用于再生干细胞的培养基组合物的制作方法

用于再生干细胞的培养基组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于将来自老年人的干细胞转化为年轻的干细胞的培养基组合物，更具体地涉及一种用于培养干细胞的培养基组合物，用于将来自老年人的干细胞再生为具有与年轻人的干细胞类似的特性，并涉及一种再生干细胞的方法，包括在所述培养基组合物中培养来自老年人的干细胞。根据本发明，即使自超过60岁的老年人收集的间充质干细胞也可被转化为具有高分化能力、高端粒酶活性和高干细胞标记表达能力的年轻的间充质干细胞。因此，本发明能够显著地提高采用间充质干细胞的细胞治疗的疗效。
【专利说明】用于再生干细胞的培养基组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于将来自老年人的干细胞转化为年轻的干细胞的培养基组合 物，更具体地涉及一种用于培养干细胞的培养基组合物，用于将来自老年人的干细胞再生 为具有与年轻人的干细胞类似的特性，并涉及一种再生干细胞的方法，包括在所述培养基 组合物中培养来自老年人的干细胞。

【背景技术】
[0002] 间充质干细胞是源自诸如骨髓细胞、脐带血细胞、胎盘细胞（胎盘组织细胞）或脂 肪细胞（或脂肪组织细胞）的各种成体细胞的多能干细胞。例如，来自骨髓的间充质干细 胞具有多能性而分化为脂肪组织、骨/软骨组织和肌肉组织，因此已经进行了各种研究来 开发采用间充质干细胞的细胞治疗剂。
[0003] 近年来，由于利用间充质干细胞的细胞治疗技术受到了关注，因而需要发展来自 人体的间充质干细胞的活化技术以适合于治疗目的。特别地，老年人占细胞治疗患者的很 大一部分，而从老年人的组织收集的间充质干细胞由于较低的增殖和分化能力而具有较低 的疗效。此外，需要将来自老年人的间充质干细胞活化为具有与来自年轻人的间充质干细 胞类似特性的技术。
[0004] 众所周知，类似于其他原代培养的人类细胞，当在体外培养时，间充质干细胞由 于与端粒缩短不相关的衰老机制而分裂非常缓慢（Shibata, K. R. et al.，Stem cells, 25 ; 2371-2382, 2007)。尚未清楚地发现这种衰老机制，但已知主要是因为在长期体外培养中 环境胁迫积累，使得Cdk抑制蛋白pl6(INK4a)表达并积累而抑制了参与细胞生长的Cdk蛋 白的活性。研究发现，当诱导肿瘤基因 Bmi-1在间充质干细胞中的表达而抑制pl6的表达 时，细胞的衰老就会受到抑制（Zhang, X.et al. Biochemical and biophysical research communications351 ;853-859, 2006)。此外，据报道，当在培养期间用FGF-2对间充质干细 胞进行处理以抑制p21 (Cipl)、p53和pl6 (INK4a)的mRNA表达时，间充质干细胞的生长在 G1 期停滞的情况就会受到抑制（Ito, T. et al·，Biochemical and biophysical research communications, 359 ;108-1142007)。此外，韩国专利公开 No. 10-2009-0108141 公开了一 种通过将编码Wipl蛋白的基因转化间充质干细胞而抑制间充质干细胞衰老的方法。
[0005] 然而，目前还没有对再生从老年人的组织收集的老化的间充质干细胞的方法的报 道。
[0006] 因此，本发明发现，当将从分离自老年患者的脂肪组织收集的间充质干细胞在含 有抗氧化剂和生长因子的培养基中培养时，能够产生具有与年轻人的间充质干细胞的活性 类似的间充质干细胞，因此完成了本发明。


【发明内容】

