一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体的制作方法

专利名称：一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体的制作方法
一种新型mi RNA和编码蛋白基因共表达载体本发明属于生物技术发明领域。本发明具体涉及一种miRNA和编码蛋白基因的共表达载体pAAV2mir，该表达载体主要由AAV2的ITR、启动子、mmvm内含子(modified minute virus of mice intron)、以供编码蛋白基因插入的多克隆位点MCS和BGH poly(A)等元件组成，其中mmvm内含子中包含多克隆位点，用于pri_miRNA的插入。使用时将单个或多个pri-miRNA序列插入mmvm内含子的多克隆位点之间，同时插入相应编码蛋白基因，实现 miRNA和编码蛋白基因的共表达。并且该载体携带AAV2的ITR序列，可进一步包装成AAV 病毒，依赖于AAV病毒的不同血清型的组织特异性嗜性，实现miRNA和编码蛋白基因的相对组织特异性表达。本载体可用于miRNA和编码蛋白基因的共表达以及miRNA功能、miRNA与蛋白质之间的相互作用等研究。背景miRNA (microRNA)是生物体内源的长度为18 25个核苷酸的非编码RNA (Bartel DP. MiRNAs genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell,2004,116(2) 281-297.)。目前，在人类中已发现 700 多种 miRNA (Griffiths-Jones S. , The mi croRNA Registry, Nucleic Acids Res，2004，32 :D109_D111.)。在体内，miRNA 与 AGO 等蛋白形成 RISC(RNA Induced Silencing Complex)，识别并结合 mRNA 3，UTR 的靶序列，导致mRNA的降解和翻译抑制，在转录后水平上对基因的表达进行负调控(Doench JG, Sharp PA. Specificity of microRNA targetselection in translation repression. Genes Dev，2004，18 (5) :504_511.)。研究发现，miRNA参与人类大约三分之一基因的表达i周控(Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands ofhuman genes are mi croRNA targets. Cell, 2005，120(1) : 15-20.)，在细胞分裂(Careton Μ, Cleary MA, Linsley PS. MicroRNAs and cell cycle regulation. CellCycle, 2007,6 (17) :2127_2132.)、分化(Iovino N, Pane A, Gaul U. miR-184 hasmultiple roles in Drosophila female germline development. Dev Cell,2009，17(1) 123-133.)、死亡(Ambros V. MicroRNA pathways in flies and worms growth, death, fat, stress, and timing[Erratum Cell,2003,114(2) 269]. Cell,2003,113(6) :673-676.)> _ t (Jovanovic M, Henqartner M0. miRNAs and apoptosis =RNAs todie for. Oncogene,2007,25(46) :6176_6187.)、新陈代谢(Dang CV, Le A, Gao P. MYC—induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities. ClinCancer Res, 2009,15(21) :6479_6483.)以及干细胞的分化(Xu N, Papagiannakopoulos Τ, Pan GJ, et al. MicroRNA-145 regulates 0CT4, S0X2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells. Cell,2009,137 (4) 647-658.)、月中瘤的发生(Schichel R, Boyerinas B, Park SM, et al. MicroRNAs :key players in the immune system, differentiation, tumorigenesis andcell death. Oncogene, 2008, 27 (45) :5959_5974.)等诸多生理病理过程中发挥重要作用。已有的研究表明，miRNA主要通过miRNA表达量的变化和活性改变参与调节生理病理过程。多数癌症存在miRNA表达异常。如与正常细胞相比较，癌细胞中miR-34a普遍低表达。研究发现miR-34a启动子区存在p53结合位点，由于癌细胞中p53表达偏低或功能异常，导致miR-34a表达下调。而miR-34a可抑制细胞周期相关蛋白的表达，使细胞停滞于 Gl 期(Lin He, Xingyue He, Lee P. Lim, et al. AmicroRNA component of the p53 tumour suppressor network, nature. 2007Jun. 447，1130-1135.)。它还诱导细胞凋亡，并降低SIRTl的表达，阻止p53去乙酰化，诱导p21、PUMA等抑癌基因表达，抑制癌症的发生 (MunekazuYamskuchi, Marcella Ferlito, Charles J. Lowenstein. miR-34a repression of SIRTlregulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 2008. Sep. 105 (36) 13421-13426)。这表明miRNA的表达受到细胞内某些蛋白因子的调节。而且，在某些癌症中还发现miRNA表达基因的缺失或扩增，如慢性淋巴细胞白血病中由于13ql4座位的缺失，miRNA15/miRNA16-l 普遍低表达(Calin GA, Dumitru CD, Shimizu Μ, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 andmiR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukaemia. Proc Natl Acad Sci USA2002 ；99 15524-15529.) 反由于13q31.3座位的扩增，导致位于该座位的miR17_92 cluster在多种淋巴瘤和实体瘤中高表达(Ota A, Tagawa H, Karnan S, etal. Identification and characterization of a novel gene, C13orf25,as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res 2004 ；64 :3087_3095· ；Hayashita Y, Osada H, Tatematsu Y, et al. A poIycistronicmicroRNA cluster, miR-17—92, is overexpressed in human lung cancers andenhances cell proliferation. Cancer Res 2005 ;65 :9628_9632.)