专利名称：水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi25编码区的分离克隆与应用。
背景技术：
水稻是我国重要的粮食作物，担负着全国95%以上人口的口粮。然而水稻在种植 过程中，经常会受病害的危害，造成严重减产。稻瘟病是由子囊菌Magaporthe oryzea引起 的水稻重要病害，已在85个国家中发现此病害。据统计，在1975-1990年间，由稻瘟病菌引 起的粮食损失占全球总产量的11-30 %，约157亿吨。从1980到2002年的22年间，我国四 川省年均发生稻瘟病280万亩，年均损失稻谷6000万公斤。2005年黑龙江省稻瘟病发生面 积超过66. 67万hm2，占该省水稻播种面积的1/3。目前，稻瘟病的防治主要采用化学防治 和抗病新品种培育两种途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境；而新品种往往由 于病菌小种致病力的快速演变，抗病性无法长期稳定维持，因此，发掘稻瘟病广谱、持久抗 性新基因，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施。开展抗瘟育种，阐明寄主的抗性机制是解决如何培育广谱，持久性抗性品种的关 键问题之一，而发掘、鉴定和克隆抗病基因是抗瘟育种应用的前提。迄今，国内外已至少鉴 定了 67个稻瘟病抗性等位基因，座落于水稻基因组的58个位点上，只有第3染色体上尚未 定位到抗性基因。其中第6、11和12染色体上定位到的基因最多，且成簇分布。到目前为 止，已经克隆的稻瘟病抗性等位基因有9个Pib、Pita、Pi2、Piz-t、Pi9、Pid2、Pi36、Pi37和 pi21，分别定位于第2、12、6、6、6、6、8、1和4染色体，其中Pi2、Piz-t和Pi9为同一座位上 的基因，但从物理位置上不是同一座位上的基因；除Pid2是编码一个受体类激酶外，pi21 编码一个富含脯氨酸的蛋白且具水平抗性，其余7个基因均编码NBS-LRR蛋白。Pib是第一个被克隆的稻瘟病抗性基因，位于第二染色体长臂末端，该基因大小为 3753个碱基，具有4个内含子，属于NBS-LRR类型的抗性基因，其编码的蛋白可能与无毒基 因产物在细胞质中识别，从而诱发水稻的防卫反应。正常情况下，Pib少量表达，当病原菌 存在时，表达量增高，当温度改变或没有光照时，该基因的表达量也增加。Pib基因属于小家 族成员之一，起源于东南亚籼稻，在日本得到广泛应用，对日本绝大多数小种表现高抗，不 过，目前尚未证明它是一个广谱稻瘟病抗性基因。Pita来源于菲律宾籼稻Tadukan，该基因 是一个单拷贝基因，编码一个含928个氨基酸残基的细胞质受体，该基因在抗病品种和感 病品种918位置上仅仅存在一个氨基酸的差异，但他们都是低量组成性表达。Pita也属于 NBS-LRR类型的抗性基因，不过其C末端虽然富含亮氨酸，但不属于典型的LRR结构。Ρ 9, Ρ 2和Piz-t三个稻瘟病抗性基因均位于第6染色体上，都属于NBS-LRR类 基因，具有较广的抗谱。Pi2与Piz-t高度同源，两种之间仅有八个氨基酸不同，分布在三个 保守的LRR结构区内。此外，不同于大部分NBS-LRR基因的NBS区激酶2N端包含一个内含 子，这三个基因的内含子不在NBS区内，而分别位于NBS区之前与LRR区之后，有可能表明 Pi2/Pi9/Piz-t基因家族的进化独立于其他NBS-LRR基因。
Pid2基因来源与我国水稻品种地谷，与以往所克隆的NBS-LRR类抗稻瘟病基因不同，该基因编码一个类受体激酶蛋白，同时具有一个胞外域(B-Iectin)和胞内丝氨酸/苏 氨酸激酶域。Pid2是一个组成性表达的单拷贝基因，同时抗感两个等位基因仅在第441氨 基酸位置上有差异。Pid2包含一个细胞外的凝集素域可能是作为受体在细胞外与更多的配 体结合，反应了该基因可能存在不同的抗性机制，包括克隆更多类似的基因。Ρ 36是一个单拷贝基因，位于第8染色体上的一个17Kb的区间内，是一个典型的 NBS-LRR基因，编码由1056个氨基酸残基组成的蛋白质，在抗性品种中组成性表达，其抗感 品种的等位基因仅在第590氨基酸位置上有差异。Ρ 37基因位于第1染色体上，亦属于NBS-LRR结构基因，编码一个1290氨基酸残 基组成的蛋白质，是一个组成性表达的基因，该基因在NBS中的第239和247氨基酸位置上 有差异导致了抗感的差别，瞬时表达显示Pi37蛋白位于细胞质内。pi21基因位于第4染色体上，属于一个新型的稻瘟病抗性基因，编码一个富含脯 氨酸的蛋白，也是第一个克隆的稻瘟病抗性QTL，具有非小种特异性抗性，具有广阔的育种 应用前景。随着水稻基因组测序的完成，利用图位法和生物信息学方法克隆植物基因，已经 取得快速进展，这为稻瘟病抗性机理的阐明以及抗性基因在水稻育种中的应用奠定了很好 的基础。迄今为止，除pi21基因外，克隆的稻瘟病抗性基因都是主基因，然而主基因主导的 抗性往往不稳定，相对而言，具有广谱抗性的主基因具有较大的应用前景。Pi25来源于籼稻 品种谷梅2号，该品种是一个广谱、兼抗叶瘟和穗瘟的稻瘟病抗性稳定持久的品种，克隆来 源于谷梅2号的稻瘟病抗性基因，可为进一步理解水稻抗病分子机制，以及阐明穗瘟抗性 机理提供理论依据，也为抗性基因的育种应用打下物质基础。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种谷梅2号中携带的一个有生物学功能的抗稻 瘟病基因Pi25编码区。本发明的另一个目的是提供上述抗稻瘟病基因所编码的蛋白质氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供用于扩增上述抗稻瘟病基因的特异性引物SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4，其核苷酸序列分别为 GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT 禾口 GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗稻瘟病基因的载体P1300-3. 