专利名称：拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因scpl41及其突变体的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域。具体地，本发明涉及一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因SCPL41及其T-DNA插入突变体在培育耐受正丁醇胁迫、对脱落酸不敏感、对盐胁迫敏感、而且种子个体显著小于野生型拟南芥的种子的转基因植物中的应用。
背景技术：
植物在生长发育过程中往往会受到各种生物或非生物因子的胁迫。植物在接收到外界胁迫信号之后，会及时调整自身的代谢或物质含量来响应外界信号。膜脂是生物膜的骨架成分，而且能在磷脂酶的催化作用下水解后产生的产物来参与多种生理过程以及环境刺激引起的细胞反应。转移磷脂酰基反应(transphosphatidylation)是指,在磷脂酶 D (phospholipaseD, PLD)的催化作用下,甘油磷脂的磷酸二酯键发生断裂，并把磷脂的磷脂酰基转移到伯位醇上或者水上，从而生成磷脂酰醇或者磷脂酸的反应。磷脂酶D (phospholipase D，PLD)广泛存在于哺乳动物的组织与细胞中，催化其主要底物磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC),所生成的直接和间接产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和二脂酰甘油(diacylglycerol, DAG)与溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)均是重要的第二信使物质。这条生化通路被认为是细胞信号转导的重要途径之一。但是在短链伯位醇(从甲醇到正庚醇)存在的情况下，PLD优先催化PC与短链伯位醇发生转磷脂酰基反应(transphosphatidylation)产生稳定的磷脂酰醇(phosphatidyl alcohol)和水,从而抑制了 PA的生成，也就阻止了 PA的进一步代谢以及响应信号的进一步向下传递。由于PLD的转移磷脂酰反应这一特性，研究者们通常使用醇类物质作为PA经PLD途径生成的抑制剂来探究PLD的功能，而且此反应体现出许多生物学作用。转移磷脂酰反应在动物中的生物学作用主要体现于利用转移磷脂酰反应探究乙醇对动物组织或器官的伤害机制和PLD在伤害过程中的作用，以及对转移磷脂酰反应异常引起的疾病的致病机理研究。在乙醇的浸入下，动物细胞中大量的磷脂发生转移磷脂酰反应，形成磷脂酰乙醇(phosphatidylethanol, PtdEt), PtdEt被认为是造成磷脂代谢混乱的原因之一。PtdEt可通过增加膜流动性而改变膜的物理化学特性，它对与膜相连的两种酶有相反的作用，削弱NaVK+-ATP酶的活性，而增强5核苷酸酶的活性。PtdEt还可作为磷脂酰丝氨酸的取代物激活大脑PKC Y，从而改变原有的激活模式。K6tter等(2000)发现乙醇和正丁醇抑制了 PKC活性、阻断了 PLD信号通路，造成大鼠脑皮质星形胶质细胞增殖受阻。这一发现将有助于揭示酗酒引起的胚胎发育不良的原因。以上实验结果及推测暗示着由PLD介导的转移磷脂酰反应可能是导致由乙醇引发的疾病的起因。另外，PLD催化PC与甘油二酯发生转移磷脂酰反应生成的bis-PA与激活人类纤维原细胞血管缓激肽有关；山梨醇的不正常积累引发了转移磷脂酰反应，生成磷脂酰-山梨醇，而这种异常的磷脂的产生改变了膜脂质体的代谢，从而导致糖尿病的发生；而转移磷脂酰反应异常还可能是导致的糖尿病心肌症及心肌缺血再灌注损伤的原因。尽管在植物和微生物中，转移磷脂酰反应的生物学作用仍没有得到具体的体现，但随着研究工作的深入和一些有意义的现象的发现，转移磷脂酰反应的生物学作用正渐渐的得到挖掘。Waltonand Goldfine (1987)发现梭菌属PLD催化的转移磷脂酰反应与膜磷脂重建有关。Dhonukshe等(2003)用正丁醇处理烟草BY-2细胞时发现，转移磷脂酰反应导致了细胞骨架重组，且不同来源的PLD具有不同的转移磷脂酰反应的潜能，PLD同功酶对底物具有立体选择性。这些都暗示着以牺牲重要信号物质-磷脂酸(PA)为代价，而发生转移磷脂酰反应，这一机制必定具有重要的生理作用。在植物中，一般认为水的含量比羟基化合物高50倍时，转移磷脂酰反应仍然存在很高的活性。PLD在一些微生物中表现出更高比例的转移磷脂酰反应活性。来自甘蓝中的PLD2和来自链霉菌(Sti^ptomyces sp.)的PLD表现出相似的水解能力，但在同样的处理下，链霉菌PLD催化磷脂酰胆碱(PC)转化为磷脂酰乙醇胺(PE)的能力比甘蓝PLD2高出24倍，而链霉菌PLD几乎没有水解产物磷脂酸(PA)生成。