。同时，越来越多的研究表明，许多细胞中成熟miRNA的数量与细胞内该种miRNA的前体(pre-miRNA) 不成比例(Lee EJ, Baek M, Gusev Y, et al. Systematic evaluationof microRNA processing patterns in tissues, cell lines, and tumors. RNA,2008,14 :35-42.),提示miRNA加工成熟过程中某些因子的缺失或突变可能影响成熟mirRNA的数量。如miRNA 成熟加工过程中必需的Drosha酶和Dicer酶的功能丧失会影响细胞内所有miRNA的加工成熟(Du T, Zamore PD. microPrimer :the biogenesisand function of microRNA. Development 2005,132 4645-4652. He L,Hannon GJ. MicroRNAs small RNAs with a big rolein gene regulation. Nat Rev Genet2004，5 :522_531.)，导致 miRNA 表达的减少。但是，虽然细胞内某种miRNA的pri-miRNA并未发生变化，但随着外界环境和细胞生理状态的改变，该种miRNA的数量也会发生相应的变化(Rooij EV, Sutherland LB, Liu N, et al. A signaturepattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy andheart failure. Proc Natl Acad Sci USA,2006，03(48) : 18255—18260.)， 表明细胞内每种miRNA可能都存在自己所特有的表达调控方式。许多表观遗传学因素如 CpG岛的甲基化和组蛋白的修饰抑制等也会影响miRNA的表达。Saito Y等研究发现CpG岛甲基化、组蛋白修饰等相关的表观遗传学药物会影响膀胱癌细胞中miR127的表达(Saito Y,Liang G,Egger G,et al. Specific activation of microRNA-127 withdownregulation of the proto-oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs inhuman cancer cells. Cancer Cell 2006;9:435-443.)。总之，miRNA的表达异常主要与基因突变、表观遗传学和 miRNA加工过程不正常相关。因此，利用已知的miRNA表达机制，外源表达miRNA可能会有效补偿体内或细胞内某些miRNA的不足，在某些疾病的治疗过程中发挥作用。Janaiah Kota 等研究发现在小鼠肝癌模型中表达miR26a可有效地抑制肝癌的发生(Kota J，ChivukulaRR, 0' Donnell KA, et al. Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine livercancer model. Cell 2009;137:1005-1017.)。同时，miRNA 的外源表达载体还应用于miRNA的功能研究。这些都表明建立一种miRNA的外源表达载体具有重要的研究意义和应用前景。现有的研究表明，miRNA的表达方式存在两种一种是在RNA Pol II的催化作用下，转录形成pri-miRNA，经Drosha酶加工后得到pre-miRNA，在Exportin5蛋白的协助下转运进入细胞质，再经过Dicer酶加工后获得成熟的miRNA分子；另一种是miRNA位于 hnRNA剪接形成成熟mRNA分子时去除的内含子中，剪切下来的内含子直接形成pri-miRNA， 进入 miRNA 的成熟加工过程(Lin SL, Miller JD, YingSY. Intronic microRNA (miRNA). J Biomed Biotechnol,2006(4) :1_13.)。因此，常见的miRNA表达载体的构建方式也有两种直接表达和内含子表达。在直接表达miRNA时，通常选用RNA Pol II或RNA Pol III 相关的启动子。RNA Pol III相关启动子的表达强度高，但组织特异性差，不易表达调控。 相反，RNA Pol II相关启动子的表达强度相对较弱，但组织特异性较好，易于表达调控。因此，人们常根据不同需要选择不同类型的表达启动子。同时，由于只需将pre-miRNA序列之外的两端大于40bp的侧翼序列克隆入表达载体即可实现miRNA的正常表达(Chen CZ, Li L, Lodish HF, et al. microRNAs modulate hematopoetic lineage differentiation. Science, 2004，83 (303) =83-86.)，因此载体构建过程简单、方便。但表达miRNA的检测则相对麻烦，且不能持续检测其表达情况。我们利用内含子表达miRNA时，将miRNA表达相关序列插入某一基因内含子中，直接通过检测该基因的表达情况来监测miRNA的表达情况，而且可实现功能相关的miRNA和编码蛋白基因的共同表达。因此，建立一种miRNA和编码蛋白基因共表达的载体对miRNA 的功能研究以及miRNA和蛋白编码基因的相互作用研究具有重要意义。目前已报道了几种利用内含子实现miRNA和编码蛋白基因的共表达的方法。如在美国专利 microRNA vectors (NO. US 2006/0063174 Al)中，Turner DL 等改造 miRNA155 的表达相关序列BIC并将该序列置于特定的启动子调控下，把不同来源的pre-miRNA序列插入该序列，实现了 miRNA和编码蛋白基因的共表达。在另一份美国专利Novel transgenic methods using (NO. US 2006/0228800 Al)中，Lin SL等利用人工设计合成的内含子，将不同来源的pre-miRNA序列插入该内含子中，也实现了 miRNA和编码蛋白基因的共表达，并用该表达载体过表达某种miRNA，结果导致了小鼠肿瘤的发生。p53是一种抑癌基因，P53蛋白为其所编码表达。文献报道miR34a与P53存在相互作用关系，首先P53可作为转录因子，与miR34a启动子结合，起始miR34a的表达(He L,He X,Lim L P,et al. A microRNA component of the p53 tumorsuppressor network. Nature, 2007,447(7148) :1130_1134.)；其次，miR34a 能够调节 P53 活性，在体内 miR34a抑制 SIRTl mRNA的翻译，降低SIRTl的表达，阻止p53去乙酰化使p53保持活性状态(Yamskuchi M， Ferlito M, Lowenstein CJ. miR-34a repression of SIRTl regulates apoptosis. Proc Natl Acad Scl USA, 2008,105(36) : 13421-13426.)。在本案中，为了研究 miRNA 与编码蛋白的相互作用关系，本案利用了 miR34a能够调节P53活性的机理，构建了 miR34a与P53共表达的质粒 pAAV2mir34a-CMV-p53。发明概述