3，其在 修饰后的质粒PCAMBIA1300中包含有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。本发明涉及分离和应用一种包含Pi25基因编码区的DNA片段，该片段由引物 1(SEQID NO 3)和引物2 (SEQ ID NO 4)通过PCR扩增得到。该片段赋予植物对稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzea)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应。这一发明适用于 对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段 如序列表SEQ ID NO :1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，或者其功能 相当于SEQ ID N0:1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸 序列如SEQ ID NO 2所列，结构如图6所示。本发明所分离、克隆的Pi25抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的激酶la (kinase la) :GMGGIGKT， 激酶 2(kinase 2) :YLENKRYVLVLDDVW 和激酶 3a (kinase 3a) :GRIILTSRNYDV。而该蛋白的 C-末端为5个典型LRR重复，其亮氨酸含量为19. 2 %。根据本发明提供的Pi25基因编码区序列信息(SEQ ID NO 1)，本领域技术人员可 以通过以下方法容易地获得与Pi25等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以Pi25基 因编码区片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pi25 基因编码区序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、 mRNA和cDNA中获取；(4)在Pi25基因编码区序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi25具有重要的应用价值。将所述的Pi25基因编 码区序列连接到烟草花叶病毒35S启动子下，用农杆菌转化方法将Pi25抗病基因导入粳稻 品种日本晴，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明具有如下有益效果将Pi25基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植 物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术 中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基 因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。
图1为水稻抗稻瘟病基因Pi25的遗传和物理图谱；图2为Pi25引物从抗感亲本DNA里扩增出的目的片段琼脂糖凝胶电泳图；其中:M1 :500ng Ikb plus DNA ladder (Invitrogen),M2 :300ng DL2, 000DNA marker (Takara)。图3为ρ1300-3·3载体结构图；图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi25的部分转化体的选择标记潮霉素基因的PCR验 证图；其中，MIOObp 分子量标记(Toyobo, Lot No :53240A3)，200ng ；1 谷梅2号；2 日本晴；3-21分别表示19个以粳稻品种日本晴为背景的转基因单 株。(潮霉素基因分子标记的扩增片段为760bp。)图5为水稻稻瘟病抗性基因Pi25转化植株的稻瘟病抗性鉴定图；其中，1 日本晴；2 丽江新团黑谷；3 谷梅2号；4-22分别表示19个以日本晴为 背景的转基因单株。R代表抗病，S代表感病。图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi25编码的氨基酸序列结构图；其中，带单下划线字母为组成推定NBS的3个保守区域；带双下划线字母反映了 Pi25抗感等位基因间蛋白序列的差别，第259，815，856，894和896个位置的氨基酸残基在 抗病等位基因里为Val，Phe, His, Val和Arg，而在感病等位基因分别为lie，Tyr, Asp, lie 和Gln ；下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。
具体实施例方式实施例1 水稻稻瘟病抗性基因Pi25的遗传分析及初步定位
