专利名称：一种hpv18l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种HPV18L1多核苷酸序列，还包括一种表达载体和宿主细胞及其多核苷酸序列、表达载体和宿主细胞在制药和制剂方面的应用。
背景技术：
在多种物种包括绵羊，狗，兔子，猴子，牛和人中已发现乳头瘤病毒的感染。人乳头瘤病毒(简称HPV)已分出上百个型别，如果LI基因与以前鉴定的型别的LI序列的同一性低于90%，那么这种型别可确定为新的型别，如果LI氨基酸序列同一性是在90到98%之间则为亚型，同一性在98%以上为变体[与原型(亲代类型)相比]。
人乳头瘤病毒是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，目前已发现100多种亚型。致病HPV的类型主要有6，11，16，18等。依据HPV能否致癌可将其分为致癌的高危型和不致癌的低危型两类。低危型HPV主要包括6，11，13，32，42，43，44等。高危型HPV 主要包括 16，18，45，52，56，58 等。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位；每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，其中，80%的死亡发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13. 8万，每年约有5万人死于宫颈癌。大量研究资料证明，生殖道的人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌有着十分密切的关系-约80%的宫颈癌与4种类型(16、18、31型和45型)的HPV感染有关，其中，50%的宫颈癌与HPV16感染相关。目前，对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果也不理想。宫颈癌的复发率较高且治疗费用也高。2005年，美国约有I万例新确诊的宫颈癌患者，约有3700例患者死亡。在大多数人中，人乳头瘤病毒可于感染后自行消失。然而，少数情况下，某些高危类型的人乳头瘤病毒如果未被检出和治疗，可以导致宫颈癌。此夕卜，某些低危类型的人乳头瘤病毒可以导致尖锐湿疣。在美国，每年用于宫颈癌筛查和治疗的费用约为5. 7亿美元，每年约有100万例尖锐湿疣，约有470万女性由于巴氏涂片检查(Pap)结果异常需要进行随访，其中，至少有300万例此类异常结果是由某些人乳头瘤病毒导致的。HPV是一种小的DNA病毒，直径45_55nm，衣壳呈二十面体立体对称，没有囊膜，完整的病毒颗粒氯化铯中浮密度为I. 34g/mL，在密度梯度离心时易与无DNA的空壳(密度1.29g/mL)分开。HPV基因组是一闭环双股DNA，分子量5*106道尔顿。按功能可分为早期(E区)，晚期(L区)和非编码区(NCR)三个区域，E区分为E1-E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。例如El蛋白是一种DNA解旋酶，参与病毒DNA复制过程的起始，E2是一种调控蛋白，控制病毒基因的表达和DNA的复制。E2通过其既结合El又结合病毒复制起点的作用，使El在所述起点局部聚集，从而，刺激病毒DNA的复制起始。E4蛋白具有多种没确定的功能，但结合宿主细胞骨架属于上述功能，E5延迟体内的酸化，导致细胞表面的EGF受体表达增加，已知E6和E7各自都能结合细胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成与宫颈癌有关的HPV型别，是已知的致癌基因。NCR是E区与L区间-6. 4-1. Okp的DNA片段，可负责转录和复制的调控。L区分LI和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。已经鉴定LI和L2基因是好的免疫预防靶，对于绵尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)系统的研究表明，用细菌中表达的LI和L2蛋白或使用疫苗载体的免疫方法能保护动物不受病毒感染。在杆状病毒表达系统中表达人乳头状瘤病毒LI基因或使用疫苗载体导致组装成病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。大量研究已表明，VLPs具有良好的免疫原性和反应性，高诱导机体产生高滴度的中和抗体，以此为基础来研制疫苗显得很有前途。LI基因编码的主要衣壳蛋白能刺激机体产生保护性抗体，可避免机体再受同型别HPV的感染。疫苗在历史上一直被视为预防病原体感染的一种方式，如果发生感染，疫苗可激发免疫系统，以识别并中和病原体。疫苗包含一种或多种来自病原体的抗原，通常是已灭活的或减毒的完整生物体，或者是来自所述生物体的特定抗原肽，当将免疫系统暴露于抗原时，产生使个体终生保持对所述抗原免疫记忆的细胞。再次接触相同抗原包括感染所述病原体时刺激特异性免疫应答，从而清除感染的病原体或使感染的病原体失活。有关HPV的基础研究的高峰期已经过去，应用时代包括诊断和疫苗的临床应用正 在走来，特别是高危型如HPV16U8的预防性疫苗产品即将得到越来越广泛的临床使用甚至是广泛普及。截至目前，世界上开发成功的宫颈癌疫苗主要是两种预防性疫苗一种是Merck(默克)药厂研制的四价疫苗，主要针对引起宫颈癌的两个HPV高危型16、18和引起生殖道尖锐湿疣的两个HPV低危型6、11 ;另一种是GSK (葛兰素)药厂研制针对HPV高危型16、18的二价疫苗，2006年6月先后获得欧洲与美国FDA的批准上市。默克公司应用啤酒酵母和葛兰素史克公司应用昆虫细胞-杆状病毒研发的人乳头瘤病毒疫苗都已上市，主要在欧洲免疫接种，一人份的费用是350美元，这个价格在我国显然太高，不能被普通大众接受。对于基因工程蛋白疫苗的研制，除了目的基因的选择之外，重组蛋白表达系统的选择也同样重要。对于整合表达系统所表达的LI蛋白，可自我组装成VLPs。目前国际上研究较多，适合工业化生产的是酵母表达系统，它不仅具有原核表达系统快捷、方便、费用低等优点，并且兼有真核表达系统的翻译后加工、修饰等特点，使表达的LI蛋白能自我组装成VLPs，具有良好的抗原性。