[0007] 本发明的一个目的在于提供一种用于再生来自老年人的间充质干细胞的培养基 组合物。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种再生间充质干细胞的方法，包括使用所述培养基 组合物培养来自老年人的充质干细胞。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供一种用于再生来自老年人的间充质干细胞的培 养基组合物，所述培养基组合物含有FBS (胎牛血清）、抗氧化剂、细胞因子和NAC(N_乙 酰-L-半胱氨酸）。
[0010] 本发明还提供了一种再生来自老年人的间充质干细胞的方法，所述方法包括在上 述培养基组合物中培养来自老年人的间充质干细胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 图1示出了来自20几岁的人和30几岁的人的脂肪干细胞在每种培养基中作4轮 传代培养的显微图片。
[0012] 图2示出了来自70几岁的人和80几岁的人的脂肪干细胞在其培养基中作4轮传 代培养的显微图片。
[0013] 图3是示出来自年轻人（20几岁和30几岁）的细胞和来自老年人（70几岁和80 几岁）的细胞在10种不同的培养基中培养的细胞群倍增水平（CPDL)的图表。
[0014] 图4是示出来自年轻人（20几岁和30几岁）的细胞和来自老年人（70几岁和80 几岁）的细胞在各种培养基中培养的细胞群倍增水平（CPDL)的图表。
[0015] 图5是示出在五种不同的培养基中培养的源自不同年龄的人的脂肪干细胞的端 粒酶活性的图表。
[0016] 图6是不出在两种不同的培养基（1号培养基和9号培养基）中培养的来自20几 岁、30几岁、70几岁和80几岁的人的脂肪干细胞的端粒酶活性的图表。
[0017] 图7是示出在使用1号培养基和9号培养基对细胞作4轮传代培养和6轮传代培 养后，端粒酶活性变化的测量结果的图表。
[0018] 图8示出了在1号培养基和9号培养基中培养3轮的脂肪干细胞中的多能性标记 oct4、nanog和Rexl的表达水平的测量结果。
[0019] 图9示出了在1号培养基和9号培养基中培养4轮的脂肪干细胞中的多能性标记 oct4、nanog和Rexl的表达水平的测量结果。
[0020] 用于实施本发明的最佳实施方式
[0021] 一方面，本发明涉及一种用于再生来自老年人的间充质干细胞的培养基组合物， 所述培养基组合物含有FBS(胎牛血清）、抗氧化剂、细胞因子和NAC(N-乙酰-L-半胱氨 酸）。
[0022] 如在此使用的，术语"干细胞"是指这样的细胞，其不仅具有自我复制的能力而且 还具有分化为至少两种类型的细胞的能力，而"成体干细胞"是指出现在发育过程后形成胚 胎的各器官的时期或出现在成年期的干细胞。
[0023] 如在此使用的，术语"间充质干细胞"是指从人类或哺乳动物的各种组织中分离的 未分化干细胞。特别地，本发明中的间充质干细胞可以是脐带源性间充质干细胞、脐带血 源性间充质干细胞、骨髓源性间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞、肌肉源性间充质干细 胞、神经源性间充质干细胞、皮肤源性间充质干细胞、羊膜源性间充质干细胞和胎盘源性间 充质干细胞。从各组织分离干细胞的技术是本领域已知的。
[0024] 如在此使用的，术语"脂肪源性干细胞"是指从脂肪组织中分离的未分化干细胞。 例如，可按以下方式分离脂肪源性干细胞。具体地，可通过以下方式分离脂肪源性干细胞： 将通过抽脂术获得的脂肪在生理盐水中悬浮，培养悬浮液，用胰蛋白酶处理贴附至培养容 器（如烧瓶）的脂肪细胞层，并收集经处理的脂肪细胞，或者用刮刀收集悬浮在生理盐水中 的少量脂肪细胞。