首先，为了发掘和鉴定稻瘟病新抗性基因，对籼稻抗病品种谷梅2号与籼稻感病品种中156配制杂交组合，采用单粒传法构建了 304个单株组成的重组自交系，利用该重 组自交系群体对谷梅2号的稻瘟病抗性遗传进行了深入的研究，鉴定和定位了 Pi24，Pi25， Pi26和Pibgm四个稻瘟病抗性主基因和十多个QTL。Pi25是一个苗叶瘟和穗瘟兼抗的基因， 位于水稻第6染色体上。(如图1所示)实施例2 稻瘟病新抗性基因Pi25的精细定位本发明利用了图位克隆和生物信息学方法克隆抗性基因Pi25的编码区。为精 细定位该主效基因，从中156/谷梅2号重组自交系群体中挑选两个株系G19 (抗病)和 G153(感病)构建了一个新的重组自交系(含1384个株系)对Pi25进行精细定位，确定 Ρ 25定位于标记RG456和A7之间。利用生物信息学方法得知RG456和A7之间存在8个 重叠细菌人工染色体(BAC)克隆，共有132个候选基因，其中1个具NB-ARC结构抗性相关 基因位于BAC克隆AP004325上，因此将位于AP004325上该抗性相关基因确定为候选基因。 (图1)实施例3 稻瘟病新抗性基因Pi25候选基因编码区的分离及序列分析为了分离出Pi25的候诜基因，利用日本晴的参考序列，通过PRIME3 (http Il frodo. wi. mit. edu/cRi-bin/primer3/primer3www. cri)在线弓I 物设计软件设计候选 基因特异性引物，通过高保真Taq酶(Invitrogen)用PCR方法将候选基因分离出； PCR扩增产物经纯化后连接到pGEM-Teasy载体(Promega，CA :A1380)，并转化入大肠杆 菌JM109 (Promega，CA :A1380)中保存；连接产物经酶切验证的阳性质粒送往英俊公司 (Invitrogen)测序。序列经基因预测软件 GENSCAN(http //Renes. mit. edu/GENSCAN. html)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了 Pi25是一个编码NBS-LRR 类抗病蛋白的抗病基因。Pi25通过基因功能互补实验确认其功能。一、PCR 扩增为了分离出Pi25的候选基因，利用日本晴的参考序列，通过PRIME3 (http // frodo. wi. mit. edu/cgi-bin/primer3/primer3www. cgi)在线弓I物设计软件设计候选基因 特异性引物，其中引物序列为Pi25F 5' -ggggtaccccatcggcagtgtagcgttttt-3，(SEQ ID NO 3)；Pi25R 5' -gctctagagcgcaatcgtggaacaggaatc-3' (SEQ ID NO 4) 通过高保真Taq酶用PCR方法以抗病亲本谷梅2号DNA为模板扩增了 一个含Pi25 候选基因编码区的3. 3kb的片段，PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。1反应体系如下5μ 1 10XPCR 缓冲液(Invitrogen，CA11304_011)/50 μ 1 ;10 μ M dNTP (鼎 国 DH114-3)/50 μ 1 ;2 μ 1 50mM MgSO4 (Invitrogen, CAl 1304-011) /50 μ 1 ；1 μ 1 10 μ M Pi25F/50y 1 ；1 μ 110 μ M Pi25R/50 μ 1 ;1 单位 Taq DNA 聚合酶(Invitrogen， CAl 1304-011)/10 μ 1 ;2μ 1 DNA/50 μ 1。2温度循环条件如下反应条件94°C 2分钟；94"C 30秒、55 "C 30秒、68 °C 7分钟，39个循环；68 °C 15分 钟；4°C 10分钟。二、PCR产物回收与纯化
PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为IXTBE，当电泳指示剂溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时(10(^，601^11)，关闭电源。取下凝胶，用2\661 red (Biotium, cat =41003-0. 5ml)染色30分钟后，应用凝胶图象分析系统Bio-red Universal HoodII (Bio-red, Cat :76S/08184)记录结果，电泳图如图2所示。在紫外灯下割取含目的 片段凝胶，用胶回收试剂盒回收DNA片段(QIAGEN，CA28704)。三、候选基因连接转化纯化后的DNA片段以T4连接酶连接到pGEM-Teasy (Promega，CA :A1380)上，转化 到大肠杆菌 JM109 (Promega, CA :A1380)。四、酶切验证与测序转化后阳性克隆质粒经限制性内切酶EcoRI酶切验证后，该质粒送往Invitrogen 公司测序。实施例4 稻瘟病新抗性基因Pi25的转化与转化体的抗性鉴定取用于测序的相同质粒和修饰后的pCAMBIA1300载体以限制性内切酶KpnI和 XbaI (Takara)酶切4小时，再以T4连接酶将3. 3kb的候选基因片段连接到克隆载体上，形 成含Pi25基因编码区的新载体pl300-3.3(如图3)；转化到农杆菌EHA105，以农杆菌介导 法转化日本晴植株。所得Ttl代转基因植株，以潮霉素分子标记检测。PCR检测方法同上，其 中潮霉素分子标记引物序列为hygF 5' -GGAGCATATACGCCCGGAGT-3，(SEQ ID NO 5),hygR 5' -GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3，(SEQ ID NO :6)。反应体系为5 μ 110XPCR缓冲液(鼎国DH332_1)/10 μ 1 ;10 μ M上游弓丨物 /50 μ 1 ；10 μ M 下游弓丨物/50 μ 1 ；0. 5 单位 Taq DNA 聚合酶(鼎国 DH332-1)/10 μ 1 ；1μ 1 DNA/10 μ 1。反应条件94°C 2 分钟；94°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 1 分钟，35 个循环；72°C 5 分钟；4°C 10分钟。接通电极，在100V恒定电压下电泳，当溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段 时(60min)，关闭电源。取下凝胶，用 2XGel red (Biotium, cat =41003-0. 