本发明的技术特征是构建了一种能够有效实现miRNA和编码蛋白基因共表达的载体pAAV2mir，利用该载体不仅可以实现功能相关联的miRNA与编码蛋白基因的协同表达，还可实现我们感兴趣的、特定的miRNA与编码蛋白基因的组合表达。本发明的第二个技术特征是利用内含子实现miRNA的表达选择仅有67nt的mvm内含子，在其分子位点BrP前插入多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。本发明的第三个技术特征是，pAAV2mir 是以本实验室原来构建的重组AAV病毒包装相关质粒pAAV2ne0 (结构见图1)为基本骨架， 这样，pAAV2mir同样也含有AAV2病毒的ITR序列，因此，由pAAV2mir所构建的重组子也可以用于包装成含有“miRNA与编码蛋白基因共表达”的“表达单元”的重组AAV病毒。之后，则可以利用AAV病毒的组织特异性实现表达载体的相对靶向性导入。本发明可应用于 miRNA的功能、miRNA与蛋白相互作用研究，也可应用于某些疾病的治疗。发明详述在已有的知识和进展的基础上，本发明构建了一种能够有效实现miRNA与编码蛋白基因共表达的载体pAAV2mir。该表达载体主要由AAV2的ITR、启动子、mmvm内含子、 MCS和BGH poly(A)等元件组成，其中mmvm内含子中包含多克隆位点，用于单个或多个 pri-miRNA的插入，同时利用MCS位点插入相应编码蛋白基因，实现miRNA与编码蛋白基因的共表达。AAV2 ITR序列为一对2型腺相关病毒的反向末端重复序列，这一对AAV2的 ITRs可以使该载体实现进一步包装成AAV病毒，且可以用于包装各种血清型的AAV，这样就可以利用依赖于AAV病毒的不同血清型的组织特异性嗜性，实现miRNA的相对组织特异性表达。根据不同的需求可以选择不同的Pol II相关启动子，例如，需要在体外高效表达miRNA时，则可选用CMV启动子(cytomegalovirus promoter)；如需在特定的组织(如肝脏)高效持续表达时，则可选用肝脏特异的CAG启动子(a combination of chicken beta-actinpromoter and cytomegalovirus immediate-early enhancer)。mmvm 内〒以来源于小鼠细小病毒的长度为67nt的mvm内含子(minute virus of mice intron)为前体，对mvm内含子结构进行分析后，在其分支点域(Branch-point domain)前插入多克隆位 (MCS) ,I^llmmvm 内*〒。BGH poly (A) (bovine growth hormonepolyA signal)
长激素加尾信号序列。在BGH poly(A)和mmvm内含子之间设计了多克隆酶切位点，以供编码蛋白基因的插入。我们以本实验室原有的pAAV2ne0 (结构见图1)和pAAV2ne0-CAG (结构见图2)为基础，构建了两种 pAAV2mir 质粒pAAV2mir_CMV 和 pAAV2mir_CAG。pAAV2mir-CMV的构建过程详见实施例2，具体结构如图6所示，其特征是由AAV2 的ITR、CMV、mmvm、MCS等部分组成，mmvm中含有多克隆位点，便于外源表达miRNA序列的插入，MCS位点则方便于编码蛋白基因的插入，CMV启动子可实现miRNA与编码蛋白基因的高效共表达。pAAV2mir-CAG的构建过程详见实施例3，具体结构如图7所示，其特征是，与 pAAV2mir-CMV相比，pAAV2mir_CAG主要采用了不同的启动子CAG，并因此具有了肝脏表达的特异性，可在肝脏特异地持续表达。其它的基因元件如AAV2的ITR、mmvm、MCS等均与 pAAV2mir-CMV 相同。在此基础上，本案通过插入不同的pri-miRNA序列和编码蛋白基因验证了该表达载体的有效性。
本案首先构建了pAAV2mir-CMV-RFP (见实施例 2)、pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP (见实施例4)；然后将这些质粒分别转染HEK293细胞，24h观察转染细胞RFP表达情况，并与转染了等量的pAAV2ne0-RFP的细胞比较，发现RFP表达未见差异(见实施例7)，其中的mmvm内含子能够正常剪接，且加入外源表达的miRNA序列后也未影响mmvm内含子的剪接方式和过程。同时，本案也利用miRNA活性检测载体检测 了 pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 所表达的 miR142_3p 和 miR155 的活性(见实施例8)，结果表明:pAAV2mirl42-CMV-RFP能够有效地表达miR142_3p， pAAV2mirl42/155-CMV-RFP也能够有效地表达miR142_3p和miR155。这个结果表明， pAAV2mir载体可以有效地实现miRNA和编码蛋白基因的共表达，为miRNA功能研究、miRNA 与蛋白相互作用研究等提供了新的方法和选择。


图1 pAAV2ne0质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl 和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA 是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；_pR是氨苄青霉素抗性基因。图2 pAAV2ne0-CAG质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由鸡β -actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因。图3内含子结构示意图。见实施例1。图中5' splice site为5'端内含子剪接识别位点，通常为GT ；BrP为Branch-point domain的缩写，即分支位点域；PPT为poly pyrimidine tract的缩写，即多聚嘧啶序列；3' splice site为3'端内含子剪接识别位点，通常为AG。图4 mmvm内含子的结构示意图。见实施例1。图中5' splice site为5'端内含子剪接识别位点，通常为GT ；MCS为multiple cloning site的缩写，即多克隆位点，用于外源表达miRNA相关序列的插入；BrP为Branch-point domain的缩写，即分支位点域；PPT 为poly pyrimidine tract的缩写，即多聚嘧啶序列；3' splice site为3'端内含子剪接识别位点，通常为AG。图5 pAAV2mir结构示意图。图中ITR为inverted terminal r印eat的缩写，即 AAV2病毒基因组的反向末端序列；启动子通常为CMV或CAG启动子；mmvm内含子含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入；MCS用于编码蛋白基因的插入，编码蛋白基因为一些常用报告基因如(EGFP、Glue、RFP、Fluc)和功能基因的编码区序列；BGH polyA为牛生长激素加尾信号序列。图 6 pAAV2mir-CMV 质粒图谱。图中 ITR 为 inverted terminal r印eat 的缩写， 即AAV2病毒基因组的反向末端序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA 是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因； mmvm内含子含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入；MCS用于编码蛋白基因的插入，编码蛋白基因为一些常用报告基因如(EGFP、Glue, RFP、Fluc)和功能基因的编码区序列；BGH polyA为牛生长激素加尾信号序列。