本发明中使用的表达系统中宿主细胞为汉逊酵母(Hansenula polymorpha),甲醇酵母是近几年逐渐发展起来的一类作为细胞工厂表达外源基因特别是真核生物基因的理想宿主，其中多形汉逊酵母是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统，适于大规模工业化生产外源蛋白，汉逊酵母的技术优势和产业化应用价值可归纳为(I)最适生长温度高(37 43°C，毕赤酵母与酿酒酵母为28°C)，生长速率快，利于大规模发酵生产，可以高效表达许多在其它系统中难以高效表达的基因。(2)外源基因整合于细胞染色体中，重组菌株有丝分裂遗传稳定性高。(3)能利用廉价的化学合成培养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天然组分(如酵母粉、蛋白胨)，进一步降低了生产成本并提高了外源基因的表达水平。易于培养，能够在廉价培养基中高密度培养，菌体密度高达100 130g/L干重。(4)具有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子。汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需基因，对进行多基因改造提供了有利条件。(5)多形汉逊酵母具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高等优点，是一个已得到广泛关注的外源基因表达系统。(6)在分泌型表达中，外源蛋白通过分泌途径可完成蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工过程 ，使所表达的蛋白更接近具有生物学活性的天然蛋白形式。(7)与酿酒酵母相比，多形汉逊酵母在表达糖蛋白方面具有显著优势，其本身的甘露糖链总长度比较短，糖基化修饰比较简单，易于进行糖基化改造。(8)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子，高效地启动外源基因的表达。蛋白的表达通常在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用。(9)耐高温，最适生长温度为37_43°C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短。发酵中以甘油或甲醇为唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，发酵染菌率低。
发明内容
本发明的目的是提供了一种HPV18L1多核苷酸序列，该序列编码HPV18L1氨基酸序列，从而使利用汉逊酵母表达系统工业生产HPV18L1衣壳蛋白成为现实，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产率更高、成本低等优点。本发明的另一目的是提供一种对应的表达载体。本发明的另一目的是提供一种宿主细胞。本发明的又一目的是提出所述HPV18L1多核苷酸序列和对应的表达载体、宿主细胞在制药和制剂方面的应用。本发明是技术方案如下首先，提供了一种HPV18L1多核苷酸序列，如SEQID NO. 2所示，该序列如下ATGGCCCTGTGGAGACCATCCGACAACACCGTCTACCTGCCACCACCATCCGTCGCCAGAGTCGTCAACACCGATGACTACGTCACCAGAACCTCCATCTTCTACCACGCTGGCTCCTCCAGACTGCTGACCGTCGGCAACCCATACTTCAGAGTCCCAGCGGGCGGTGGCAACAAGCAGGACATTCCAAAGGTCTCCGCTTACCAGTACAGAGTCTTCAGAGTCCAACTGCCAGACCCAAACAAGTTCGGCCTCCCAGACACCTCCATCTACAACCCAGAGACCCAGAGACTGGTGTGGGCTTGCGCTGGCGTCGAGATCGGCAGAGGACAGCCACTGGGCGTTGGCCTGTCGGGCCACCCATTCTACAACAAGCTTGACGACACCGAGTCCTCCCACGCCGCCACCTCCAACGTCTCCGAGGATGTCAGAGACAACGTCTCCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGCCCCAGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCGCTTGCAAGTCCAGACCACTGTCCCAGGGCGACTGCCCACCACTGGAGCTGAAAAACACCGTCCTGGAAGACGGCGACATGGTCGACACCGGCTACGGCGCCATGGATTTCTCTACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTCCCACTCGACATCTGCCAGTCCATCTGCAAGTACCCAGACTACCTCCAAATGTCCGCCGACCCATACGGCGACTCCATGTTCTTTTGCCTGAGAAGAGAGCAGCTGTTCGCCAGACACTTCTGGAATAGAGCCGGCACCATGGGCGACACCGTCCCACAGTCCCTGTACATCAAGGGCACCGGCATGAGAGCCTCCCCTGGCTCCTGCGTCTACTCCCCATCCCCATCGGGCTCCATCGTCACCTCCGACTCCCAGCTGTTCAACAAGCCATACTGGCTGCACAAGGCCCAAGGCCACAACAACGGCGTCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTCACCGTCGTCGACACCACCAGATCCACCAACCTGACCATCTGCGCCTCCACCCAGTCCCCAGTCCCAGGTCAGTACGACGCTACCAAGTTCAAGCAGTACTCCAGACACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGACGTCATGTCCTACATCCACTCCATGAACTCCTCCATTCTTGAGGATTGGAACTTTGGCGTCCCA