[0025] 如在此使用的，措词"再生干细胞"是使来自老年人的间充质干细胞的表型类似于 来自年轻人的间充质干细胞的表型。所述表型包括细胞形态、细胞增殖速率、端粒酶活性、 干细胞标记（0ct4、SSEA-l、Tral-60、Tral_81、Nanog等）的表达水平和干细胞的分化能力。 在本发明中，来自老年人的间充质干细胞优选为分离自60-120岁的老人的细胞。
[0026] 如在此使用的，措词"使来自老年人的间充质干细胞的表型类似于来自年轻人的 间充质干细胞的表型"是指与第一轮中分离的来自老年人的间充质干细胞相比，表型变得 更类似于来自年轻人的组织的干细胞的状态，或者与在不同于本发明的培养基组合物中培 养的间充质干细胞相比，表型变得更类似于年轻人的干细胞的状态。
[0027] 在本发明中，所述培养基组合物可进一步含有胰岛素或胰岛素样生长因子以及 氢化可的松，并且所述培养基组合物中的细胞因子可以是EGF(表皮生长因子）和/或 bFGF (碱性成纤维细胞生长因子）。
[0028] 本发明的培养基组合物中使用的抗氧化剂可以是硒、维生素 E、抗坏血酸、儿茶素、 番茄红、β-胡萝卜素、辅酶Q-l〇、EPA(二十碳五烯酸）、DHA(二十二碳六烯酸）等。优选 地，抗氧化剂可以是硒。
[0029] 因此，本发明发现FBS、bFGF和EGF是培养来自所有年龄组的人的脂肪干细胞的必 需因子。并且还发现来自年轻人的细胞比来自老年人的细胞的多能性、分化率或端粒酶活 性高，而且在不含FBS、bFGF或EGF的培养基中培养的细胞显示出降低的生长速率、分化率 和端粒酶活性，这表明FBS、bFGF和EGF是细胞生长和细胞活性的必需因子。
[0030] 此外，本发明发现在不含硒的培养基和含硒的对照培养基中，源自年轻组和源自 老年组的干细胞的细胞分化率是类似的。然而，两种培养基中的端粒酶活性检测结果表明 在不含硒的培养基中培养的老年组细胞的端粒酶活性比年轻组细胞的端粒酶活性低，这表 明硒实质上应包含在用于培养来自老年人的细胞的培养基中，以提供高的端粒酶活性。
[0031] 另一方面，本发明涉及一种再生来自老年人的间充质干细胞的方法，所述方法包 括在上述培养基组合物中培养来自老年人的间充质干细胞，所述培养基组合物用于将来自 老年人间充质干细胞培养为来自年轻人间充质干细胞，所述培养基组合物含有FBS (胎牛 血清）、抗氧化剂、细胞因子和NAC(N_乙酰-L-半胱氨酸）。
[0032] 用于培养间充质干细胞的基础培养基可以是本领域已知的常规的适合于培养干 细胞的培养基，例如，DMEM、MEM或K-SFM培养基。优选地，所述基础培养基为无血清培养基。 更优选地，所述基础培养基为K-SFM (角化细胞-SFM ;角化细胞无血清培养基）。
[0033] 用于培养间充质干细胞的培养基可补充本领域已知的添加剂，以抑制间充质干细 胞的分化，同时促进其未分化表型的增殖。
[0034] 此外，所述培养基可含有等渗溶液的中性缓冲液（例如，磷酸盐和/或高浓度碳酸 氢盐）以及蛋白营养物（例如，血清如FBS、血清替代品、白蛋白或必需氨基酸及非必需氨基 酸如谷氨酰胺）。此外，所述培养基可含有脂类（脂肪酸、胆固醇、血清HDL或LDL提取物） 以及在大多数这类培养基中发现的其他成分（例如，胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙 酮酸、糖源如葡萄糖、呈任何离子形式或盐的硒、糖皮质激素如氢化可的松和/或还原剂如 β-巯基乙醇）。
[0035] 此外，为了防止细胞彼此贴附或贴附在容器壁上，或防止形成大的聚簇，培养基中 含有抗凝剂会是有利的，例如由Invitrogen出售的抗凝剂（Cat#0010057AE)。
[0036] 其中，采用选自以下添加剂中的一种或多种添加剂会是有利的：
[0037] -干细胞因子（SCF、Steel因子）、二聚化c-kit的其他配体或抗体，以及相同信号 传导通路的其他激活子；