尽管如此，研究者还是在一些微生物和动物PLD上发现了有意义的现象。色褐链霉菌(Streptomyceschromo-fuscus) PLD是一种|丐离子依赖型酶,且转移磷脂酰反应能力较弱。但以天然存在的羟基化合物甘油二酯作为受体底物时，在色褐链霉菌PLD的催化下发生了·转移磷脂酰反应，反应形成的新磷脂(磷脂酰-醇)可以直接被PLD再水解而生成PA。而钙离子能够引起含PA、磷脂酰丝氨酸及心磷脂等带负电荷磷脂脂质体膜问的融合。因此，由于转移磷脂酰反应的发生使PA的量相对减少，进而促进了水解反应的发生，而水解反应产物的PA在钙离子的作用下与寄主细胞的脂质体问发生膜融合，所以由色褐链霉菌PLD催化的这一系列反应促进了细菌和寄主细胞之间的膜融合，可以看出，磷脂酰-醇的生成有助于细菌侵染真核细胞。另外，微生物和植物PLD作为生物催化剂在磷脂合成工艺中广泛应用。这类研究主要集中在PLD的催化反应效率，底物结构和反应体系的影响，转移磷脂酰反应和水解反应比，以及PLD在细胞外的稳定性等。微生物PLD的发现使转移磷脂酰反应用于规模化合成磷脂成为了现实。80年代起，国外的学者纷纷报道了利用PLD的转移磷脂酰反应制备和合成高纯度的多功能特性的单一磷脂及稀少磷脂，如肌醇磷脂、卵磷脂、丝氨酸磷脂、甘油酰磷脂、心磷脂、磷脂酰葡萄糖、磷脂酰-D-丝氨酸。在医药工业中，利用PLD的碱基转移活性可将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上，制成具有特殊疗效的脂质体。利用PLD还可合成一些抗肿瘤试剂，从而为抗肿瘤药物的酶法合成开辟了新的方向。通过筛选抗正丁醇的突变体可以更直接有效的找到正丁醇胁迫的作用靶点，对进一步解析转移磷脂酰基反应发生机制以及生物学意义提供更为直接的证据。而bis4突变体就是在正丁醇胁迫下而得到的正丁醇不敏感突变体，通过TAIR-PCR鉴定和测序分析，得到突变体 bis4 属于 SCPL41 (serine carhoxypeptidase-like 41, SCPL41)基因功能缺失型突变体。目前，越来越多的证据表明丝氨酸羧肽酶蛋白以及丝氨酸羧肽酶类蛋白在许多逆境响应过程中都起到调控作用。丝氨酸羧肽酶(seine carboxypeptidases, SCP)是一类真核生物蛋白水解酶,亚基分子量40000 75000Da，主要存在于动物的溶酶体和植物或真菌的液泡中。在酸性pH环境下，它们同时具有C末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。植物丝氨酸羧肽酶功能的研究主要集中种子萌发过程中的储藏蛋白的转换和动员、细胞程序性死亡过程中细胞成分的自溶、油菜素内酯信号转导、种子发育、植物次级代谢的酰基转移等。丝氨酸羧肽酶类蛋白是与SCP氨基酸非常相似且与SCP蛋白同属Sc族羧肽酶中的SlO家族。SCPL氨基酸序列在中部区域的保守型较高，N-末端与C-末端的保守型较差。SCPL蛋白均具有I个细胞内分泌和转运的信号肽，多个N-连接糖基化位点以及4个底物结合和催化作用的进化保守区域等SCP典型结构特征。SCPL基因在参与种子萌发中储藏蛋白的水解、细胞程序性死亡中细胞成分的自溶、种子发育、抗逆境等诸多过程中起作用。在拟南芥54个SCPL基因中有4个家族成员BRS1/SNG1/SNG2及CBPX已被克隆，基因表达分析结果暗示它们属于拟南芥正常发育所必须的功能基因。Fraser等人发现拟南芥SCPL中的3个基因SNGl、At2g23000和At2g23010分别编码芥子酰基葡萄糖的酶。这些酶的酰基受体底物是一些变化相对较小的氨基酸残基，它与羟基肉桂酸的酯代谢有关。Lehfeldt等人也发现拟南芥SCPL的SNGl与芥子苹果酸的合成苯丙次生代谢产物有关。同时，Weier等人最近发现，丝氨酸羧肽类蛋白是一个可修饰植物天然产物的新酰基转移酶团体，并且SCPL酰基转移酶主要使用O-葡萄糖酯作为酰基供体。目前已从双子叶植物中鉴定了几种SCPL 酰基转移酶，包括可能与野生型番茄抗虫性有关的葡萄糖聚酯合成所需的酶及拟南芥紫外线保护有关的芥子酯合成所需的酶。另外，Stehle等对植物代谢中的丝氨酸羧肽酶类蛋白酶的结构和底物识别的研究表明，丝氨酸羧肽酶酰基转移酶SCT不一定需要结合带电荷的底物，可以使用多种醇作为底物，形成的芥子碱在苗期发育过程合成卵磷脂，并促进种子成熟过程中胆碱的形成。据报道，SCPL41基因在拟南芥中的所有器官中都有表达，而在花器官和种子中的表达量最闻。
发明内容