图 7 pAAV2mir-CAG 质粒图谱。图中 ITR 为 inverted terminal repeat 的缩写，即 AAV2病毒基因组的反向末端序列；CAG promoter是由鸡β-actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo 是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；mmvm内含子含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入；MCS用于编码蛋白基因的插入，编码蛋白基因为一些常用报告基因如(EGFP、Glue、RFP、Fluc)和功能基因的编码区序列；BGH polyA为牛生长激素加尾信号序列。图8 pAAV2mir-CMV-RFP质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子； BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。图9 pAAV2mir-CAG-RFP质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由鸡β -actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。图10 pAAV2mir-CMV-Gluc质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc为Gaussia萤光素酶基因；mmvm为改造后的mvm内含子，含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。图11 pAAV2mir-CAG-Gluc质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由鸡β -actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc为Gaussia萤光素酶基因；mmvm为改造后的mvm内含子，含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。图12 pAAV2mirl42-CMV-RFP质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，并在其中的多克隆位点插入了 pri-miR142序列。图13 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，并在其中的多克隆位点插入了 pri-miR142和pri_miR155序列。图14 pAAV2mirl42-CAG-RFP质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由鸡β -actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGHpolyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，并在其中的多克隆位点插入了 pri_miR142序列。图 15 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 质粒图谱。pAAV2mirl42_CAG-RFP 质粒图谱。 图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由鸡β-actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；RFP为红色荧光蛋白基因；mmvm为改造后的mvm内含子，并在其中的多克隆位点插入了 pri-miR142和pri_miR155序列。图16 pAAV2mir34a-CMV-P53质粒图谱。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；Dl和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；P53为一种抑癌基因；mmvm为改造后的mvm内含子，并在其中的多克隆位点插入了 pri-miR34a序列。图17 mmvm内含子剪接功能验证。见实施例7。不同质粒转染HEK293细胞 24h后，荧光倒置显微镜观察RFP表达情况。每种质粒均拍摄同一视野的荧光和可见光的照片，均为10 X倍放大。Al和A2为HEK293转染了 pAAV2ne0-RFP的镜下所观察到的，其中1为荧光所见，2为可见光所见，以下B H的1、2均为同样的顺序和含义，且均为10 X倍放大；Bl和B2为HEK293转染了 pAAV2mir_CMV-RFP的镜下所观察到的； C1C2为HEK293转染了 pAAV2mirl42_CMV-RFP的镜下所观察到的；D1D2为HEK293转染了 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 的镜下所观察到的；E1E2 为 HEK293 转染了 pAAV2neo_CAG-RFP 的镜下所观察到的；F1F2为HEK293转染了 pAAV2mir_CAG-RFP的镜下所观察到的；G1G2 为HEK293转染了 pAAV2mirl42-CAG-RFP的镜下所观察到的；H1H2为HEK293转染了 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP的镜下所观察到的。图18miRNA表达功能验证。见实施例8。图A表示等量的pAAV2neo_Gluc、 pAAV2neo-Gluc 142T 和 pAAV2neo_Gluc 155T 分别转染 HEK293 细胞 48h 后，检测的 Gluc 活性。 图 B 表示等量的 pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2neo_Glucl42T+pAAV2mirl 42-CMV-RFP分别共转染HEK293细胞48h后，检测的Gluc活性。图C表示等量的pAAV2ne0 -Gluc+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP, pAAV2neo-Glucl42T+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 和 pAA V2neo-Glucl55T+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 分别共转染 HEK293 细胞 48h 后，检测的 Gluc 活性。图 D 表示等量的 pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42-CAG-RFP 和 pAAV2neo_Glucl42T+pAA V2mirl42-CAG-RFP分别共转染HEK293细胞48h后，检测的Gluc活性。图E表示等量的pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP,pAAV2neo-Glucl42T+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 禾口pAAV2neo-Glucl55T+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 分别共转染 HEK293 细胞 48h 后， 检测的Gluc活性。以下实施例对本发明的miRNA和蛋白编码基因共表达载体pAAV2mir作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例 1 mmvm 内含子(modified mvm intron)的设计