5ml)染色 30 分 钟后，应用凝胶图象分析系统Bio-red Universal Hood II (Bio-red，Cat :76S/08184)记录 结果，如图4所示。同时，对19个转基因植株和抗病亲本谷梅2号，转基因空白对照日本晴进行稻瘟 病抗性表型鉴定。用稻瘟病小种jS001-20-l-l进行苗期注射接种，以丽江新团黑谷为感病 对照，接种7天后调查转基因植株的稻瘟病发病情况。抗性鉴定结果显示抗性基因Pi25在 感病品种日本晴遗传背景下表现了与抗性亲本谷梅2号相同的抗性，表明抗性基因Pi25编 码区具备生物学功能，表现为对稻瘟病抗性。(如图5所示)。实施例5 :Pi25基因的结构Pi25基因编码区DNA长度为2775kb，编码区不含内含子，其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1 所示。实施例6 :Pi25抗性蛋白的结构Pi25基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其结构如图6所示。 抗性基因Pi25编码1个由924个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为150KD，等电点为 8.79。利用COIL分析表明该蛋白多肽的第123and 137个氨基酸残基为CC(coil-coil)结 构域。Pi 25蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase Ia(GMGGIGKT)位于该多肽的第202-209个氨基酸残基；kinase 2 (YLENKRYVLVLDDVff)位于该多肽的第276-290个氨基酸残基；kinase 3a(GRIILTSRNYDV)位于该多肽的第308-319个氨基酸残基。而该蛋 白的C-末端的580-876个氨基酸残基为5个LRR重复，其亮氨酸含量为19. 2%。数据库比较分析发现编码Pi25蛋白的核苷酸序列与其它水稻稻瘟病抗性基因 Pi2, Pi9, Piz-t, Pi-ta, Pi b, Pi_kh，Ρ 36 和 Pi37 不同源。实施例7 转化Pi25基因产生的抗性品种的应用将含Pi225基因编码区的载体pl300-3. 3导入农杆菌菌株EHA105中，用于转化感 病的水稻品种日本晴，获得了 13株具稻瘟病抗性的转化植株。利用这些抗性植株可以直 接筛选含该基因并抗稻瘟病的改良日本晴种质，也可以利用有性杂交转移抗性转化体中的 Pi25基因来改良其他优良但抗性不佳的粳稻品种；还可以利用有性杂交改良优质早籼稻 的稻瘟病抗性。序列表<110>中国水稻研究所<120>水稻抗稻瘟病基因Pi25编码区及其应用<130><160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2775<212>DNA<213> 水稻<400>1atggcggagg gtgttgtggg ctcactaatc gtcaagcttg gggatgccct ggcgagtgaa 60gcagtggagg tcgccaagtc cttgcttggg ctagagggat ctgctctgaa gcgcctcttt 120tctgagatcg gggaggtgaa gggtgagctg gagagcatcc atgccttctt gcaggcagcc 180gagcggttca aggacgccga cgagacaacc tccgcgttcg tcaagcaggt gaggagcctc 240gccctgagca tcgaggacgt agtcgatgag ttcacctacg agctggggga aggagacggc 300cggatgggga tggcagtggc actcaagagg atgtgcaaga tgggcacatg gtctcgcctg 360gctggcaatc tgcaggacat caaggtcaac ctgaaaaacg ctgccgagag gaggattagg 420tatgatctga agggcgtcga gagaggcgcg aaatcgacgg cgggaaggag gagctcaaac 480tggagatctg actctgtact cttcaagagg gaggatgagc ttgttggtat cgagaagaag 540agggatttgc tgatgaaatg ggtgaaagat gaggagcagc gccgcatggt ggtcagtgtg 600tggggaatgg gtggaatcgg caagacggca ctggttgcta atgtttacaa tgctatcaag 660gctgactttg acacctgtgc ttggatcact gtgtctcaga gctacgaggc tgacgatttg 720cttaggcgaa ctgctcaaga gtttcgcaag aatgatcgga agaaagactt cccagttgac 780gttgatatca caaattacag aggcttggtc gaaaccaccc gctcttacct ggagaacaaa 840aggtatgtcc ttgtcctaga tgatgtatgg aatgcaaatg tttggttcga tagcaaagat 900gcatttgaag atggcaatat tggccgaata attcttacat caaggaatta tgatgtggcg 960ttacttgcgc atgaaaccca tataattaat ttgcagccgt tggagaaaca ccacgcgtgg 1020