本发明的目的是提供拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白SCPL41基因及其T-DNA插入突变体bis4在抗正丁醇胁迫、响应盐胁迫、调控种子大小以及响应脱落酸等方面的应用，为利用转移磷脂酰基反应合成新磷脂、研发脂质体药物、研究与脂类代谢相关疾病等提供了新的方向。为了实现本发明的上述目的，本发明采用了以下技术措施拟南芥基因SCPL41在培育抵抗醇类物质胁迫以及改变转移磷脂酰基反应的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41在培育响应脱落酸的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41在培育耐受盐胁迫的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41在培育以收获种子为主的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41在制备和合成高纯度多功能特性的单一磷脂或稀少磷脂中的应用。拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育抵抗醇类物质胁迫的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育响应脱落酸的转基因植物中的应用。
拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育耐受盐胁迫的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育以收获种子为主的转基因植物中的应用。拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在制备和合成高纯度多功能特性的单一磷脂及稀少磷脂中的应用。上述的应用是基于bis4突变体可以提高植物对醇类物质的耐受性；SCPL41基因参与ABA的响应及信号转导过程，SCPL41基因缺失型突变体bis4对O. 1-10 μ M的ABA不敏感；突变体bis4对盐胁迫敏感；突变体拟南芥bis4的种子显著小于哥伦比亚野生型拟南芥的种子。拟南芥基因SCPL41及其突变体bis4在抗醇类胁迫、响应脱落酸、响应盐胁迫以及调控种子大小方面的应用，可通过转基因等分子遗传技术来获得具有不同抗性的转基因 植物，在上述应用中，不限于应用于植物中，还包括应用于动物和微生物中。拟南芥SCPL41基因在GenBank中的编号是AT5G42230，CDS序列长为1410bp，编码469个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I SEQ ID No I和表2 SEQ ID No 2所示。所述的突变体bis4由中国科学院遗传与发育生物学研究所免费提供，是由一段XVE诱导性标记激活的拟南芥T-DNA插入在五号染色体的1688323bp处，是SCPL41基因的编码区，因此而导致基因功能缺失，插入位点处的侧翼序列如SEQ ID No 3所示。本发明首次提供拟南芥SCPL41基因的一种T-DNA插入突变体bis4对正丁醇胁迫有显著耐受作用、对ABA不敏感、种子明显变小。由此看出，SCPL41基因在众多生理过程中的作用，表明其可能参与许多植物的生长发育过程以及响应逆境胁迫，参与调控PLD介导的转移磷脂酰基反应、调控种子的发育及大小、参与ABA的信号转导过程。研究该基因功能对揭示植物的抗逆机制具有实质性的价值，对转移磷脂酰基反应的生物学意义及应用提供更为广阔的思路，对改善农作物性状及农业生产具有重要的指导意义。
图I为突变体bis4卡那霉素抗性鉴定；图2为TAIL-PCR扩增突变体的T-DNA侧翼序列；图3为bis4突变体对正丁醇不敏感与雌二醇存在无关；图4为不同正丁醇浓度下bis4突变体的绿苗率显著高于野生型拟南芥；图5为FDA染色检测在正丁醇胁迫5天后bis4突变体根尖的细胞活力显著高于野生型；图6为在正丁醇胁迫下野生型拟南芥根尖细胞明显变形而bis4突变体根尖细胞正常；图7为正丁醇胁迫5天后野生型拟南芥和bis4突变体根尖周质微管结构；图8A、图8B为bis4突变体对ABA不敏感；图9为bis4突变体对盐胁迫敏感；图10A、图IOB为bis4突变体的种子显著小于野生型拟南芥种子。
具体实施例方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。实施例I :突变株的获得本发明所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白41 (serine carboxypeptidase-like 41)在GenBank中的编号是AT5G42230，该基因的CDS长1410bp，核苷酸序列如表I SEQ ID NoI所示，编码469个氨基酸，氨基酸序列如表2 SEQ ID No 2所示。此基因的XVE诱导性标记激活的拟南芥T-DNA插入株系种子，由中国科学院遗传与发育生物学研究所免费提供。把从中科院遗传所获得的一批XVE诱导性标记激活的T-DNA插入突变体的种子随机点在含有O. 