/ΛΜΙ4 psc-TTRmvm-hFIX-BGHpA (ffu ZJ, Sun JJ, Zhang TP, et al. Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directed expressionresults in sustained correction of hemophilia B at low vector dose. Mol Ther,2008,16 (2) 280-290.)获取mvm内含子序列，依据内含子的序列特征分析该序列，分别确定mvm内含子的BrP和PPT的位置，具体结果如下5' - gt aagttggcgccgtttaagggatggttggttggt QQQQtactaat gtttaattacc tttttt ac ag -3'有下划线标记且字体倾斜处为BrP位点(序列为tactaat)，仅下划线标记之处为PPT位点(序列为■)。由于外源表达miRNA序列通常位于5'剪接识别位点(即 5'端的两个开始碱基gt)和BrP位点之间，因此在两位点之间插入多克隆位点(在实施例2和实施例3中，pAAV2mir-CMV与pAAV2mir_CAG中，所插入的多克隆位点序列不同)， 以供外源miRNA序列的插入，具体位置为序列中倾斜字体和未倾斜字体交界处(序列为 tTfifggSO，从而获得mmvm内含子。符号▼为插入的具体位置。实施例2 pAAV2mir-CMV、pAAV2mir_CMV-RFP 和 pAAV2mir-CMV_Gluc 质粒构建利用重叠延伸PCR法获得mmvm内含子，并在其两端引入酶切位点Kpn I和EcoR I，用于将mmvm内含子克隆入pAAV2ne0载体。mmvm内含子中包含多克隆位点，在本实施例中多克隆位点分别为Not I,Xba I和Mlu I，用于插入外源表达的miRNA序列。具体实验过程如下首先，设计并合成以下序列序列1 5 ‘ -ggt gaattc cggcggctagtctgtaaaaaaggtaattaaacattagtacccca cptaatcciacpcQtptaatcpcQacccictp -3 ‘序列 2 5 ‘ -ccg qQtaCC gtaagttggcgccgtttaagggatggttggttgg tctaga agtt capcppcccicpattacacgcptcpattacp -3 ‘在序列1和序列2中，序列的5'端有下划线标记之处为酶切位点，其中，序列 1中的gaattc为醢切位点EcoR I的序列，序列2中的qqtacc为醢切位点Kpn I的序列；斜体部分为序列1和序列2的互补序列，用于PCR时序列1和序列2的配对，其中，在序列1中的互补序列为cataatcaacacptataatcacgcicccicta^m列2中的互补序列为 caacaaccacaattacacacatcaattaca-.mm 2中有下划线标记、且字体加粗之处为mmvm中的多克隆位点，其序列为tctaga agtt ca.qc_q_qccqc.qaffacac.qcqf，It构成的名克隆位点依次是Not I、Xba I 和 Mlu I。然后，以序列1和序列2为模板及引物进行重叠延伸PCR反应，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，使用Kpn I和EcoR I双酶切后，插入到pAAV2ne0的Kpn I和 EcoR I两位点之间，获得pAAV2mir-CMV，结构如图6所示。质粒pAAV2mir-CMV可作为一种通用载体，用于miRNA和编码蛋白基因的共表达，mmvm内含子中多克隆位点方便于外源表达miRNA序列的插入，同时mmvm内含子和BGH PolyA之间的多克隆位点则可用于编码蛋白基因的插入。在本实施例中，为了验证mmvm 内含子能否正常剪接，我们选择了 RFP(红色荧光蛋白)^P Gluc (Gaussia luciferase)作为示例的编码蛋白基因，将这两种报告基因分别插入到pAAV2mir-CMV载体，分别获得 pAAV2mir-CMV-RFP 和 pAAV2mir_CMV-Gluc。具体过程如下设计并合成以下引物RFP-f 5' -tgt gaattc accatgagcgagctg-3‘RFP-r 5' -ccc agatct ttactacttgtgccc-3'以RFP-f、RFP-r为引物，质粒pH794(由第二军医大学钱其军教授惠赠，其中RFP 序列根据Genbank中EU383029序列合成)为模板，PCR扩增RFP片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Bgl II和EcoR I双酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的 Bgl II 和 EcoR I 两位点之间，获得 pAAV2mir-CMV-RFP。按照相同的原理构建pAAV2mir-CMV_Gluc。具体过程如下设计并合成以下引物Gluc-f 5' -tgt gaattc agccaccatgggagt-3‘Gluc-r 5' -tcc dg^tct cgcttagtcaccacc-3 ‘以 Gluc-f、Gluc-r 为引物，质粒 pGluc-Basic 为模板(NEB，Cat. No. N8082S)，PCR 扩增Gluc片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Bgl II和EcoR I双酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的Bgl II和EcoR I两位点之间，获得pAAV2mir-CMV_Gluc。实施例3 pAAV2mir-CAG、pAAV2mir_CAG-RFP 和 pAAV2mir-CAG_Gluc 质粒构建利用重叠延伸PCR法获得mmvm内含子，并在其两端引入酶切位点Kpn I和EcoR I，用于将mmvm内含子克隆入pAAV2ne0载体。mmvm内含子中包含多克隆位点，在本实施例中多克隆位点分别为Spe I.Sac I和Mlu I，用于插入外源表达的miRNA序列。具体实验过程如下首先，设计并合成以下序列序列 3 5 ‘ -gt CiaattG cggcggctagtctgtaaaaaaggtaattaaacattagtaccccacg
taatcpacpcptpptaacactacitaaactt -3 ‘序列 4 5 ‘ -age qgtaco gtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtctag QaQctcaaptccactaqtattacca cgcgtcgatta -3 ‘在序列3和序列4中，序列的5'端有下划线标记之处为酶切位点，其中，序列 3中的为酶切位点EcoR I的序列，序列4中的qqtacc为酶切位点Kmi I的序列；斜体部分为序列3和序列4的互补序列，用于PCR时序列3和序列4的配对，其中， 在序列3中的互补序列为taatcaacpcptpptaacactacitppactt,^f序列4中的互补序列为 aaatccactaptpttaccacgcptcgatta；序歹11 4中的下划线标记且字体加粗之处为mmvm中的多克隆位点，其序列为 QaQctcaagtccactaptpttaccacaccitMim^mfr 占依汝县:sPe I、Sac I 和 Mlu I。然后，以序列3和序列4为模板及引物进行重叠PCR反应，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Kpn I和EcoR I双酶切后，插入到质粒pAAV2ne0-CAG的 Kpn I和EcoR I两位点之间，获得pAAV2mir_CAG，结构如图7所示。
