水稻OsDRUP1基因在增强植物抗旱性中应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻OsDRUP1基因在增强植物抗旱性中应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用、序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用。本发明的实验结果表明，OsDRUP1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsDRUP1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC?box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsDRUP1基因能够在一定程度上改善水稻抗旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
【专利说明】水稻OsDRUPI基因在增强植物抗旱性中应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中水稻含U box相关基因OsDRUPI在增强植物抗旱性中应用。
【背景技术】
[0002]各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量的重要因素，发掘能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫。基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的抗逆性，它是在基因水平上进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的高效性，极大地加快了育种速度，对于我们了解抗逆植物复杂的性状以及相关机制也是非常必要的。随着分子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经受到越来越广泛的关注和重视 。
[0003]干旱应答的基因根据其生物功能分成三类:转录水平上的，转录后水平的RNA或是蛋白质的磷酸化，渗透调节物质或分子伴侣(Chae, Letal.2008)。在响应干旱反应过程中，生理生态的变化主要包括早熟、叶的卷曲、蒸腾速率的降低、气孔的关闭以及渗透调节物质的积累等，而这些变化也是通过基因来决定的。
[0004]泛素蛋白酶体途径由(ubiquitin, Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme, El)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2s)、泛素蛋白连接酶(ubi quit in-protein ligases, E3s)、26S 蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquinatingenzymes, DUBs)等组成,其对祀蛋白的降解是一种级联反应过程。泛素首先在
其C末端甘氨酸残基与El的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性。El泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2泛素中间体。最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3。E3可以直接或间接与底物结合，促使泛素从E2形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基上，进而形成多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。生物体内存在众多E3连接酶，可以特异识别靶向蛋白，具有蛋白降解的高度选择性。参与生命各项进程，在植物抵御环境胁迫适应环境上也起着重要的作用。U-box E3s是一个相对较小的E3s家族，在结构上与RING结构域相似，有时多聚泛素链的形成还需要泛素链延长因子的辅助，人们将这类功能的酶命名为E4s，U-box家族成员就具有E4s的特点。
[0005]在植物中，也已经克隆验证了多个跟抗逆相关的E3连接酶。OsSDIRI就是一种E3连接酶，在水稻的所有的组织中均有表达，并且在干旱胁迫下表达量增加。体外多聚泛素化的试验证明了 OsSDIRI是一种有功能的E3连接酶，并且RING区是其活性所必须的。在干旱胁迫下，过表达OsSDIRI转基因水稻的气孔较对照相比关闭的较多，并比对照植株表现出较强的抗性。(Ting Gao etal.2011)。同时具有RING结构域的E3连接酶RGLG2与AtERF53在细胞核中发生相互作用:在干旱胁迫中，RGLG2通过调节AtERF53的蛋白降解来进行负向调控植株抗旱性(Chen et al.2011)。[0006]近几年许多与植物非生物胁迫相关基因被克隆和分析，初步了解了参与非生物胁迫应答反应的机制，但是植物抗旱性状是及其复杂的，抗旱相关基因还有待于进一步发掘和验证。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供序列表中序列I所示的蛋白及其编码基因(OsDRUPl)。
[0008]本发明提供了序列表中序列I所示的蛋白及其编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；
[0009]I)序列表中序列2、3的自5'末端第25位-1320位所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；
[0011]3)在严格条件下与I)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0012]4)与I)或2)所述的DNA分子具有90 %以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
[0013]含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014]所述重组表达载体的构建过程中,在其转录起始核苷酸前加上4个Myc蛋白标签，在pCUbil390的多克隆位点间，即Ubiquitin启动子后插入所述序列表中序列I所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
[0015]所述植物为单子叶植 物-水稻，包括双子叶植物。
[0016]本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列I所示的蛋白的编码基因导入植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比抗旱性增强。
[0017]本发明通过干旱胁迫下OsDRUPI基因的表达差异，结合超表达和RNAi抑制表达水稻植株的表型变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系。结果表明，OsDRUPI基因在受干旱胁迫诱导表达；在水稻中超表达OsDRUPl基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为以实时定量PCR分析OsDRUPl在不同非生物胁迫下的表达量差异。
[0019]图2为以实时定量PCR分析OsDRUPl在不同组织中的表达模式。
[0020]图3为PCR检测转基因T-DNA插入及qPCR检测目的基因RNA表达水平。
[0021]图4为Westren blot检测目的基因蛋白表达水平。
[0022]图5为超表达OsDRUPl和RNAi转基因植株抗旱相关表型。
【具体实施方式】