[0038] -其他酪氨酸激活酶相关受体的配体，所述受体例如血小板源性生长因子 (TOGF)、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体以及血管内皮生长因子（VEGF)的受体；
[0039] -提高环腺苷酸cAMP水平的因子，如弗斯可林（forskolin);
[0040] -诱导gpl30的因子，如LIF或制瘤素 -Μ ;
[0041] -造血生长因子，如血栓形成素（ΤΡ0);
[0042] -转化生长因子，如TGF β 1 ;
[0043] -神经生长因子，如CNTF。
[0044] 根据本发明待培养的间充质干细胞可通过例如以下方法获得。
[0045] 分离通过抽脂术或类似技术从腹部获得的人体脂肪组织并用PBS洗涤。然后，细 致切割所述组织，并用含胶原酶的DMEM培养基降解所述组织，之后用PBS洗涤并以lOOOrpm 离心5分钟。除去上清液，用PBS洗涤残留的沉淀并以lOOOrpm离心5分钟。通过100 μ m 过滤网除去上清液并用PBS洗涤残留的细胞。然后，将细胞在DMEM培养基（10%FBS、2mM NAC、0. 2mM抗坏血酸）中培养过夜，培养之后，用PBS洗涤未贴附至培养容器的细胞并在 Keratinocyte-SFM培养基（含有NAC、抗坏血酸、钙、rEGF、BPE、胰岛素以及氢化可的松）中 培养，同时每隔2天更换培养基。从培养基分离间充质干细胞并传代培养，从而获得间充质 干细胞。此外，也可按照本领域已知的任何方法获得间充质干细胞。
[0046] 在本发明的一个实施例中，优选地采用0. 5-lng/mL量的硒作为抗氧化剂。如果培 养基中硒的含量小于0. 5 μ g/Ι，则培养基将对氧中毒敏感，而如果培养基中硒的含量大于 10 μ g/Ι，则将引起严重的细胞毒性。
[0047] 在本发明中，可将胰岛素样生长因子用作胰岛素的替代品。胰岛素样因子的作用 是增强葡萄糖代谢和蛋白质代谢以促进细胞生长。优选地，本发明中采用重组IGF-1 (胰岛 素样生长因子-1)。培养基中胰岛素样生长因子的含量优选为10-50ng/ml。如果胰岛素 样生长因子的含量小于l〇ng/ml，则将出现细胞凋亡，而如果胰岛素样生长因子的含量大于 50 μ g/Ι，将引起细胞毒性并将增加培养基的成本。
[0048] 此外，在本发明的实施例中，培养基中使用表皮生长因子（EGF)。EGF可诱导各种 类型细胞的体内增殖并优选为重组EGF。培养基中EGF的含量优选为10-50ng/mL。如果 培养基中EGF的含量小于10ng/mL，则将没有特别的效果，而如果培养基中EGF的含量大于 50ng/mL，则将有细胞毒性。
[0049] 此外，在本发明中，培养基中使用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)。bFGF可诱导 各种类型细胞的体内增殖并优选为重组bFGF。培养基中bFGF的含量优选为1-lOOng/mL。
[0050] 在本发明的一个实施例中，可发现FBS、bFGF和EGF是培养来自所有年龄组的人脂 肪干细胞的必需因子。特别地，发现缺乏bFGF对培养脂肪干细胞有重要影响。此外，发现 随着细胞源自的人的年龄减小，细胞的生长速率增加。
[0051] 在本发明的另一个实施例中，发现FBS、bFGF和EGF是决定脂肪干细胞的端粒酶活 性的重要因子。此外，可以看出来自20几岁的人的细胞中的端粒酶活性较高，且在不含硒 的培养基中培养的细胞具有低的端粒酶活性。此外，发现当在含硒的培养基中培养来自老 年人的脂肪干细胞时，它们可具有类似于源自年轻人的脂肪干细胞的端粒酶活性。
[0052] 以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员将显而易 见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明的范围。
