专利名称：一种猪瘟病毒s31基因的原核表达蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种猪瘟病毒S31基因的原核表达蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
猪痕(Classical Swine Fever)是猪的一种高度接触性的致死性传染病。其病原体猪痕病毒(Classical Swine Fever Virus)是黄病毒科痕病毒属中的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。S31蛋白是对病毒非结构蛋白进行加工的丝氨酸蛋白酶，在病毒蛋白加工成熟中具有重要作用。而现今对病毒S31蛋白的作用、抗原性等都没有进行深入研究。 在现有的所建立的检测猪瘟抗体的间接ELISA中，用于检测的抗原多为结构蛋白，如EO、 E2蛋白，而S31蛋白作为抗原的检测方法还未有涉及。大肠杆菌表达系统是目前比较成熟的表达系统，具有操作简单，安全无毒，外源蛋白表达量高等优点，已经成功用于多种蛋白的生产。发明内容
技术问题本发明的目的是针对目前尚未有有关CSFV S31蛋白相关的基因工程制品的现状，提供一种准确可靠的CSFV S31蛋白的基因工程制品的制备方法，具体的说是一种鉴定猪瘟病毒抗体的S31基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。
技术方案本发明的目的通过如下技术方案实现一种重组大肠杆菌表达的猪瘟病毒S31蛋白，该蛋白系将S31基因片段克隆入原核表达载体pET32a得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)获得重组大肠杆菌BL21 (DE3)，将该重组大肠杆菌BL21 (DE3)培养至0D600达0. 6-0. 8时加入终浓度为0. 5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体蛋白经Ni亲和层析柱纯化获得。
所述S31氨基酸序列为SEQ ID NO. 1，即猪瘟病毒多聚蛋白的第1591-1816位氨基酸残基。
PAVCKKVTEHEKCTTSMMDKLTAFFGVMPRGTTPRAPVRFPTSLLKIRRGLETGWAYTHQGGISSVDHV TCGKDLLVCDTMGRTRVVCQSNNKMTDESEYGVKTDSGCPEGARCYVFNPEAVDISGTKGAMVHLQKTGGEFTCVTA SGTPAFFDLKNLKGWSGLPIFEASSGRVVGRVKVGKNEDSKPTKLMSGIQTVSKSTTDLTEMVKKITTMSRGEFRQI TLA其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2，即猪瘟病毒碱基序列的第5145-5822位碱基。
CCTGCCGTTTGCAAGAAGGTCACTGAACATGAGAAATGTACCACATCCATGATGGACAAATTGACTGCT TTTTTCGGTGTTATGCCGAGGGGCACCACACCTAGAGCCCCTGTGAGATTCCCTACCTCTCTCTTAAAGATAAGAAG GGGTTTGGAAACTGGCTGGGCGTACACACACCAAGGTGGCATCAGTTCAGTGGACCATGTCACTTGTGGAAAAGACT TACTGGTATGTGACACTATGGGCCGGACAAGGGTTGTTTGCCAGTCAAATAATAAGATGACAGATGAGTCCGAGTATGGAGTTAAAACTGATTCCGGATGCCCGGAAGGAGCTAGGTGTTATGTGTTCAACCCAGAGGCAGTTGACATATCAGG GACTAAAGGAGCCATGGTCCACTTACAAAAAACTGGAGGAGAATTCACCTGTGTGACAGCATCAGGAACTCCGGCTT TCTTTGATCTTAAAAACCTTAAAGGCTGGTCAGGGCTACCGATATTTGAGGCATCAAGTGGAAGGGTAGTCGGCAGG GTCAAGGTCGGTAAGAATGAGGACTCTAAACCAACCAAGCTTATGAGTGGAATACAAACAGTTTCCAAAAGTACCAC AGACTTGACAGAAATGGTAAAGAAAATAACGACCATGAGCAGGGGAGAATTCAGACAAATAACCCTTGCT 所述的原核表达载体为pET32a。