gatctgttct gtaaagaggc attttggaag aatgagataa ggaattgtcc gccggagttg1080cagccctggg ctaataattt tgttgacaag tgcaatggct tgccaatcgc aattgtgtgc1140attggacgcc ttctgtcatt tcaagggtca acttattcag actgggaaaa ggtgtataaa1200aatcttgaga tgcaactaac aaacaactct atcatggaca tgatgaacat tatcttgaag1260attagtttgg aagatctacc gcacaacatt aagaactgct tcctttattg ctccatgttt1320cctgaaaatt atgtgatgaa gaggaagtcc ctagtacgac tctgggttgc tgaaggattt1380attgaagaaa ctgagcatag aacacttgag gaagtggcag agcattactt gactgaactt1440gtgaaccgat gtcttctgtt gctggtgaag agaaatgagg ctggacatgt tcatgaagtc1500caaatgcacg atatcctccg tgttttggct ctttccaagg ctcgtgaaca aaatttttgc1560attgtcgtta accactcgag gagtacacat cttattggag aagcacgccg tttatcaatt1620cagagagggg attttgcaca acttgcagac catgcaccac atcttcgatc cttgctgctt1680ttccaaagtt cacccaatgt cagttcgctt cattcattac caaagtctgt gaagttgttg1740tctgttttgg atctaactga tagttcagtt gataggctgc caaaggaagt gtttggcttg1800ttcaacttgc gttttctggg tctcaggcgt actaaaatct ccaagcttcc aagctccatt1860ggaaggctaa aaaatctgct ggtgttggac gcttggaagt gtaaaattgt aaagcttcca1920ttggcgatta caaaacttca aaagctaaca catcttattg taacttcgaa agcagtcgtt1980gtttctaagc aatttgttcc ttctgttggt gtgccagcac ctttgcgtat ctgctccatg2040acaacccttc agacattact actcatggaa gctagttctc aaatggttca tcacctaggc2100tctcttgtgg agttaagaac ctttcgtatc agcaaggtgc gaagttgcca ttgtgagcag2160ttgttcatgg ccatcactaa tatgattcat cttacccgtc ttgggatcca ggcagacagt2220agtcaagaag tgctgcatct tgaatcactt aaacctcctc ctctacttca gaaacttttc2280ttgcaaggta cattatctca tgaatcatta cctcatttcg tgtctgtaag caatctgaat2340aacctcacgt ttctacgtct tgctgggtca agaattgacg aaaatgcatt ccttaatctt2400gagggattac agcagttggt aaagctacag ctttatgatg catttgatgg aatgaatata2460tacttccatg agaactcatt tccaaagctc agaatactga aaatatgggg tgccccacac2520ctgaatgaaa ttaagatgac aaaaggagct gtggcaagcc taacacatct gaagttcctg2580ctctgtccaa acctgaagca gttgccttgc ggtattgaac atgtgaggac tcttgaggag2640ctcactctgg atcatacagc agaagagctt gtggatagag tccgacggaa aaaagagcga2700atgatttgtg acgtccagag agtttatgtt gggttcatca gaaatggtgt gttggctgca2760gaaaggattc aataa2775<210>2<211>924<212>PRT〈213〉水稻<400>2Met Ala Glu Gly Val Val Gly Ser Leu lie Val Lys Leu Gly Asp Ala151015Leu Ala Ser Gla Ala Val Glu Val Ala Lys Ser Leu Leu Gly Leu Glu2025 30
Gly Ser Ala Leu Lys Arg Leu Phe Ser Glu lie Gly Glu Val Lys Gly354045Glu Leu Glu Ser lie His Ala Phe Leu Gln Ala Ala Glu Arg Phe Lys505560Asp Ala Asp Glu Thr Thr Ser Ala Phe Val Lys Gln Val Arg Ser Leu65707580Ala Leu Ser lie Glu Asp Val Val Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Leu Gly859095Glu Gly Asp Gly Arg Met Gly Met Ala Val Ala Leu Lys Arg Met Cys100105110Lys Met Gly Thr Trp Ser Arg Leu Ala Gly Asn Leu Gln Asp lie Lys115120125Val Asn Leu Lys Asn