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]实施例1、旱胁迫条件下OsDRUPl基因的时空表达差异
[0026]日本晴(Nipponbare,Oryza sativa ssp.japonica)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料 的非专利文献是:Yongqing Jiao, Yonghong Wang, DaweiXue,Jing Wang,Meixian Yan,Guifu Liu,Guojun Dong,Dali Zeng,Zefu Lu,Xudong Zhu,Qian Qian and Jiayang Li(2010)Regulation of 0sSPL14by 0smiR156defines idealplant architecture in rice.Nature Genetics,42,541-544)；
[0027]1、水稻品种日本晴的非生物胁迫和不同组织器官样品
[0028]水稻日本晴种子经消毒处理，室温浸种2d，37°C催芽ld，萌发后选发芽一致的种子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二叶前水培，二叶后用Yoshida营养液培养。于五叶期开始自然干旱处理，全卷后复水处理、低温(4°C)、高盐(150mmOl T1NaCl)和渗透胁迫(20%PEG)处理，自然干旱开始卷叶时取叶片为01，全卷时为02，复水为1^，胁迫处理011、111、311、6h、12h、24h后取叶片；取正常生长条件下日本晴的幼穗、成熟叶片、茎、茎节、基座、老根、幼叶、幼根、愈伤组织，液氮速冻，~70°C低温保存，用于RNA提取。液氮速冻，_70°C低温保存。
[0029]2、实时定量PCR分析
[0030]采用TRIZOL试剂提取实验样品总RNA，并进行RNA纯度的分析:用I %琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。
[0031]反转录:
[0032]第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(Promega公司，Code no:A3500)。
[0033]Real Time PCR 分析:
[0034]Real Time PCR分析，所用 OsDRUPl 的PCR 引物如下:F:5’~GAGMCTGTGTCAGAGMCCG-3’；R:5’ ~CAGATGMGTATGMGGGATG-3’ ；内参基因 Actinl 引物序列为 F:5’ -GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3?；R:5，"GGCTGGMGAGGACCTCAOHB' Real Time PCR 的分析使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex Taqi式剂盒(Code no:DRR041A)，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI7300，方法见说明书。
[0035]数据分析:
[0036]用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Εχρ=2_Λ ，其中Λ ACt=[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的Ct)] O
[0037]标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S12+S22) / 3的值，进而算出X=Power((S12+S22) / 3，0.5)，最后算出方差=(2 (_ddct_x) _2 (_ddct+x)) / 2。
[0038]结果表明日本晴中OsDRUPl各种非生物胁迫下的表达量变化谱:结果如图所示，干旱胁迫下OsDRUPl表达量明显增高，并随胁迫程度增加表达量递增，复水处理后表达量恢复至最初水平(图1D) ；OsDRUPI受渗透和高盐胁迫诱导表达(图1A、1B)，但响应低温下调表达(图1C)，说明OsDRUPl响应不同非生物胁迫存在不同应答机制。OsDRUPl组织表达模式(I为茎节、2为节间、3为叶鞘、4为成熟叶片、5为基座、6为幼穗、7为幼叶、8成熟根系、9为愈伤组织、10为幼根):从图2可以看出，OsDRUPl在水稻所有组织中均表达，但在成熟组织(成熟叶片、成熟根)表达水平明显高于其它组织。
[0039]实施例2、过表达OsDRUPl基因增强转基因水稻的抗旱性
[0040]1、过表达和RNAi表达载体构建
[0041]根据日本晴序列全长设计引物，以cDNA为模板，高保真酶(同上)扩增获得OsDRUPl的基因全长，同时在5’和3’端加上Pst 1、BamH I酶切位点，扩增引物为:F:5’ -GCACTGCAGATGGCGGCGCCGGAGAAGGTGTTCG-3’ (下划线部分为 Pst I 酶切位点)；R:5’ -TAAGGATCCTCA GGAAAATGAATACTGATTCCTCCTTGCATGATCTTGGAT-3’(下划线部分为 BamHI酶切位点)，扩增产物经Pst I和BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段(1296bp);同时，用Pst I和BamH I酶切表达载体pCUbi 1390 (含有Ubiquitinl启动子)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Hao Peng, Qian Zhang,Yadong Li,Cailin Lei,Ying Zhai,Xuehui Sun,Daye Sun,Ying Sun,Tiegang Lu(2009)Aputative leucine-rich repeat receptor kinase, OsBRRl, is involved in rice blastresistance Planta，230:377-385)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后Pst I单酶切将人工合成的 4XMyc 蛋白标签核酸序列(CTGCAGATGAGCGGGTTAA TTAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTGAACAAAAATTAATCTCAGAAGAAGACTTGAACGGACTCGACGGTGAACAAAAGTTGATTTCTGAAGAAGATTTGAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTAGCCTGCAG)插入到起始密码子前(OsDRUPl蛋白第一个氨基酸前面)，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体pCUbi 1390的Pst I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列2第255位-1320位所示的OsDRUPl基因片段，该序列所编码的OsDRUPl蛋白的氨基酸序列如序列表中序列I所示。将重组载体命名为pCUbil390-MDRUPl。[0042]根据OsDRUPl基因cDNA特异序列设计RNAi区段，扩增引物为:DRUP1R_F:5' -CAGACGGCAGMAGCAGACG-3' ,DRUPlR-R:5, -TGCCCGGAGGCCTCTMGAT-3,，并分别在引物两端弓 I 入 attBl:GGGGACMGTTTGTACAMMAGCAGGCT / attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT接头序列；利用高保真酶进行PCR扩增RNAi区段(240bp),利用Gateway技术重组入PH7GWIWG2 (II)，完成OsDRUPl基因RNAi载体构建，测序表明在载体pH7GWIWG2 (II)的35S启动子后和IntiO后分别正反向插入了序列表中序列2第708位-947位所示的干扰片段，将重组载体命名为pH7GWIWG2 (II) -DRUPli。