CCACCACCAACCACCTCCCTGGTCGACACCTACAGATTCGTCCAGTCCGTCGCCATCACCTGCCAGAAGGACGCTGC
CCCAGCCGAGAACAAGGACCCATACGACAAGCTGAAATTCTGGAACGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCTCGCTGGACC
TTGACCAGTACCCACTGGGCAGAAAGTTCCTGGTGCAGGCAGGACTGAGAAGAAAGCCAACCATCGGCCCAAGAAAG
AGATCCGCCCCATCCGCCACCACCTCCTCCAAGCCAGCCAAGAGAGTCAGAGTCAGAGCTAGAAAGTAA该多核苷酸序 列的密码子使用通过表达宿主菌株汉逊酵母基因的密码子偏爱方式优化。本发明提供的编码HPV18L1多核苷酸序列，密码子使用方式参照高表达的汉逊酵母基因的密码子偏爱模式人工设计得到。人工设计时期望所述多核苷酸序列的密码子使用与高表达的汉逊酵母基因的密码子使用方式更加接近。所述多核苷酸序列是双链DNA序列，所述优选多核苷酸序列编码人乳头瘤病毒18型LI，因此，本发明提供了一种合成基因，该基因包含开放阅读框编码HPV18L1氨基酸序列，其中通过选择使可能用于编码所述氨基酸序列的密码子类似汉逊酵母的优化密码子，以使在合成基因中密码子的使用频率极类似于高表达的汉逊酵母基因，而不是人乳头瘤病毒基因。所述密码子使用与高表达的汉逊酵母基因使用系数最大或次大的密码子。将HPV18L1氨基酸序列全长508氨基酸，转换为汉逊酵母偏爱密码子模式的核苷酸序列，首选兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一位的密码子，主要使用兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子完成局部调整，利用DNAMAN软件避免过长互补序列、重复序列，通过RNA结构预测，避免过长复杂的发卡结构，排除强二级结构，增加特异性的分子内部稳定性。基因的核苷酸序列中还避免出现可能对基因转录、转译效率带来不利影响的序列，如内含子剪接序列、转录终止序列、内部启动子序列(TATA)和核糖体结合位点(GGAGG)等。转录终止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG(富含 T)TA(G)GT、(富含 AT) TTT 等。本发明提供了序列2的多核苷酸序列，对应附图2所示氨基酸序列，保持了汉逊酵母基因的密码子偏爱性。还提供了一种多肽，它包含所述的HPV18L1多核苷酸序列。该多肽包含一种或多种点突变，从而使该多肽的一种或多种天然的生物功能表达物利于纯化工艺和后续疫苗制备。进一步，所述多肽包含HPV18晚期基因产物的全部或一部分。进一步，上述的多核苷酸序列，以高表达的汉逊酵母基因的偏爱密码子使用系数为参照，首选兼并密码子中汉逊酵母使用系数最大的密码子，主要使用兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子。同时，上述多核苷酸序列为保持了汉逊酵母密码子偏爱使用方式的片段或类似物。本发明还提供了一种表达载体，它包含上述的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与载体调控序列可操作连接，所述调控序列能使宿主细胞表达该多核苷酸序列。所述的表达载体，它能使所述多核苷酸序列在汉逊酵母宿主细胞中表达。本发明所提供的表达载体，其包含本发明的多核苷酸序列并能够引导该多核苷酸序列的表达，该多核苷酸序列编码HPV18L1氨基酸序列，所述表达载体是PMPT-HPV18L1，其构建方法如附图5所示。所述表达载体还包括的汉逊酵母甲醇氧化酶基因(MOX)启动子、甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、I. Okb的自主复制序列HARS、脲嘧啶基因ScURA3及pBluescrip II质粒基因几个元件。可以将各种方法用于上述元件中HPV18L1基因的分子克隆、突变与鉴定。这些方法包括，但不限于，在合成HPV18L1人工序列后所构建含HPV18L1基因的细菌(如JM109、DH5a等)的cDNA或基因组DNA文库，在适当的表达载体系统中可直接完成HPV18L1基因的功能表达。另一个方法包括用编码HPV18L1的部分DNA筛选质粒穿梭载体在细菌或汉逊酵母中构建的含HPV18L1的cDNA或基因组DNA文库。这一部分DNA是根据上述汉逊酵母优选HPV18L1核苷酸序列的设计的寡核苷酸引物，通过特异聚合酶链式反应(PCR)来扩增HPV18L1的DNA片段得到的。另一个方法是从产生HPV18L1的细胞分离RNA并通过体外或体内翻译系统将RNA翻译成蛋白质。将RNA翻译成肽或蛋白质将导致产生至少一部分的HPV18L1蛋白，这部分HPV18L1蛋白可以通过与抗HPV18L1抗体的免疫反应性得到鉴定。在这一方法中可以分析从产生HPV18L1细胞分离的RNA库中至少编码一部分HPV18L1的RNA的存在,可以进一步分级分离RNA库以便从中纯化HPV18L1RNA，分析这一方法产生的肽或蛋白质，以提供氨基酸序列，这些氨基酸序列用于提供生产HPVlSLlcDNA的引物，或可以分 析用于翻译的RNA，它提供编码HPV18L1的核苷酸序列并产生用于筛选HPV18LlcDNA文库的探针。这些方法是本领域已知的并能在例如《分子克隆》(实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，1989)中找到。通过分子克隆方法得到的克隆HPV18L1DNA或其突变体片段，要插入所述表达载体，该载体含有适当的(MOX)启动子和其它适当的转录调节元件如(MOX)终止子、自主复制序列HARS、尿嘧啶基因URA3及pBluescrip II质粒基因。