Ala Ala Glu Arg Arg lie Arg Tyr Asp Leu Lys130135140Gly Val Glu Arg Gly Ala Lys Ser Thr Ala Gly Arg Arg Ser Ser Asn145150155160Trp Arg Ser Asp Ser Val Leu Phe Lys Arg Glu Asp Glu Leu Val Gly165170175lie Glu Lys Lys Arg Asp Leu Leu Met Lys Trp Val Lys Asp Glu Glu180185190Gln Arg Arg Met Val Val Ser Val Trp Gly Met Gly Gly lie Gly Lys195200205Thr Ala Leu Val Ala Asn Val Tyr Asn Ala lie Lys Ala Asp Phe Asp210215220Thr Cys Ala Trp lie Thr Val Ser Gln Ser Tyr Glu Ala Asp Asp Leu225230235240Leu Arg Arg Thr Ala Gln Glu Phe Arg Lys Asn Asp Arg Lys Lys Asp245250255Phe Pro Val Asp Val Asp lie Thr Asn Tyr Arg Gly Leu Val Glu Thr260265270Thr Arg Ser Tyr Leu Glu Asn Lys Arg Tyr Val Leu Val Leu Asp Asp275280285Val Trp Asn Ala Asn Val Trp Phe Asp Ser Lys Asp Ala Phe Glu Asp290295300Gly Asn lie Gly Arg lie lie Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Asp Val Ala305310315320Leu Leu Ala His Glu Thr His lie lie Asn Leu Gln Pro Leu Glu Lys325330335His His Ala Trp Asp Leu Phe Cys Lys Glu Ala Phe Trp Lys Asn Glu
340345350lie Arg Asn Cys Pro Pro Glu Leu Gln Pro Trp Ala Asn Asn Phe Val355360365Asp Lys Cys Asn Gly Leu Pro lie Ala lie Val Cys lie Gly Arg Leu370375380Leu Ser Phe Gln Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Trp Glu Lys Val Tyr Lys385390395400Asn Leu Glu Met Gln Leu Thr Asn Asn Ser lie Met Asp Met Met Asn405410415lie lie Leu Lys lie Ser Leu Glu Asp Leu Pro His Asn lie Lys Asn420425430Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Met Phe Pro Glu Asn Tyr Val Met Lys Arg435440445Lys Ser Leu Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe lie Glu Glu Thr450455460Glu His Arg Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu His Tyr Leu Thr Glu Leu465470475480Val Asn Arg Cys Leu Leu Leu Leu Val Lys Arg Asn Glu Ala Gly His485490495Val His Glu Val Gln Met His Asp lie Leu Arg Val Leu Ala Leu Ser500505510Lys Ala Arg Glu Gln Asn Phe Cys lie Val Val Asn His Ser Arg Ser515520525Thr His Leu lie Gly Glu Ala Arg Arg Leu Ser lie Gln Arg Gly Asp530535540Phe Ala Gln Leu Ala Asp His Ala Pro His Leu Arg Ser Leu Leu Leu545550555560Phe Gln Ser Ser Pro Asn Val Ser Ser Leu His Ser Leu Pro Lys Ser565570575Val Lys Leu Leu Ser Val Leu Asp Leu Thr Asp Ser Ser Val Asp Arg580585590Leu Pro Lys Glu Val Phe Gly Leu Phe Asn Leu Arg Phe Leu Gly Leu595600605Arg Arg Thr Lys lie Ser Lys Leu Pro Ser Ser lie Gly Arg Leu Lys610615620Asn Leu Leu Val Leu Asp Ala Trp Lys Cys Lys lie Val Lys Leu Pro625630635640Leu Ala lie Thr Lys Leu Gln Lys Leu Thr His Leu lie Val Thr Ser645650655