本发明所述的重组大肠杆菌表达的猪瘟病毒S31蛋白的制备方法，包括如下步骤(1)根据CSFVS31 基因序列设计引物F: CACC GGATCC CCT GCC GTT TGC AAG AAG GT (SEQ ID N0.3)、R: CTCGAG CTA TGCA AGG GTT ATT TGT CTG AAT TC (SEQ ID NO. 4)，从 CSFV HCLV毒株提取RNA，经RT-PCR扩增得到编码目的基因片段(SEQ ID NO. 2)，通过I和Xho I两个酶切位点，把所述的基因片段克隆入原核表达载体pET32a中，然后通过酶切和测序鉴定，获得阳性重组质粒；(2)将步骤(I)所述的经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21-A S31 ；(3)培养所述的重组表达菌株BL21-A S31，加入IPTG进行诱导表达，经过猪瘟阳性血清抗体鉴定，该重组蛋白在重组表达菌株包涵体内，经纯化获得所述的重组蛋白。
有益效果目前CSFV重组表达蛋白中并无有关猪瘟病毒S31重组蛋白的报道，关于用S31作为病毒检测抗原的检测方法也尚未见报道。本发明构建了表达猪瘟病毒S31蛋白的重组大肠杆菌，Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性，能够作为建立ELISA方法的抗原，这将为系统研究检测猪瘟特异性抗体、ELISA检测方法的建立奠定基础。
图I CSFV S31基因PCR扩增结果，I: PCR 产物，CSFV S31 基因片段;M: DL2000 marker。
图2 PET-32a-S31重组质粒的双酶切鉴定1-3:分别为B論I /Xho I双酶切重组质粒PET-32a-S31 ;PET_32a空质粒对照；M: DL2000 markero
图3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，M:蛋白Marker ;1-3分别为空载体诱导产物，诱导重组大肠杆菌的上清，诱导重组大肠杆菌的包涵体。
图4重组蛋白的Western blot鉴定(猪痕阳性血清为一抗)M:蛋白Marker ;1-3分别为空载体诱导产物，诱导重组大肠杆菌的上清，诱导重组大肠杆菌的包涵体。
具体实施方式
实施例I S31基因片段的PCR扩增与原核表达质粒的构建41.1引物设计根据CSFV HCLV株基因序列(AF091507. I)设计引物，上下游引物各引入BamH I和 Xho I位点，扩增S31基因中的基因片段，并命名为S31基因(SEQ ID NO. 2)。引物序列如下F: CACC GGATCC CCT GCC GTT TGC AAG AAG GT (SEQ ID NO. 3)R: CTCGAG CTA TGCA AGG GTT ATT TGT CTG AAT TC (SEQ ID NO. 4)以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。
I. 2 PCR扩增目的片段采用Trizol抽提法提取CSFV HCLV毒株(购自南京天邦生物技术有限公司)RNA作为模板。加入ImL Trizol (美国Invitrigen),按照公司产品说明书进行RNA的提取,提取总 RNA 溶于 RNase free 水中。应用 easyscript one-step RT-PCR SuperMix (北京全式金生物技术有限公司)进行RT-PCR反应。采用50 ii L反应体系，其中RNA 3 u L, easyscript one-step Enzyme Mix I U L,上、下游引物各 I U L, 2 X one-step Reaction buffer 25 U L, 补 RNase-free Water 至总体积为 50 u L。反应程序如下45°C 50min ；94 °C 5min ；94°C 30s, 52°C 25s，72°C 30s，此反应为35个循环；72°C 5min, 10 °C保存。PCR产物于1%琼脂糖电泳检测(检测结果见图I)。检测后切下目的条带，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收目的片段，连接到PMD18-T载体，涂板后挑取单克隆分别用PCR方法和双酶切法鉴定，鉴定为阳性的单克隆菌落进一步进行测序(思普金生物科技有限公司)鉴定。