所述表达载体按照分子生物学领域的常规来构建，例如，可使用质粒DNA和适当的起始密码子，启动子，增强子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信号，将它们以正确的方向连接后具有调控功能，以便实现蛋白的表达。适当的载体对本领域技术人员来说是已知的。本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述的多核苷酸序列或表达载体。所述宿主为一种零回复突变的尿嘧啶营养缺陷型多型汉逊酵母受体菌株，应用基因敲除技术建立的URA3-营养缺陷型宿主细胞株HU-II。所述的宿主细胞具有表达载体能够补偿用于转化子筛选的URA3营养缺陷。本发明还提出了上述的多核苷酸序列对应产物在治疗或预防HPV感染制剂方面应用。本发明还提出了上述多核苷酸序列或多肽或表达载体或宿主细胞在治疗或预防皮疣，非典型鳞状细胞，宫颈发育异常，颈上皮内瘤形成或宫颈癌药物方面的应用。本发明进一步涉及汉逊酵母表达HPV18L1多肽、多肽片段或其类病毒颗粒在制备宫颈癌疫苗中的用途。有多种适用的汉逊酵母表达HPV18L1多肽、多肽片段或其类病毒颗粒纯化方法。包括但不限于盐分级分离，离子交换层析，分子筛层析，羟磷灰石吸附层析、疏水作用层析和亲和层析(通过使用特异于全长HPV18L1、HPV18L1的多肽片段的单克隆或多克隆抗体制成的免疫亲和柱，或融合特异蛋白标签的全长新生HPV18L1、HPV18L1的多肽片段使用特异于标签的亲和柱)的各种组合或分别应用，从细胞溶胞物和提取液中纯化汉逊酵母重组HPV18L1 蛋白。
DNA代码有4种(A、T、C和G)，其中每三个字母组成的密码子代表生物体的基因所编码的蛋白的氨基酸。沿DNA分子线性排列的密码子被翻译成所述基因所编码的蛋白质中氨基酸的线性序列。密码子有高度的简并性，61种密码子编码20种天然氨基酸。因此，大部分氨基酸由一种以上的密码子编码-实际上数种氨基酸由4种或更多种不同的密码子编码。由于遗传密码是简并的，一个以上的密码子可用于编码特定的氨基酸，所以，氨基酸序列可以被任何一组类似的DNA寡核苷酸编码。当有一种以上的密码子编码一种特定的氨基酸时，不同物种在密码子的选择方面显示不同的偏爱性，且密码子的使用在物种的高水平表达和低水平表达的基因之间也有显著的不同。例如，在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达的病毒基因具有对于有效的表达来说不适当的密码子分布。已发现数例将宿主中罕见的密码子更改为宿主优选的密码子提高了异源表达水平的情况。如果异源DNA序列中存在宿主中罕见的密码子，那么异源基因在所述宿主中的低水平异源表达可能性很大。有效的酵母表达系统包括两个主要元件启动外源基因高效表达的载体系统和具有特定筛选标记的宿主细胞。由于多形汉逊酵母同源重组的频率较低，只有当两侧的同源序列大于Ikb时才可能利用类似于酿酒酵母的基因破坏法获得基因阻断突变株，因此目前使用的营养缺陷型菌株多是通过化学诱变得到的，它们突出的缺点是遗传稳定性较低，难于获得理想的转化子，而且可能存在多重突变效应，使细胞的生理生化特性与野生型细胞存在明显差异，为大规模工业生产带来不便。我们构建了一种零回复突变的尿嘧啶营养缺陷型多型汉逊酵母受体菌株，应用基因敲除技术建立的URA3-营养缺陷型宿主细胞株HU-Il (CGMCC No. 1218)已申请的发明专利为CN1651570A。所构建的遗传稳定、尿嘧啶营养缺陷型的重组多形汉逊酵母宿主菌株，特别是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-Il CGMCC No. 1218，该菌株比目前国内外所用的营养缺陷型宿主菌遗传稳定性高，回复突变率低，便于进行遗传转化和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株的培养和外源蛋白的高效表达，具有较高的工业应用价值。可以通过许多技术包括但不限于转化，转染，脂质转染，原生质体融化，和电穿孔将表达载体导入到宿主细胞中。克隆繁殖含有表达载体的细胞并各个分析以确定它们是否转入上述人工设计合成HPV18L1基因或其突变体(片段或融合标签的片段或全长)，是否 产生重组HPV18L1多肽或多肽片段，甚至是否形成该多肽的多聚物。可以通过几条途径对HPV18L1表达宿主细胞克隆进行鉴定，这些途径包括但不限于，与抗HPV18L1抗体的免疫反应性。可以回收HPV18L1蛋白以提供纯化形式的HPV18L1进一步完成对目标蛋白的鉴定，包括但不限于电镜检查、分子量测定、质谱、等电点测定、动态光光散射的方法。本发明具有的优点和积极效果是本发明通过对HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重组HPV18L1衣壳蛋白在汉逊酵母系统中高效表达，而且通过电镜检查证明表达得到的是与天然HPV18L1的VLP具有相同免疫原性和抗原性的50nm左右的类病毒颗粒。本发明使得利用汉逊酵母表达系统工业生产HPV18L1衣壳蛋白成为现实，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产率更高、成本低等的优点。
图I是病毒编码的HPV18L1核苷酸序列及编码的氨基酸序列；图2是本发明合成的HPV16L1核苷酸序列及编码的氨基酸序列；
图3是序列2所示的DNA序列同病毒码及汉逊酵母偏爱密码子模式分布比较情况表;图4是HPV18截短LI合成编码基因对应氨基酸序列；图5是表达载体构建不意图；图6是琼脂糖凝胶电泳图谱；图7是west-blot (蛋白印迹)图；图8是HPV18L1类病毒颗粒(VLPs)电镜照片。
具体实施方式
