现在胁迫条件下Atmpk6原生质体内积累大量的R0S。
本发明用水母发光蛋白基因转化WT和Atmpk6植株，筛选、检测在甘露醇渗透胁迫 下植株内的Ca2+浓度动力学变化情况，发现渗透胁迫下Atmpk6植株Ca2+浓度比WT植株含 量高。本发明通过对At2g43790基因功能的分析鉴定，确立了 At2g43790在植物抗旱中 的作用及其调节机制，为培育抗旱的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
本发明从拟南芥At2g43790基因T-DNA插入得到能够调节植物抗旱的功能缺失突 变体Atmpk6，为获得抗旱作物新品系提供了遗传学材料和基础。
图1为同期播种正常生长和正常生长30天后土壤干旱10天的WT和Atmpk6植 株； 图2为ABA胁迫处理下WT和Atmpk6原生质体内ROS变化趋势。 图3为转化水母发光蛋白的WT和Atmpk6植株在甘露醇渗透胁迫下体内Ca2+动力
学变化趋势。
具体实施方式
实施例一 At2g43790基因的抗旱性分析 如图1所示，幼苗在光/暗周期为8/16h，温度22°C，黑暗温度18°C，相对湿度 80%，光照强度90mol *m-2 s_l的条件下生长4周后，A组正常浇水，B组停止浇水10天。 多次试验结果显示在正常生长条件下，WT和Atmpk6植株生长良好，没有明显差别(图A); 而持续干旱10天后WT和Atmpk6植株生长状况对比明显，95%的WT植株被旱死，而98%的 Atmpk6植株仍然存活(图B)。这些试验结果表明AtMPK6功能缺失以后，拟南芥获得了更 强的抗旱性。
实施例二 胁迫处理下WT和Atmpk6原生质体内ROS变化检测 如图2所示，利用ROS荧光探针H2DCF-DA负载WT和Atmpk6根原生质体，在激光共 聚焦荧光显微镜上，488nm， Time-Course扫描，检测ABA处理后ROS的动态变化，加入10 y M ABA后，Atmpk6原生质体的荧光强度迅速增加，10min左右时荧光强度达到最大，表明此时 原生质体内ROS大量产生并积累，而WT原生质体荧光强度变化不大。
实施例三 渗透胁迫下WT和Atmpk6植株体内Ca2+动力学变化检测 将水母发光蛋白基因转化到拟南芥中，得到第一代转基因植株的种子，撒播在于 含有潮霉素(hygromycin B) 30 y g L_l的MS培养基上，筛选出转入水母发光蛋白基因的 植株进行分析。 如图3所示，在330mM甘露醇模拟干旱处理下，WT和Atmpk6植株体内Ca2+的变化 具有明显差别WT Ca2+浓度的最高峰值为0. 5978 y M(n = 15) ， Atmpk6钙离子浓度最高峰 值为1. 868647 iiM(n = 12)。
权利要求
一种拟南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的应用。
2. 根据权利要求l所述的拟南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的应用，其特征在于所述的基因At2g43790为编码一种拟南芥MAP激酶的基因，该基因的CDS长度为1188bp，编码395个氨基酸的蛋白。
3. 根据权利要求1或2所述的拟南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的应用，其特征在于所述的At2g43790的基因编码一个拟南芥MAP激酶，目前该激酶在细胞内的定位未知。
4. 根据权利要求3所述的拟南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的应用，其特征在于所述的At2g43790基因从拟南芥资源中心(ABRC，Ohio StateUniversity)获得。
5. —种拟南芥基因At2g43790在培育抗旱转基因植物方面的应用。
6. 根据权利要求5所述的拟南芥基因At2g43790在培育抗旱转基因植物方面的应用，其特征在于将At2g43790基因突变或沉默获得抗旱相关的转基因植物。
全文摘要
水资源短缺现象日趋严重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。干旱限制了植物生长发育，造成农作物的减产甚至绝收，威胁我国粮食安全性。编号为AT2g43790的Atmpk6(Arabidopsis thaliana MAP kinase 6)基因编码的一种MAP激酶，调节干旱胁迫引起的植物体内的活性氧的产生和积累。在土壤干旱持续10天的条件下，突变体植株仍然存活，而对照野生型植株已被干旱致死，在胁迫条件下，突变体内活性氧和Ca2+水平均比野生型高。我们分析了AtMPK6在植物抗干旱胁迫中的作用及其调节机制，确立了AtMPK6参与植物胁迫激素ABA诱导的活性氧代谢机制，为培育抗旱的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
文档编号C12N9/12GK101748143SQ20091022753
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者张华 , 江静, 王文乐, 王淑静 申请人:河南大学