[0053] 实施例1人脂肪纟目织源件间充质干细朐的分离
[0054] 从20几岁、30几岁、70几岁和80几岁的患者的腹部分离脂肪组织并用PBS洗涤。 细致切割洗涤后的脂肪组织并用含1型胶原酶（lmg/ml)的DMEM培养基在37°C降解2小时。 用PBS洗涤经胶原酶处理的组织，然后以lOOOrpm离心5分钟。除去上清液，然后用PBS洗 涤残留的沉淀并以l〇〇〇rpm离心5分钟。通过100 μ m过滤网过滤离心后的组织以除去上 清液，然后用PBS洗涤并在含有10 % FBS、2mM NAC (N-乙酰-L-半胱氨酸）和0. 2mM抗坏血 酸的DMEM培养基中培养过夜。
[0055] 然后，用PBS洗涤未贴附的细胞，并在含有5% FBS、2mM NAC、0. 2mM抗坏血酸、 0.09mM|丐、5ng/ml rEGF、5yg/ml 膜岛素、10ng/mL bFGF、74ng/ml 氧化可的松以及 lng/ml 硒的Keratinocyte-SFM培养基（RKCM)中传代培养，同时每隔2天更换培养基。细胞传代 培养三次之后，分析来自20几岁、40几岁和70几岁的人的脂肪干细胞的活性。
[0056] 为分析干细胞的活性，测量了干细胞的微观形态、分化标记、端粒酶活性、端粒长 度以及分化能力。
[0057] 结果发现分离自20几岁、40几岁和70几岁的人的脂肪干细胞在传代培养三次之 后具有类似的活性。
[0058] 实施例2、再牛干细朐的培养某纟目合物的确定
[0059] 制备不含作为活性成分添加至用于实施例1中的RKCM培养基的FBS、NAC、抗坏血 酸、钙、rEGF、5 μ g/ml胰岛素、bFGF氢化可的松和硒中之一的培养基。此外，分析来自20几 岁、30几岁、70几岁和80几岁的患者的脂肪干细胞在不含每一种活性成分的培养基中的表 型。
[0060] 制备1号至10号培养基。1号培养基为RKCM培养基，而2号至10号培养基为不 含RKCM培养基中的每一种活性成分的培养基。下表1中示出了培养基中不含的活性成分。
[0061] 表 1
[0062]

【权利要求】
1. 一种用于再生来自老年人的间充质干细胞的培养基组合物，所述培养基组合物含有 FBS (胎牛血清）、抗氧化剂、细胞因子和NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸）。
2. 如权利要求1所述的培养基组合物，其中所述培养基组合物进一步含有胰岛素或胰 岛素样生长因子。
3. 如权利要求1或2所述的培养基组合物，其中所述培养基组合物进一步含有氢化可 的松。
4. 如权利要求1所述的培养基组合物，其中在所述培养基组合物中的细胞因子是 EGF (表皮生长因子）和/或bFGF (碱性成纤维细胞生长因子）。
5. 如权利要求1所述的培养基组合物，其中所述抗氧化剂选自由硒、抗坏血酸、维生素 E、儿茶素、番茄红、β-胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA(二十碳五烯酸）和DHA(二十二碳六烯 酸）构成的组。
6. 如权利要求5所述的培养基组合物，其中所述抗氧化剂是硒。
7. 如权利要求1所述的培养基组合物，其中所述老年人是60-120岁的人。
8. -种再生来自老年人的间充质干细胞的方法，所述方法包括在如权利要求1至7中 任一项所述的培养基组合物中培养来自老年人的间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/02GK104114691SQ201280068567
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2011年12月1日
【发明者】姜成根, 罗廷灿, 朴亨根, 李亢永 申请人:K-干细胞有限公司