实施例I :HPV18L1基因序列优化将HPV18L1氨基酸序列全长508氨基酸，转换为汉逊酵母偏爱密码子模式的核苷酸序列，首选兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一位的密码子，主要使用兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子完成局部调整，利用DNAMAN软件避免过长互补序列、重复序列，通过RNA结构预测，避免过长复杂的发卡结构，排除强二级结构，增加特异性的分子内部稳定性。基因的核苷酸序列中还避免出现可能对基因转录、转译效率带来不利影响的序列，如内含子剪接序列、转录终止序列、内部启动子序列(TATA)和核糖体结合位点(GGAGG)等。转录终止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG (富含 T) TA (G) GT、(富含 AT) TTT 等。最终确定由1524个碱基组成的整个序列，如序列表中序列2所示，编码的氨基酸序列如附图2，同序列表中病毒码序列I编码的如附图I的氨基酸序列相比一致，利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，该汉逊酵母偏爱的核苷酸序列密码子同病毒码及汉逊酵母偏爱密码子模式分布比较情况如附图3所示。实施例2 HPV18L1基因及HPV18L1突变基因表达载体构建利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，序列两端加上限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别位点。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，_20°C保存备用。以多形汉逊酵母CGMCC 2. 2497基因组DNA为模板，克隆I. 5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、I. Okb的自主复制序列HARS ；并从YIp5 (GeneBank Acession NO. L09157)质粒中克隆出I. Ikb的酿酒酵母脲嘧啶基因ScURA3 ;将上述4部分连接后，插入pBluescrip II质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。用EcoR I和BamH I酶切载体pMPT_02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大片段，T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，连接反应16 °C隔夜，反应液转化天根生化科技(北京)有限公司TOPlO感受态细胞，用带氨苄青霉素抗性的平皿筛选转化子，对平皿上长出的大肠杆菌转化子使用引物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3 和 primer :5 ‘-GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG-’3 通过PCR扩增筛选含载体PMPT-HPV16L1的转化子，筛选得到的转化子扩大培养，用宝生物工程大连有限公司的质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0)提纯得到表达载体PMPT-HPV18L1，载体构建示意图见附图5。
使用引物primer fd :5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’ 3 和引物 pl8J2 :5 ^-CGGGATCCAGATCTTCATTACAGTCCTGCCTGCACCAG-’3，以 pMPT-HPV 18L1 模板 PCR 扩增，得到序列 3所示的DNA序列，为HPV18截短LI合成编码基因序列，其对应的氨基酸序列如附图4所示。序列3用上述同样的双酶切、回收、连接、转化、筛选和提纯得到相应的表达载体。实施例3 :表达载体电转化汉逊酵母感受态宿主细胞用Sac I酶切载体pMPT_HPV18Ll，使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，I. 5kV，50 μ F，200 Ω，3_5mSec)转化多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha) CGMCC NO. 1218。在含有 I. 34g/100ml YNB (酵母氣源基础培养基)，2g/100ml葡萄糖的培养基平板上筛选转化子。实施例4 目的基因多拷贝转化子的筛选、基因测序及拷贝数检测 I.细胞破碎取约ImLlOOD酵母菌体至I. 5mL离心管,6000rpm离心5min后去上清,加入与沉淀菌体体积相同的酸洗玻璃珠，100 μ L细胞破碎液，置于振荡器上振荡5min lOmin。2. DNA 抽提细胞破碎完成后，在离心管中加入100 μ L无菌水，再加100 μ L酚/氯仿抽提液，混匀后4°C放置十分钟，IOOOOrpm离心5min,取上清I μ L用于扩增反应。3. PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测使用弓丨物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-，3 和 primer rs 5 ‘ -GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG- ’ 3对以上制备的DNA模板PCR扩增，以上引物可同时扩增汉逊酵母单拷贝的MOX基因和通过载体转化整合到汉逊酵母中的目的基因即HPV16L1基因。所扩增HPV16L1片段长度为1500bp，扩增的MOX片段长度为2061bp，在I. O %琼脂糖凝胶加样孔中上样5 μ L，电泳完毕取出凝胶摄像，电泳照片见附图6，其中1500bp左右条带为HPV16L1基因条带，2000bp左右条带为MOX基因条带。其中，2、3、5、6、7道是高拷贝转化子；4、9道是较高拷贝转化子；8道是地拷贝转化子；1道是宿主菌(阴性对照)；10道是DL2000Marker，从上至下依次为 2000bp、IOOObp、750bp。4.多拷贝株目标基因测序以上扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳后用DNA纯化试剂盒抽提1500bp的DNA片段进行基因测序，与设计基因比对结果一致。5.多拷贝转化子实时定量PCR检测拷贝数已知MOX基因为汉逊酵母的单拷贝基因，以MOX基因为内标，设计引物对同一样品同时扩增MOX基因片段和HPV18L1基因片段并用荧光定量PCR仪检测，通过相对比较而确定单个细胞包含的HPV18L1基因拷贝数。基因通过质粒载体转化到受体菌并稳定整合后才能高效表达，其拷贝数一定程度上反映高效表达的工程菌株表达目的蛋白的特性。由于MOX基因在汉逊酵母基因组中是单拷贝，故HPV18L1片段的量/MOX片段的量即为每个细胞的HPV18L1基因的拷贝数。设HPV18L1片段扩增到达阈值时的DNA分子数为Xnh,原样品即PCR反应模板的DNA分子数为Xtlh ；Μ0Χ片段扩增到达阈值时的DNA分子数为Xnm,原样品即PCR反应模板的DNA分子数为Xtlm ；HPV18L1和MOX片段扩增到达阈值时的临界循环数分别为Cth和Ctm ;荧光阈值为Rt ；HPV18L1和MOX扩增片段结合的荧光染料荧光强度系数分别为Kh和Km。Em为MOX片段的扩增效率；Eh为HPV18L1片段的扩增效率。