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相比于pAAV2mir-CMV，pAAV2mir_CAG携带了不同的启动子CAG，该启动子可使目的基因在肝脏中持续稳定高效地表达；因此，利用该载体有利于实现某种miRNA在肝脏中的高效持续表达；同时，pAAV2mir-CAG中mmvm内含子携带的多克隆位点也与pAAV2mir_CMV 不同，其多克隆位点分别为Spe I.Sac I和MluI，用于外源表达miRNA序列的插入。为了验证mmvm内含子能否正常剪接，本实施例选择了报告基因RFP (红色荧光蛋白)和Gluc (Gaussia luciferase)作为示例的编码蛋白基因，将这两种编码蛋白基因分别插入 pAAV2mir-CAG 载体，分别获得了质粒 pAAV2mir_CAG-RFP 和 pAAV2mir-CAG_Gluc。其具体过程如下设计并合成以下引物RFP-f 5' -tgt gaattc accatgagcgagctg-3‘RFP-r 5' -ccc agatct ttactacttgtgccc-3'以RFP-f、RFP-r为引物，质粒pH794(由第二军医大学钱其军教授惠赠，其中RFP 序列根据Genbank中EU383029序列合成)为模板，PCR扩增RFP片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Bgl II和EcoR I双酶切后，插入到pAAV2mir-CAG的 Bgl II 和 EcoR I 两位点之间，获得 pAAV2mir-CAG-RFP。按照相同的原理构建pAAV2mir-CAG_Gluc。具体过程如下设计并合成以下引物Gluc-f 5' -tgt gaaiic agccaccatgggagt-3‘Gluc-r 5' -tcc agfaici cgcttagtcaccacc-3 ‘以 Gluc-f、Gluc-r 为引物，质粒 pGluc-Basic (NEB，Cat. No. N8082S)为模板，PCR 扩增Gluc片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Bgl II和EcoR I双酶切后，插入到pAAV2mir-CAG的Bgl II和EcoR I两位点之间，获得pAAV2mir-CAG_Gluc。实施例4 pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 质粒构建为验证pAAV2mir-CMV表达载体是否能够同时高效地表达miRNA和编码蛋白基因，本实施例首先将miR142的表达序列插入pAAV2mir-CMV-RFP中mmvm内含子的多克隆位点之间，获得pAAV2mirl42-CMV-RFP。在此基础上，实施例再将miR155的表达序列插入 pAAV2mirl42-CMV-RFP 中 mmvm 内含子的多克隆位点之间，获得 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP， 用于验证pAAV2mir-CMV表达载体能否实现将两种或两种以上miRNA与编码蛋白基因共表达。具体的构建过程如下设计并合成以下引物142-f 5' -Cgg tctaga cttggagcaggagtc-3‘142-r 5' _aat gcggccgc atgccgaggaagatg-3‘以142-f、142-r为引物，HEK293细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增包含pri-miR142的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Not I 和Xba I双酶切后，插入到pAAV2mir-CMV-RFP的Not I和Xba I两位点之间，获得 pAAV2mirl42-CMV-RFP。在此基础上，设计并合成以下引物155-f 5' -gtg gcggccgc ctgtggtttaaattc-3‘155-r 5' -att Bcgcgt tctttgtcatcctccc-3‘
以155-f、155-r为引物，HEK293细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增包含 pri-miR155的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Not I和 Mlu I双酶切后，插入到pAAVanirl42-CMV-RFP的Not I和Mlu I两位点之间，获得 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP。实施例5 pAAV2mirl42-CAG-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP 质粒构建为验证pAAV2mir-CAG表达载体是否能够同时高效地表达miRNA和编码蛋白基因， 本实施例首先将miR142的表达序列插入pAAV2mir-CAG-RFP中mmvm内含子的多克隆位点之间，获得pAAVaiiirl42-CAG-RFP。在此基础上，本实施例再将miR155的表达序列插入到 pAAV2mirl42-CAG-RFP 中 mmvm 内含子的多克隆位点之间，获得 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP， 用于验证pAAV2mir-CAG表达载体能否实现两种或两种以上miRNA与编码蛋白基因共表达。 具体的构建过程如下设计并合成以下引物142-f ‘ 5' -Cgg gagctc cttggagcaggagtc-3‘142-r' 5' - cgcactagta tgccgaggaagatg-3‘以142-f ‘、142-r ‘为引物，HEK293细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增包含pri-miR142的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Mc I 和Spe I双酶切后，插入到pAAV2mir-CAG-RFP的Mc I和Spe I两位点之间，获得 pAAV2mirl42-CAG-RFP。在此基础上，设计并合成以下引物155-f ‘ 5' -gtg aciagff ctgtggtttaaattc-3'155-r‘ 5' -att acgcgt tctttgtcatcctccc-3'以155-f ‘、155-r'为引物，HEK293细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增包含pri-miR155的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Spe I 和Mlu I双酶切后，插入到pAAV2mirl42-CAG-RFP的Spe I和Mlu I两位点之间，获得 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP。实施例6 pAAV2mir;34a-CMV-p53 质粒构建为了研究miRNA与编码蛋白的相互作用关系，本实施例利用了 miR3^能够调节 P53活性的机理，构建了 miR3^与P53共表达的质粒pAAVanir34a-CMV-p53。