[0043]冻融法将表达载体pCUbi 1390-MDRUP1和pH7GWIWG2 (II) -DRUPli转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Ruifang Yang, Qicai Tang, Huimeiffang, Xiaobo Zhang, Gang Pan, Hongffangand Jumin Tu(2011)Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependent kinaseinhibitors and effects of transgenic expression of 0siICK6on plant growth anddevelopment, Annals of Botany, 107:1087-1101),方法参照分子克隆实验指南。
[0044]2遗传转化
[0045]用农杆菌介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化(培养基配方见表1)，具体方法如下:
[0046]I)愈伤诱导
[0047]取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70%酒精清洗消毒lmin，期间不断地摇荡，再用15%的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4_5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg / L的2,4-D的诱导培养基中，28°C暗培养30-40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。
[0048]2)农杆菌侵染[0049]a)将携带有表达质粒载体pCUbil390-MDRUPl和pH7GWIWG2 (II) -DRUPli的农杆菌划线于含有抗生素(50mg / L卡那霉素或壮观霉素、25mg / I利福平)的LB固体培养基表面，28°C，200r / min培养过夜。
[0050]b)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C震荡培养到0D600=0.5。
[0051]c)取活化好的的新鲜菌液按1:100的比例接种到25ml相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至0D600=0.5。
[0052]d)菌液在5000g,4°C下离心IOmin收集菌体,弃去上清液；加入25mll0mM的MgS04悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4°C下离心IOmin重新收集菌体，
弃去上清液。
[0053]e)用25ml含有200 μ M乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。
[0054]f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3-0.4mm大小)，在超净工作台上风干10-20min。
[0055]g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50ml离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10-20min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200 μ M乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25°C黑暗条件下共培养3d。
[0056]h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg / I头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。
[0057]i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg / I头孢霉素和50mg/l潮霉素的N6培养基)上继续筛选2-3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。
[0058]3、转化体植株再生
[0059]取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基中，28°C暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/ 12h黑暗)继续培养8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250mL组培瓶)上，继续光照培养。等到不定芽长成4-6em高的小苗后再转移到生根培养基中，在28°C，光照培养间(12h光照/ 12h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T0代)，一月后取叶片进行PCR阳性鉴定(Hpt-F:5’ -CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’，Hpt-R:5’ -CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’ )，并收获其阳性植株种子(Tl代)。图3A为:转基因(过表达和RNAi)和野生型植株PCR阳性鉴定，转基因植株都获得Hpt特异条带，而野生型对照没有扩增条带。
[0060]表1遗传转化所用培养基及其配方
[0061]
【权利要求】
1.序列表中序列I所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用。
2.序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下I)-4)中任一所述的基因: 1)序列表中序列2的自5'末端第25位-1320位所示的DNA分子； 2)序列表中序列2和3所不的DNA分子或RNA分子； 3)在严格条件下与I)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
3.含有序列表中序列I所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述重组表达载体为在pCUbil390的多克隆位点间插入所述序列表中序列I所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
5.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
6.含有权利要求2、3或4所述编码基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述序列表中序列I所示的蛋白的编码基因或与所述基因具有90%以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物抗旱性获得提高。
8.根据权利要求4所述的方 法，其特征在于:所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
【文档编号】C12N15/84GK103509820SQ201310465898
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】傅彬英, 黄立钰, 黎志康, 王文生 申请人:中国农业科学院作物科学研究所