04%浓度的正丁醇的培养基上，并筛选得到可以在含有正丁醇培养基上可以生长的幼苗，并收集种子，再用同样的办法进行第二代的筛选，如此反复三次，得到正丁醇·抗性可以稳定遗传的株系，命名为bis4(butanol insensitive mutant 4)。表I拟南芥丝氨酸羧肽酶基因SCPL41核苷酸SEQ ID NO : I⑶S序列表I ATGGCTATTG TGTCGTTGCG CGATGTGGCC ATGGTGATGG TGACAGTGCA51 GGTGTTTGCA CGAGGGTATC CGGAAACAGA TTTGGTTGTG AGGCTTCCTG101 GTCAACCAAA GGTTGTATTC AGACAGTACG CAGGGTATGT TGATCTCGAC151 TTGAATGCTG GCCGTAGCCT TTTCTACTAC TTCGTGGAAG CTGAAAAACA201 CCCTGACACA AAACCGTTAA CCTTGTGGCT CAATGGAGGT CCAGGTTGTT251 CTTCTGTTGG TGGAGGAGCT TTCACTGAGC TAGGTCCATT TTACCCCACA301 GGATATGGGC GTGGTCTTCG CATTAACTCC ATGTCGTGGA ACAAAGCCTC351 AAACCTGCTA TTTGTGGACT CACCGGCTGG AGTTGGTTGG TCTTACTCCA401 ACCGAAGCTC TGATTACAAC GCTGGGGACA AGTCTGCGGC CAGCGATATG451 CTCGTGTTCT TGTTGAGATG GTTCGATAAG TTCCCGGAGT TGAAGTCTCA501 CGATCTCTTT CTCACTGGCG AAAGCTATGC AGGACATTAC ATACCTCAAC551 TGGCTGATGC GATTCTCAGC TATAACTCAC GCTCAAGTGG GTTCAAATTC601 AACATCAAAG GCATTGCAAT AGGGAATCCA CTTCTGAAGC TTGACAGGGA651 CATTCCAGCT GTATACGAGT TCTTCTGGTC GCATGGCATG ATCTCTGAGG701 TAGTGGGACG TACAATCAAG ATTCAATGTG ACTTCTCACA TTACACATAT751 GCATACCCCC ATAACGTAAG TGATGCCTGC AACGATGCTA TCCGTGAAGC801 CGGAGACATC ACCACTGAGT ATGTCAATAC CTTTGATGTT CTCCCTGACC851 TATGCTACCC ATCTATTGCC CTGCAAGAGC TAAGGCTTAA ACAAATGGCT901 ACTAAGATGA GCATGGGAGT GGATGTGTGT ATGAACTACG AAAGACAGTT951 CTACCTAAAT ATCCCAGAGG TACAGATGGC TCTTCACGCA AACCGCACAA1001 ACCTGCCTTA TTCATGGTCT TTGTGCAGCA ACCTGTTAAA CTACTCTGCC1051 ATCGATGTAA ACACCAACAT GCTTCCGACT CTGAAGAGAA TTATACAGAA1101 CAAAATTCCT GTTAGGATCT TCAGTGGAGA TCAAGATTCT GTAGTTCCAT1151 TTCTGGGAAC ACGAACTATC GTAGGAGAAC TCGCCAACGA TCTCAATTTC1201 AAGACGACAG TTCCATATGG AGTGTGGTTC CACAAAAGAC AGGTTGGAGG1251 CTGGGCCATC GAGTATGGAA ACCTACTAAC TTTTGCAACA GTGAGAGGAG
1301 CGGCTCATGC GGTGGCGTAC ACGCAGCCCT CACGAGCTCT GCATCTATTC1351 AGCACCTTTC TTCGTGGGCA GAGATTGCCC AACAAGACAG ATATTGCTAT1401 GCATGACTGA表2拟南芥丝氨酸羧肽酶基因SCPL41氨基酸SEQ ID NO 2⑶S序列表I MAIVSLRDVA MVMVTVQVFA RGYPETDLVV RLPGQPKVVF RQYAGYVDLD51 LNAGRSLFYY FVEAEKHPDT KPLTLffLNGG PGCSSVGGGA FTELGPFYPT101 GYGRGLRINS MSffNKASNLL FVDSPAGVGff SYSNRSSDYN AGDKSAASDM