则有Χ = Xoh(l+Eh)cth.........· ·⑴Mnm = M0m(l+Em)cth...........(2)达到阈值时Rt= Kh · Xnh = Km · Xnm............ (3)由于扩增时两种片段都采用SYBR Green I作为荧光指示剂，故Kh = Km则有XQh(l+Eh)cth= M0ffl(1+Effl)cth............ (4)每个细胞含有的HPV18L1基因拷贝数的计算公式为N = X0h/M0m = (I +Em)ctm/ (I +Eh)cth、
当不考虑MOX基因和HBsAg基因扩增效率不一致即E111 = Eh = E时，HPV18L1基因拷贝数的计算公式为N = X0h/M0m = (1+E)似其中 Λ Ct = Ctffl-Cth两对引物均使用在线软件Primer3 (http://cbr-cnrc. gc. ca/cgi-bin/Primer3)设计，由大连宝生物工程有限公司代理合成。引物序列HPV18L1 primer forward(SpI) :5 ‘-CCTCCATCTTCTACCACGCT-， 3HPV18L1 primer reverse (Asl) :5 ‘-GGAATGTCCTGCTTGTTGC-，3MOX primer forward(Sp2) :5 ‘-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-， 3MOX primer reverse (As2) :5 ‘-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-，3其中，所扩增HPV18L1片段长度为97bp，扩增的MOX片段长度为145bp模板DNA制备同上述DNA抽提方法，其稀释如下标准品稀释，取某一样品抽提得到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释4次，此稀释要求精确。样品稀释，取其他样品用抽提得到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释2次，此稀释不要求精确。实时定量PCR反应体系总体积20yL，其中正反向引物(IOmM)各O. 5 μ L，EX Premix Taq (含 4mM Mg2+、0. 4mM dNTP、0. 5MExTaq) 10 μ L, SYBR 0· 5 μ L 模板 5 μ L。实时定量PCR检测使用澳大利亚Corbett Research公司的荧光定量PCR仪(型号Rotor-Gene3000)。实时定量PCR反应热循环参数预变性94°C 5min，变性94°C 15secs，退火及延伸60°C 50secs, 35个循环。熔解检验反应特异性从60°C缓慢升温到94°C，每5秒升温一次，每次升温O. 5°C,每升高一次进行信号米集。利用Rotor-Gene 5. O. 28 (CorbettResearch)软件分析样品拷贝数。实施例5 :细胞培养诱导表达操作将冻存菌种从_70°C冰箱取出迅速溶解，用O. 2mL吸管将菌悬液吹打/搅拌均匀后，接40 μ L菌悬液到装有IOmL MD培养基的三角瓶中，每个样品接2只以上的三角瓶。接种后摇床培养24小时左右，培养温度31±2°C，摇床转速160rpm。用吸管接培养得到的菌悬液O. ImL到装有IOmL MD培养基的三角瓶中培养24小时左右，培养温度31 ±2°C，摇床转速160rpm。将得到的菌悬液转入灭过菌的IOmL离心管，在台式离心机上3000rpm离心10分钟，弃上清液。加无菌水IOmL左右,充分混勻后,在台式离心机上3000rpm离心10分钟,弃上清液。用IOmL无碳源培养基将洗涤后的菌体震荡混匀，转入三角瓶中。在以上培养得到的细胞悬液中加O. 5% (50 μ L)的甲醇，将三角瓶置培养摇床上，开启摇床并调整温度至31±2°C，调整转速至160rpm，震荡培养。次日起每天上午、下午各加甲醇一次，两次甲醇流加之间尽量间隔时间长一些。诱导培养24小时后，补加ImL无碳源培养基，加O. 5% (55 μ L)的甲醇，将三角瓶置培养摇床上，开启摇床并调整温度至31 ±2°C，调整转速至160rpm，震荡培养。诱导培养共72小时后取样检测，菌悬液稀释30倍，用分光光度计测OD6tltl值，计算诱导培养后菌悬液的OD6tltl值，取相当lmL200D细胞进行表达水平的检测。实施例6 :汉逊酵母重组疫苗工程菌三时相中试发酵工艺将菌株构建中筛选的高拷贝高表达菌株制备为原代种子、主代种子、工作种子三级种子库，放在-70°C冰柜中冻存，工作种子用于发酵工艺开发及疫苗发酵生产。培养基的配制种子培养基2g/100ml葡萄糖、I. 34g/100ml YNB ;一级种子培养基200mL，二级种子培养基1600mL，高压灭菌。从_70°C冰柜中取一支(lmL、0D6(IQ ^ 100)接 入200mL 一级种子培养基，31°C培养24小时转接1600mL 二级种子培养基扩大培养，31°C培养22小时细胞0D600达到10以上，作为发酵种子。2.发酵过程补料培养基NH4H2PO4 87g溶于540mL水中，高压灭菌；另取260g甘油，高压灭菌。去阻遏培养基共计3L，NH4H2PO4 27g、MgSO4 · 7H20 6g、KCl 6. 8g、NaCl 0. 7g，以上原料溶于660mL水中，高压灭菌；另取I. 8L甘油，高压灭菌。诱导培养基甘油400mL，高压灭菌，灭菌后加O. 6L甲醇。发酵培养基发酵起始体积12L ；NH4H2PO4 175g、MgSO4 · 7H20 40g、KCl 44g、NaCl