Lys Ala Val Val Val Ser Lys Gln Phe Val Pro Ser Val Gly Val Pro660665670Ala Pro Leu Arg lie Cys Ser Met Thr Thr Leu Gln Thr Leu Leu Leu675680685Met Glu Ala Ser Ser Gln Met Val His His Leu Gly Ser Leu Val Glu690695700Leu Arg Thr Phe Arg lie Ser Lys Val Arg Ser Cys His Cys Glu Gln705710715720Leu Phe Met Ala lie Thr Asn Met lie His Leu Thr Arg Leu Gly lie725730735Gln Ala Asp Ser Ser Gln Glu Val Leu His Leu Glu Ser Leu Lys Pro740745750Pro Pro Leu Leu Gln Lys Leu Phe Leu Gln Gly Thr Leu Ser His Glu755760765Ser Leu Pro His Phe Val Ser Val Ser Asn Leu Asn Asn Leu Thr Phe770775780Leu Arg Leu Ala Gly Ser Arg lie Asp Glu Asn Ala Phe Leu Asn Leu785790795800Glu Gly Leu Gln Gln Leu Val Lys Leu Gln Leu Tyr Asp Ala Phe Asp805810815Gly Met Asn lie Tyr Phe His Glu Asn Ser Phe Pro Lys Leu Arg lie820825830Leu Lys lie Trp Gly Ala Pro His Leu Asn Glu lie Lys Met Thr Lys835840845Gly Ala Val Ala Ser Leu Thr His Leu Lys Phe Leu Leu Cys Pro Asn850855860Leu Lys Gln Leu Pro Cys Gly lie Glu His Val Arg Thr Leu Glu Glu865870875880Leu Thr Leu Asp His Thr Ala Glu Glu Leu Val Asp Arg Val Arg Arg885890895Lys Lys Glu Arg Met lie Cys Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Gly Phe900905910lie Arg Asn Gly Val Leu Ala Ala Glu Arg lie Gln915920<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3
ggggtacccc atcggcagtg tagcgttttt30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>4gctctagagc gcaatcgtgg aacaggaatc30<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5ggagcatata cgcccggagt20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6gtttatcggc actttgcatc g2权利要求
水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.由SEQID NO. 1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.获得权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因Pi25的引物对SEQ ID NO :3和SEQ ID NO: 4,其特征在于SEQ ID NO :3 核苷酸序列为 GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT，SEQ ID NO: 4 的核苷酸序列为 GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。
4.含有权利要求1所述基因Pi25的载体pl300-3.3，其特征在于在修饰后的质粒 PCAMBIA1300中包含有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi 25编码区的分离克隆与应用。本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区的核苷酸序列SEQ ID No.1，及其编码的蛋白质氨基酸序列SEQ ID No.2。将Pi 25基因编码区转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。本发明还提供了用于扩增水稻抗稻瘟病基因Pi25的引物对SEQ ID No3和SEQ ID No4，其中SEQ ID No3的核苷酸序列为GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT，SEQ ID No4的核苷酸序列为GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。本发明还提供了含有水稻稻瘟病抗性基因Pi 25的编码区的载体。
文档编号C12N15/11GK101824418SQ20091015526
公开日2010年9月8日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者吴建利, 庄杰云, 施勇烽, 陈洁 申请人:中国水稻研究所