151 LVFLLRffFDK FPELKSHDLF LTGESYAGHY IPQLADAILS YNSRSSGFKF201 NIKGIAIGNP LLKLDRDIPA VYEFFffSHGM ISEVVGRTIK IQCDFSHYTY251 AYPHNVSDAC NDAIREAGDI TTEYVNTFDV LPDLCYPSIA LQELRLKQMA301 TKMSMGVDVC MNYERQFYLN IPEVQMALHA NRTNLPYSffS LCSNLLNYSA351 IDVNTNMLPT LKRIIQNKIP VRIFS⑶QDS VVPFLGTRTI VGELANDLNF401 KTTVPYGVffF HKRQVGGffAI EYGNLLTFAT VRGAAHAVAY TQPSRALHLF451 STFLRGQRLP NKTDIAMHD实施例2 突变株的鉴定I、卡那霉素抗性鉴定将通过复筛获得的正丁醇突变体种子bis4播种于含有20mg/L卡那霉素和10μπιο1/117-β-雌二醇的MS培养基上。经2天春化处理后，在培养室萌发。5_7天后进行表型观察(图I)，同时挑选抗性植株转移到常规MS培养基上继续生长10天左右，再转移至营养土中扩繁种子。2 =T-DNA插入位点的鉴定用简易微量的DNA提取法提取正丁醇不敏感突变体bis4Tl代DNA，T-DNA插入位点的鉴定利用 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced-POlymerase Chain Reaction)方法进行。⑴引物根据pER16表达载体T-DNA插入片段的左边界设计巢式PCR引物为巢式引物LexA2 5/ -CTAATCGCATTATCATCCCCTCG-3'；LexA4 5/ -CTGGTTTTATATACAGCAGTCGACG-3'；LexA5 5/ -AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3'；四个随机引物ADI (AGCT) TCGA (G/C) T (A/T) T (G/C) G (A/T) GTTAD2 :NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAAAD3 (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGAAD4 AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG⑵反应组分
权利要求
1.拟南芥基因SCPL41在培育抵抗醇类物质胁迫以及改变转移磷脂酰基反应的转基因植物中的应用。
2.拟南芥基因SCPL41在培育响应脱落酸的转基因植物中的应用。
3.拟南芥基因SCPL41在培育耐受盐胁迫的转基因植物中的应用。
4.拟南芥基因SCPL41在培育以收获种子为主的转基因植物中的应用。
5.拟南芥基因SCPL41在制备和合成高纯度多功能特性的单一磷脂或稀少磷脂中的应用。
6.拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育抵抗醇类物质胁迫的转基因植物中的应用。
7.拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育响应脱落酸的转基因植物中的应用。
8.拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育耐受盐胁迫的转基因植物中的应用。
9.拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在培育以收获种子为主的转基因植物中的应用。
10.拟南芥基因SCPL41的T-DNA插入突变体bis4在制备和合成高纯度多功能特性的单一磷脂及稀少磷脂中的应用。
全文摘要
拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因SCPL41及其T-DNA突变体在提高植物抗醇类胁迫、对盐胁迫敏感、对脱落酸不敏感、调控种子大小中的应用。借助模式植物拟南芥，通过转基因技术证实SCPL41基因的缺失表达使得拟南芥可以耐受一定浓度正丁醇胁迫，并且对脱落酸(abscisic acid，ABA)不敏感、对盐胁迫敏感、种子个体显著小于野生型拟南芥的种子。SCPL41基因在众多生理过程中的作用，表明其参与许多植物的生长发育过程以及响应逆境胁迫参与信号转导过程，为利用转移磷脂酰基反应来合成新的磷脂提供新的技术方法，而且这些功能在农作物生产中有较好的应用前景。
文档编号C12N15/57GK102911954SQ20121001319
公开日2013年2月6日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者李唯奇, 贾艳霞, 苏一兰 申请人:中国科学院昆明植物研究所