4.4g、甘油520g,另加4mL消泡剂，罐内110_115°C高压灭菌30分钟。发酵工艺用日本丸菱理化装置研究所生产的30L发酵罐(型号MSJ_J2)进行发酵工艺，对发酵罐中发酵培养基进行在线灭菌，华东理工大学生物工程学院的FC-280型溶解氧监控仪进行溶氧的监测和控制。将ISOOmL二级种子接入装有12L发酵培养基灭菌的发酵罐中开始发酵，发酵工艺主要包含三个时相，即生长时相、去阻遏时相和诱导表达时相。生长时相发酵罐pH值控制设定在5. 4-5. 5 ;发酵温度控制30°C;罐压O. 5Kg/cm2。发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60%左右时(发酵约16小时)，连接好补料管路，用蠕动泵匀速打入约SOOmL补料培养基。当发酵罐溶氧水平降至40%以下时，将空气流量调至15L/min，搅拌转速调至700rpm。生长时相后期(发酵约22小时左右)，若细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20%以下；细胞OD6tltl达到80以上。去阻遏时相溶氧回升前将蠕动泵电源插头与溶解氧监控仪信号输出电源连接；监控仪溶氧控制40，死区为2，高端打开；蠕动泵电源开关关闭。当观察到发酵罐溶氧由最低点回升到60%以上时，进入去阻遏时相；此时打开蠕动泵电源开关，设定泵速22rpm，开始流加去阻遏培养基。去阻遏后期，若细胞生长良好，OD6tltl可达到300以上。诱导时相去阻遏时相持续24小时左右，进入诱导时相，开始补加诱导培养基，通过甲醇电极控制甲醇浓度O. 3% (V/V)，整个发酵时间大约96小时。该发酵工艺使得通过实施例1-5获得的工程菌株获得高效表达。发酵细胞悬液10L,加3mL的Tween80,搅拌均勻2小时，用Sigma 6K-15离心机8000rpm离心25min,弃上清液，细胞加洗液[200mMPH6. 2磷酸盐缓冲液，O. 5M NaCl，4mMEDTA,0. 03% Tween80]搅拌重悬，_72°C冻存备用。实施例7:LI蛋白纯化样品预处理-72°C冻存细胞4°C融解，加200mM PMSF至终浓度4mM，悬液混匀后，用高压均质机在1300BAR条件下将细胞破碎两遍。用Sigma 6K-15离心机8000rpm离心25min,取上清液，用赛多利斯Sartocon 2Plus切向流系统IOKDa膜超滤，浓缩3倍，用8倍缓冲液A[25mMpH7. 2磷酸盐缓冲液，O. IM NaCl，4mM EDTA，0. 03% Tween80]充分置换，去除小分子杂质。强阳离子交换层析应用QXL强阴离子-交换层析树脂填充层析柱(26mmIDX IOOmm),该柱在使用前用0.5M NaOH清洁消毒。在室温下用缓冲液A平衡层析柱。室温超滤样品，以15毫升/分钟的速度泵上柱，用8个柱体积HPV室温bufferA以15毫升/分钟流洗，100% bufferA到100% bufferB[25mMpH7. 2 磷酸盐缓冲液，2M NaCl, 4mM EDTA,0. 03% Tween80]的线性梯度洗脱层析柱，总的线性梯度是10个柱体积，收集具有吸收峰的流分。梯度洗脱后，用5个柱体积室温bufferB以15毫升/分钟冲洗柱，10个柱体积IN的NaOH冲洗柱，用bufferA以15毫升/分钟冲洗柱，平衡。羟基磷灰石柱层析以平衡液[50mM M0PS,pH7. 2,0. 7M氯化钠]用IOKDa膜超滤充分置换QXL强阴离
子交换层析洗脱有效流分，用于羟基磷灰石柱层析上样样品。40g羟基磷灰石用200mM，pH7. O磷酸盐缓冲液充分溶涨后装填(16mmIDX 360mm)层析柱。流速3mL/min (约90cm/h线速度)，6个柱体积的平衡液。样品为平衡液超滤浓缩、恒滤,取50mL用平衡液3倍稀释，流速3mL/min上样。4个柱体积的平衡液，2个柱体积的洗脱液I [50mM M0PS，ρΗ7· 2，O. 7Μ氯化钠，5mM磷酸钠]，流速3mL/min流洗。用8个柱体积100%洗脱液I到100%洗脱液II[50mM MOPS, ρΗ7· 2,0. 7Μ氯化钠，200mM磷酸钠]梯度洗脱，收集洗脱峰。用I. 5个柱体积100%洗脱液III[50mM M0PS，pH7. 2,0. 7M氯化钠，500mM磷酸钠]洗脱，收集洗脱峰。用Bradford法(Iowry法)、SDS-PAGE电泳、west-blot分析各洗脱峰含量纯度。实施例8 目标蛋白west-blot检测I.实施例5获得的细胞使用Novagen的酵母专用蛋白抽提试剂(YeastBuster)提取工程菌摇瓶诱导表达或实施例6发酵表达细胞总蛋白，离心去掉细胞碎片，上清液用2Xloading Buffer [IOOmM Tris-Cl,pH6. 8,20% (w/v)甘油，2% (w/v) SDS,0. 2M DTT，少许溴酚蓝]I I混合后沸水浴10分钟。2.经SDS-PAGE电泳，应用《分子克隆》第二版蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，将电泳条带转到PVDF膜上,通过预染蛋白Marker指示转膜效果。3.使用 BSA 包被，HPV16L1 (CAMVIR-I) :sc_47699 单克隆抗体作为一抗，Goatanti Mouse IgG-AP作为二抗，检测目标蛋白特异性，用BCIP/NBT显色试剂盒显色。转化子west-blot方法筛选结果见附图7。其中，1、4为蛋白Marker,从上至下依次为170、130、100、70、55、40、35、25KDa。2道为HPV18全长LI表达转化子，3道为HPV18截短LI表达转
化子。、