具体构建过程如下设计并合成以下引物34a-f 5' -tat gcggccgc ttcttatcaacaggt-3‘34a-r 5' -aag acgcgt tggcgcagaagagct-3 ‘以3^-f、3^-r为引物，HEK293细胞全基因组DNA为模板，PCR扩增包含 pri-miR3^的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Not I和Mlu I 双酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的Not I和Mlu I两位点之间，获得pAAV2mir34a_CMV。在此基础上，设计并合成以下引物p53-f 5' -agt gaattc cgtacgtacgacggt-3‘p53-r 5' -cgc agatct atgtcagtctgagtc-3‘以p53-f、p53-r为引物，Ad-p53(本实验室保存)为模板，PCR扩增p53片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收获得的目的片段经Bgl II和EcoR I双酶切后，插入 pAAV2mir34a-CMV 的 Bgl II 和 EcoR I 两位点之间，获得 pAAV2mir34a_CMV-p53。实施例7 mmvm内含子剪接功能验证HEK293细胞接种于96孔细胞培养板(10000个细胞/孔，10% DMEM)。转染前4h 换新鲜的10% DMEM培养基(100 μ L/孔)，转染过程参见LipofectamineTM2000说明书。 每孔具体转染过程为0. 1 μ g DNA加入25 μ L OPTI-MEM培养液，0. 25 μ L Iipofectamine 2000加入25 μ L OPTI-MEM培养液，分别混勻，于室温放置5min。然后将两种液体混勻， 于室温放置20min后，加入细胞中，并前后摇晃96孔细胞培养板使液体混勻，于37°C的 5% CO2孵箱中培养。24h用倒置荧光显微镜观察细胞中RFP表达情况，具体见图17。图中，Al和A2为HEK293转染了 pAAV2neo_RFP的镜下所观察到的，为IOX倍放大，其中 1为荧光所见，2为同一个视野里的可见光所见，以下B H的1、2均为同样的顺序和含义，且均为IOX倍放大；Bl和B2为HEK293转染了 pAAV2mir_CMV-RFP的镜下所观察到的；Cl和C2为HEK293转染了 pAAV2mirl42-CMV-RFP的镜下所观察到的；Dl和D2为 HEK293转染了 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP的镜下所观察到的；El和E2为HEK293转染了 pAAV2neo-CAG-RFP 的镜下所观察到的；Fl 和 F2 为 HEK293 转染了 pAAV2mir_CAG-RFP 的镜下所观察到的；Gl和G2为HEK293转染了 pAAVanirl42-CAG-RFP的镜下所观察到的；Hl和 H2为HEK293转染了 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP的镜下所观察到的。从图17的结果可知，相比转染pAAV2ne0-RFP的HEK293细胞，分别转染等量的 pAAV2mir-CMV-RFP,pAAV2mir 142-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 的 HEK293 细胞的 RFP表达效率并未见差异，表明载体中插入mmvm内含子未影响RFP的表达，mmvm内含子在表达过程中能够正常剪接，且在mmvm内含子中插入单个和两个miRNA的表达序列也未影响 mmvm内含子的正常剪接。同时，CAG启动子相关的质粒转染HEK293细胞也呈现出相似的规律。但相比CMV启动子，CAG启动子的表达强度较弱。实施例8 miRNA表达功能验证为了验证miRNA表达载体功能，本案使用本实验室已有的miRNA活性检测质粒系统(田文洪，董小岩，王刚，吴小兵。一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化监测活细胞中miRNA活性的新方法。生物工程学报，2010，26 (6) =807-814)来测定miRNA 表达载体表达miRNA的活性情况。在本实施例中，所应用的miRNA活性检测质粒为 pAAV2neo-Gluc、pAAV2neo_Glucl42T 和 pAAV2neo_Glucl55T。其中，质粒 pAAV2neo_Gluc 不携带miRNA靶序列，用于显示不受miRNA调控时转染细胞的Gluc表达活性水平；质粒 pAAV2neo-Glucl42T在Gluc的3' UTR区携带了单个的miR142_3p靶序列，Gluc表达受细胞内miR142-3p调控，相比于转染质粒pAAV2neo-Gluc的细胞Gluc表达活性水平，转染质粒pAAV2neo-Glucl42T细胞Gluc表达活性的变化，可用于指示细胞内的miR142_3p活性； 同理，质粒pAAV2neo-Glucl55T在Gluc的3' UTR区携带单个的miR155靶序列，可用于指示细胞内的miR155活性水平。HEK293细胞接种于96孔细胞培养板(10000个细胞/孔，10% DMEM)。转染前4h换新鲜的10 % DMEM培养基(100 μ L/孔)，转染过程参见Lipofectamine 2000说明书。每孔具体转染过程为0. 1 μ g miRNA表达质粒+0. 1 μ g miRNA活性检测质粒或0. 1 μ gmiRNA活性检测质粒加入 25yL OPTI-MEM 培养液，0. 50 μ Llipofectamine 2000 加入 25yL OPTI-MEM培养液，分别混勻，于室温放置5min。然后将两种液体混勻，于室温放置20min后，加入细胞中，并前后摇晃96孔细胞培养板使液体混勻，于37°C的5% CO2孵箱中培养。4 后，用 Gaussia luciferaseassay kit (NEB)检测细胞培养上清中Gluc活性。具体过程为每孔取20yL细胞培养上清液，加入50yL Gaussia luciferase assay kit中底物，混勻后， 用发光检测仪(Modulus Luminometer)测定其相对光强度单位(Relative light unit, RLU)，每次测定收集光子10s。具体结果见图18。从图18的结果可知，当miRNA活性检测质粒(pAAV2neo-Glucl42T或 pAAV2neo-Glucl55T)单独转染HEK293细胞时，细胞中Gluc表达活性与转染等量的pAAV2neo-Gluc的HEK293细胞间未见差异(图18A)。这是因为HEK293细胞中 miRNA142-3p和miRNA155表达量极低，活性弱。同时，也表明miRNA靶序列插入miRNA活性检测载体中并未影响Gluc的表达。为了检测pAAV2mirl42-CMV-RFP的miRNA142_3p 表达活性，将 pAAMneo-Gluc 或 pAAMneo_Glucl42T 与 pAAV2mirl42_CMV-RFP 共转染 HEK293细胞，转染4 后检测细胞培养上清中的Gluc活性(图18B)。可见相比共转染 pAAV2neo-Gluc的细胞，共转染pAAV2neo-Glucl42T的细胞的Gluc表达活性明显降低，这表明 pAAV2mirl42-CMV-RFP 可以有效的表达 miRNA142-3p。为了进一步验证pAAVaiiir是否具有同时表达两种miRNA的能力，将 pAAV2neo-Gluc、pAAV2neo_Glucl42T 或 pAAV2neo_Glucl55T 与 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 共转染HEK293细胞，转染4 后检测细胞培养上清中Gluc活性(图18C)。