1.3重组质粒的构建和鉴定将测序正确的阳性的单克隆菌落大量培养，用质粒小提试剂盒(Axygen)提取已经连入目的片段的PMD18-T质粒，将提取的质粒用及I /Xho I双酶切，回收纯化之后克隆入同样酶切处理的表达载体质粒pET-32a (Novegen)中，连接反应在16°C进行，之后将连接产物转化万.co7i DH5a (NEB)感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37°C培养。挑取平板上的菌落，在含氨苄青霉素的LB培养基培养，碱裂解法提取质粒，经PCR和及I /Xho I 双酶切鉴定(结果见图2)，酶切片段大小为687bp，与预期目的基因大小一致，阳性质粒获得目的条带。阳性质粒送思普金生物科技有限公司进行测序。将测序正确的重组质粒分别命名为 PET-32a-S31。
实施例2重组表达菌株BL21- A S31的构建2.I转化感受态大肠杆菌BL-21实施例I中经序列测定正确的重组质粒PET-32a-S31转化大肠杆菌BL-21 (Transgen)， 得到重组表达菌株BL21-S31，同时将空质粒pET-32a同法转化感受态大肠杆菌BL-21。
2.2重组蛋白表达条件的优化挑取重组表达菌株BL21-S31和含空质粒pET-32a的大肠杆菌BL-21散在单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C过夜振摇培养。
(I)取过夜培养的菌液IOii L接种于3 ml含有氨苄青霉素(50iig/ml)的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养3h左右，使OD6tltl达到0. 6 0. 8，取100 y L样品于无菌 Eppendorf管中作为诱导前对照；(2)向上述菌液中加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并在加入IPTG后第4h取样；
(3)4°C8000 rpm离心5min收集诱导表达的细菌，PBS CpH 7. 2)重悬，反复洗涤2次；
(4)完全弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀；
(5)将菌液反复冻融3次；
(6)超声波裂解细菌功率选用200W，在冰盒上操作，超声裂解^，停顿^，直至菌液变得清澈；
(7)4°C8000 rpm离心lOmin，分别收集离心后的上清与包涵体将离心下来的包涵体用与上清等体积的含8M尿素的PBS重悬，取上清100 μ L、包涵体悬浮液100 μ L备用。2. 3SDS-PAGE 电泳分析
样品中加入5Χ蛋白样品上样缓冲液(250mM Tris-HCl, ρΗ6· 8 ； 10%SDS ；0. 5%溴酚蓝； 50%甘油；5% 2-巯基乙醇)，充分混勻后100°C煮沸5min，上样前瞬时离心，吸取上清进行 SDS-PAGE，结果见图3。
实施例3 融合蛋白的大量诱导表达，纯化及抗原性鉴定 3.1融合蛋白的大量诱导表达及纯化
按实施例2摸索的诱导表达条件诱导表达基因工程重组菌BL21-S31 (实施例2，2. 1得至lj)100ml，离心收集菌体，按每IOOml菌液加入5ml PBS重悬菌体沉淀，超声裂解后离心，分离上清和包涵体，包涵体用等体积PBS重悬，包涵体经包涵体洗液洗涤，步骤如下
(1)8000rpm 离心 15min，包涵体洗液 I (50mM Tris-HCl ；IOOmM NaCl ；IOmM EDTA ； 1% Triton X-100)重悬沉淀，4°C l_2h ；
(2)8000rpm离心 15min，包涵体洗液 II (50mM Tris-HCl ； IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ；0. 5% Triton X-100)重悬沉淀，4°C l_2h ；
(3)以上步骤重复1-2次；
(4)8000rpm离心15min，8M尿素重悬沉淀，4°C 12_Mh，使蛋白充分溶解；
(5)8000rpm离心15min，吸取上清至新的Eppendorf管中，分光光度计测定蛋白浓度， 4°C或-20°C保存备用。(6)将蛋白浓度调整到0.3mg/ml左右，装入透析袋中，在透析液中逐步添加PBS， 使尿素浓度降低为6M，5M，4M，3. 5M，3M，2. 5Μ，2Μ，1· 5Μ，1Μ，使蛋白复性。每个梯度置4°C维持6-他，在搅拌条件下进行。(7) 8000rpm离心15-20min，吸取上清，0. 45 μ m滤膜过滤，用分光光度计 (Eppendorf公司)重新测定蛋白浓度，根据测得的OD26tlnm和OD28tlnm，按照公式浓度(mg/mL) =OD280X 1. 45-OD260 XO. 74，分装 4°C或 _20°C保存。根据分光光度计测得的OD26tlnm和OD28tlnm,依据浓度计算公式，计算出纯化得到的 S31蛋白浓度为1.58 mg/mL。3. 2重组蛋白的Wfestern blot鉴定