实施例9:电镜检查每个样品(粗始澄清液、纯化的样品或经过重组装的VLPs样品)取一滴置于200目碳覆盖的铜网上。一滴2%的PH7. O的磷钨酸(PTA)置于铜丝上20-60秒。铜网气干后进行透射电镜检查，所有的显微镜以IOOkv的递增电压用JEOL 100CE透视电子显微镜(JEOLUSA LAC)完成。产生的显微图片最终放大为100，000X。其中实施例7中HPV18L1超滤样品电镜检查结果如附图8。实施例10 :动物免疫试验小鼠的免疫测定HPV18L1 VLP疫苗的ED50 :使用60只6 8周龄的SPF级NIH或Balb/c小鼠，分为6组，每组10只小鼠。每只小鼠各免疫ImL HPV18 VLP疫苗稀释液，浓度分别为原倍、I 5倍稀释液、I 20倍稀释液、I 80倍稀释液、I 160倍稀释液、I 320倍稀释液。采用腹腔注射，免疫后六周处死采血，血清分离不少于O. 5mL，存放 于_20°C备用。HPV18抗原免疫小鼠ELISA方法检测ED50 (Reed-Muench法)计算的疫苗ED50 值为 O. 088 μ go大白兔的免疫用含完全弗式佐剂的HPV18 VLP颗粒抗原，免疫2只大耳白兔。免疫剂量为160 μ g,免疫后4周和10周各加强一次。免疫后每二周采血一次,将采集的血液置37°C中2h，再移入4°C过夜，4000g离心lOmin，吸取上清，获得的多抗血清存放于_20°C备用。第10周处死采血,血清分离不少于50mL,存放于-20°C备用。抗血清ELISA检测用纯化得到的HPV18VLP颗粒抗原包被96孔酶标板过夜；用1% BSA封闭各孔没有结合HPV18VLP颗粒抗原的位点；加小鼠或大耳白兔的抗血清，与孔中HPV18VLP颗粒抗原结合；加结合有辣根过氧化物酶的小鼠或大耳白兔酶标二抗；加入辣根过氧化物酶的显色底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；2N H2SOj*止显色后用酶标仪在405nm处检测各反应孔的吸光度值。HPV18抗原免疫兔ELISA方法检测抗体滴度结果，最终取抗血清时，大白兔的抗血清的滴度大于I : 10240。序列表<110>天津超然生物技术有限公司〈120〉一种HPV18L1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用〈130〉<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1〈211>1524<212>DNA<213>HPV18L1病毒编码基因<400>1atggctttgt ggcggcctag tgacaatacc gtatatcttc cacctccttc tgtggcaaga 60gttgtaaata ccgatgatta tgtgactcgc acaagcatat tttatcatgc tggcagctct 120agattattaa ctgttggtaa tccatatttt agggttcctg caggtggtgg caataagcag 180gatattccta aggtttctgc ataccaatat agagtattta gggtgcagtt acctgaccca 240aataaatttg gtttacctga tactagtatt tataatcctg aaacacaacg tttagtgtgg 300
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权利要求
1.一种HPV18L1多核苷酸序列，其特征在于其多核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.一种多肽，其特征在于它包含权利要求I所述的多核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽包含HPV18晚期基因产物的全部或一部分。
4.上述权利要求中任一项所述的多核苷酸序列，以高表达的汉逊酵母基因的偏爱密码子使用系数为参照，首选兼并密码子中汉逊酵母使用系数最大的密码子，主要使用兼并密码子中汉逊酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子。
5.上述权利要求1-3任一项的多核苷酸序列为保持了汉逊酵母密码子偏爱使用方式的片段或类似物。
6.—种表达载体,它包含上述权利要求1-3任一项的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与载体调控序列可操作连接，所述调控序列能使宿主细胞表达该多核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，该细胞包含权利要求I所述的多核苷酸序列或权利要求6所述的表达载体。
8.依照权利要求7所述的宿主细胞，该宿主细胞具有表达载体能够补偿用于转化子筛选的URA3营养缺陷。
9.权利要求1-4任一项所述的多核苷酸序列对应产物在治疗或预防HPV感染制剂方面的应用。
10.权利要求1-8任一项在治疗或预防皮疣，非典型鳞状细胞，宫颈发育异常，颈上皮内瘤形成或宫颈癌药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种HPV18L1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用，包括重组人乳头瘤病毒L1衣壳蛋白的氨基酸序列，编码该氨基酸序列的合成核苷酸序列，和包含该核苷酸序列的重组表达载体和汉逊酵母表达宿主菌株。本发明还涉及由该氨基酸序列及其衍生物所组成的HPV18L1蛋白在制备疫苗中的应用。本发明通过对HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重组HPV18L1衣壳蛋白在汉逊酵母系统中高效表达，使得利用汉逊酵母表达系统工业生产HPV18L1衣壳蛋白成为现实，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产率更高、成本低等优点。
文档编号C12N15/37GK102719453SQ20121001323
公开日2012年10月10日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者孙长海, 宋立娜, 张涛, 李建, 杨珺, 汪和睦, 汪志良, 王昌华, 王玉香, 王艳侠, 齐怀丰 申请人:天津超然生物技术有限公司