结果显示，与共转染 pAAVaieo-Gluc 的细胞相比，共转染 pAAVaieo_Glucl42T 或 pAAVaieo_Glucl55T 的细胞的Gluc表达活性有一定程度的降低，但不如共转染pAAV2ne0-Glucl42T和 pAAV2mirl42-CMV-RFP的减低的程度明显，这表明pAAV^iir虽然能同时表达两种miRNA但表达效率有所下降。在此基础上，本案进一步探索了不同启动子对miRNA表达载体的影响。通过构建 CAG启动子控制的、miR142-3p调节的RFP表达质粒pAAVanirl42-CAG-RFP，并构建由CAG启动子控制的、由miR142-3p与miR155共调节的RFP表达质粒pAAV2mirl42/155_CAG-RFP，将表达质粒和miRNA活性检测质粒共转染HEK293细胞，转染4 后检测细胞培养上清中Gluc 活性。结果显示，对于表达载体质粒pAAVanirl42-CAG-RFP，共转染pAAVaieo-Glucl42T细胞的Gluc表达活性有所下降(图18D)，但没有CMV启动子介导的pAAVanirl42-CMV-RFP表达载体导致的Gluc表达活性下降明显。分析可能是活性检测载体的CMV启动子的活性比 CAG启动子的活性要强而导致的。但此结果仍足以表明pAAVanirl42-CAG-RFP表达载体也可有效地表达miR142-3p。miRNA142-3p 和 miR155 的共表达载体pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 也呈现相似的规律(图18E)。但由于这两种miRNA共表达时表达效率的下降，导致Gluc表达活性的下降更加不明显。名词及缩写词解释1、AAV :adeno_associated virus,腺相关病毒。2> ITR :inverted terminal repeat，^iJ$^@;gS；。3、AAV2 病毒2 型 AAV 病毒(adeno-associated virus serotype 2)。4、pAAV2neo质粒是一种携带了 AAV2病毒ITR的质粒DNA。所述的AAV载体质粒一般由AAV2 ITR、启动子、目的基因或阻断序列、ployA、AAV2 ITR以及Ε. coli质粒骨架组成。质粒骨架上携带了 neo基因的表达单位。5、Dl和D2 :AAV2病毒ITR中的部分序列。6, CMV promoter 人巨细胞病毒的启动子。7、CAG promoter 由鸡β -actin启动子序列和人巨细胞病毒的早期增强子序列组成的启动子。8, BGH polyA 牛生长激素基因的加尾信号序列。9、Neo 新霉素抗性基因。10、ampR:氨苄青霉素抗性基因。ll、mmvm 内含子modified minute virus of mice intron,为改造后的 mvm 内含子。该内含子含有多克隆位点，以供外源表达miRNA序列的插入。12、MCS 多克隆位点，用于编码蛋白基因的插入。13, EGFP 为增强型绿色荧光蛋白基因，常用报告基因。14, RFP 为红色荧光蛋白基因，常用报告基因。15, Gluc 为Gaussia萤光素酶基因，为常用报告基因。16, Fluc 萤火虫萤光素酶基因，为常用报告基因。17,pAAV2mir :miRNA和编码蛋白基因的共表达载体。18、BrP 为 Branch-point domain 的缩写，即分支位点域。19、PPT 为 poly pyrimidine tract 的缩写，即多聚嘧啶序列。20、p53 :p53 基因。21、pri-miR142 :miRNA 142 序列的前体。22、miRNA :microRNA,微小 RNA。23U42T :miR142_3p 的靶序列(Target)，与 miR142_3p 序列完全互补。24U55T :miR155 的靶序列(Target)，与 miR155 序列完全互补。
权利要求
1.一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体，其技术特征在于主要由AAV2 ITR、启动子、mmvm内含子、编码蛋白基因和BGH poly (A)等元件组成；miRNA和报告基因或功能蛋白基因的共表达。
2.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，携带AAV2ITR序列，可进一步包装成 AAV病毒，依赖于AAV病毒的不同血清型的组织特异性嗜性，实现miRNA和编码蛋白基因的相对组织特异性表达。
3.如权利要求2所述的共表达载体，其特征在于，所述的AAV病毒的血清型包括AAVl、 AAV2、AAV5、AAV8、AAV9以及AAV病毒包括ssAAV病毒和scAAV病毒两种类型。
4.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，所述的启动子包括CMV启动子、CAG 启动子、PGK启动子。
5.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，所述的mmvm内含子来源于mvm内含子，在其5' splice site和分支位点(Branch-point domain)之间插入多克隆位点(MCS)， 以供单个或多个pri-miRNA序列的插入。
6.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，所述的编码蛋白基因包括如萤火虫萤光素酶基因(Flue)、Gaussia萤光素酶基因(Gluc)、红色荧光蛋白基因(RFP)、绿色荧光蛋白基因(EGFP)的报告基因；如MYC、c-MYC的原癌基因和如P53的抑癌基因。
7.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，可实现单个或多个miRNA与报告基因的共表达，也可实现单个或多个miRNA与功能蛋白基因的共表达，如miR34a与P53、miR21 和miR155与MYC，包括这些组合但不限于这些组合。
8.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，表达的miRNA、报告基因和功能蛋白基因既可以是天然的，又可以是经过人工改造过的或人工合成的。
9.如权利要求1所述的共表达载体，其特征在于，可用于miRNA的功能和miRNA与蛋白相互作用关系研究，并可用于疾病的治疗和动物模型的构建。
全文摘要
本发明具体涉及一种miRNA和编码蛋白基因的共表达载体pAAV2mir。该表达载体主要由AAV2 ITR、启动子、mmvm内含子(modified minute virus of mice intron)、编码蛋白基因和BGH poly(A)等元件组成，其中mmvm内含子中包含多克隆位点，用于pri-miRNA的插入。使用时将单个或多个pri-miRNA序列插入mmvm内含子的多克隆位点之间，同时插入相应编码蛋白基因，实现miRNA和编码蛋白基因的共表达。并且该载体携带AAV2ITR序列，可进一步包装成AAV病毒，依赖于AAV病毒的不同血清型的组织特异性嗜性，实现miRNA和编码蛋白基因的相对组织特异性表达。该载体可用于miRNA功能以及miRNA和蛋白相互作用研究。
文档编号C12N15/86GK102311973SQ20101021679
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者吴小兵, 田文洪, 董哲岳, 董小岩 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京五加和分子医学研究所有限公司