(1)SDS-PAGE；
(2)转印电泳结束后，取下凝胶按下列顺序安装转印装置(半干转印法)即 +极白板一海绵一 NC膜一凝胶一海绵一黑板一极，转印条件是20V，45min ；
(3)转印结束后取下NC膜，将其投入5%丽春红染色液中染色30s，用铅笔标出Marker条带和目的蛋白条带的大概位置，并观察转印情况；
(4)用去离子水漂洗NC膜，直至洗去丽春红染色液；
(5)将NC膜用含10%脱脂乳的PBST封闭液封闭过夜(室温轻摇)；
(6)将猪瘟阳性血清(购自武汉科前动物生物制品有限公司)用封闭液1:100稀释后， 加入到NC膜上，室温轻摇2h;
(7)用PBST洗涤5次，5min/次；
(8)加12000稀释的兔抗猪IgG-HRP，室温轻摇1. 5h ；
(9)用PBST洗涤5次，5min/次；
(10)用DAB显色试剂盒显色。经DAB显色试剂盒显色后，试验结果见图4，与对照样品相比，纯化的S31重组蛋白包涵体在44. 4kD处出现明显条带。由于本试验是用猪瘟阳性血清鉴定蛋白的抗原性，说明表达的重组S31蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性结合，从而与兔抗猪IgG-HRP反应，最后显色。由于该蛋白能与猪瘟阳性血清结合，也说明表达的S31重组蛋白可以作为猪瘟检测的抗原，具有良好的抗原性，并可以作为建立ELISA方法的抗原，这将为系统研究检测猪瘟特异性抗体、ELISA检测方法的建立奠定基础。
权利要求
1.一种重组大肠杆菌表达的猪瘟病毒S31蛋白，该蛋白系将S31基因片段克隆入原核表达载体pET32a得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21 (DE3)，将该重组大肠杆菌BL21 (DE3)培养至0D600达0. 6-0. 8时加入终浓度为0. 5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体蛋白经Ni亲和层析柱纯化获得，所述S31蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO. 1，即猪瘟病毒多聚蛋白的第1591-1816位氨基酸残基，其编码 S31蛋白的S31基因核苷酸序列为SEQ ID NO. 2，即猪瘟病毒碱基序列的第5145-5822位碱基。
2.权利要求I所述重组大肠杆菌表达的猪瘟病毒S31蛋白的制备方法，包括如下步骤(1)根据CSFVS31基因序列设计引物F: CACC GGATCC CCT GCC GTT TGC AAG AAG GT R: CTCGAG CTA TGCA AGG GTT ATT TGT CTG AAT TC从CSFV HCLV毒株中提取RNA，经RT-PCR扩增得到编码目的基因片段SEQ ID NO. 2，通过及I和Xho I两个酶切位点，把所述的基因片段克隆入原核表达载体pET32a中，然后通过酶切和测序鉴定，获得阳性重组质粒；(2)将步骤(I)所述的经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21-A S31 ；(3)培养所述的重组表达菌株BL21-A S31，加入IPTG进行诱导表达，经过猪瘟阳性血清鉴定，该重组蛋白在重组表达菌株包涵体内，经纯化获得所述的重组蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种猪瘟病毒S31基因的原核表达蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。根据猪瘟病毒(CSFV)S31基因序列，设计两对引物，构建了重组表达载体pET32a-S31，测序验证后转化原核表达受体菌E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达，重组融合蛋白分子量约44.4KD。经镍柱亲和层析纯化的蛋白能与CSFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应。试验表明，表达的蛋白具有检测灵敏度高，特异性强，应用该抗原进行检测时绝无散毒危险，可作为鉴定猪瘟病毒抗体的ELISA方法的检测抗原。
文档编号C12R1/19GK102532282SQ201210013180
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者李文良, 毛立, 江杰元 申请人:江苏省农业科学院