专利名称：一种甲型h1n1流感病毒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物病毒领域，涉及流感病毒株，具体涉及一种甲型Hmi病毒的新 毒株及其用途。
背景技术：
流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲 型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。流感甲型病毒的表面抗原会经常发生细小变 异，这种变异被称为“飘变” (drift)，形象地说，“飘变”就是病毒通过细小的变化伪装自己， 从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。甲型流感病毒“飘变”的结果是每年引发流感的 毒株都有可能不同，人们每年都需要重新接种流感疫苗进行预防。“转变”(shift)主要是 以前流行于人和动物的流感病毒基因片段重组的结果，导致一种新的病毒“亚型”出现。因 为人体内几乎没有抵御这种新生病毒的抗体，所以“转变”的结果往往会导致流感的全球性 大暴发。2009年4月，始发于北美的甲型Hmi流感，是北美猪重组株Hmi和欧亚猪流感 Hmi病毒重组而成，它包含了人、禽、猪三个来源的基因片段，并且通过了几次重组。2009 年6月，WHO宣称此次流感疫情为全球流感大流行。甲型流感病毒是引起人、畜、禽感染的重要人畜共患病毒病原，并可在世界范围引 起人群发生流感大流行。接种流感疫苗是避免患流感最有效的方法。由于流感病毒经常变 异，疫苗使用中的主要问题是毒种的选择，制造疫苗的毒株力求接近流行株。目前人群流感 病毒的分离主要依靠细胞培养，也有用鸡胚培养，鉴定型与亚型采用血凝抑制、免疫荧光、 RT-PCR等。2009年的12月，我国上海市区哨点医院发生的流感样患者，鉴定为新甲型Hmi 流感病毒。流感流行伴随着死亡率的增加。增加的死亡率不仅仅由流感和肺炎引起，也与 流感引起的心肺疾病和其他慢性病恶化有关。因此，丰富病毒库，完善对该病原引起感染监 测体系是对预防、抑制甲型流感病毒有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新型甲型Hmi流感病毒。为甲型Hmi流感病毒全基因 片段变异监测提供生物信息，利用该株甲型Hmi流感病毒制备动物免疫血清，为甲型Hmi 的HA蛋白变异提供生物信息。本发明另一个目的是提供上述病毒株的制备方法及疫苗研允。本发明提供了一种甲型Hmi流感病毒，该病毒含有ΗΑ、ΝΑ、NP、PBU PB2、PA、NS、 M共8个片段，8个片段的核苷酸序列分别如说明书核苷酸序列表SEQ ID NO 1_8所示。该 病毒感染MDCK细胞，可致细胞产生拉网、团聚变圆、脱落现象。本发明采用流感样患者咽拭标本进行病毒的分离培养，单克隆荧光抗体鉴定培养 物为甲型流感病毒，RT-PCR鉴定亚型，为甲型Hmi亚型流感病毒。同时提取病毒核酸，采用 HA、NA、PB1、PB2、PA、M、NP、NS的8个片段的特异引物进行8个片段全基因RT-PCR扩增，扩 增产物经凝胶回收后测序。进入GenBank对8个片段全基因进行搜寻比对，证实8个基因均与 A/California/04/2009 (HlNl)及 WHO 推荐疫苗株 A/California/07/2009 (HlNl) 99% 同源。HA蛋白327位水解位点处氨基酸序列为“IPSIQSR丨GL”，为非高致病力毒株特征。 命名为 A/shanghai/570/2009 (HlNl)，保藏号为 CCTCC NO :V201015，保藏日期2009 年 6 月 10日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉市武昌区珞珈山武汉大学。具体来说，本发明提供的甲型Hmi流感病毒A/shanghai/570/2009 (HlNl)，具有8 个片段全基因序列和下述特征1)感染MDCK细胞引起细胞拉网、团聚变圆、破碎；2)荧光标记单克隆抗体观察，显示被感染细胞有绿色荧光；3)感染细胞培养上清能凝集鸡红细胞4) HA全基因序列与最早分离株A/California/04/2009 (HlNl) 99 %同源5) NA全基因序列与最早分离株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源6)PBl 全基因序列与最早分离株 A/California/04/2009(H1N1)99% 同源7)PB2 全基因序列与最早分离株 A/California/04/2009(H1N1)99% 同源8) PA全基因序列与最早分离株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源9) M全基因序列与最早分离株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源10) NP 全基因序列与最早分离株 A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99 % 同源11) NS 全基因序列与最早分离株 A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99 % 同源本发明提供了上述病毒的制备方法，包括如下步骤(1)取流感样患者(哨点医院)咽拭标本，经抗生素处理置4°C冰箱，4_5h后接种 于MDCK细胞，过夜；(2)观察细胞病变效应，病变细胞采用甲型流感病毒单克隆荧光抗体检测，荧光显 微镜下观察鉴定甲型流感病毒；(3)提取病毒 RNA，RNA 反转录为 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 个 片段的引物进行PCR扩增，扩增产物测序。所述的抗生素可以是青霉素和链霉素。所述的细胞病变效应是指细胞产生拉网、团聚变圆、脱落现象。步骤(3)中，可以先根据c-DNA扩增产物的碱基数鉴定甲型流感病毒亚型；然后再 用8个片段的引物进行PCR扩增。本发明的病毒株可以用于制备甲型流感病毒诊断试剂。也可以用于制备甲型流感
病毒疫苗。具体而言，本发明通过下述方法和步骤进行1)样品采集哨点医院流感样患者咽拭标本，保存在含BSA和双抗的MEM缓冲液， 4h内冷链运送至实验室。2)病原体分离培养标本经抗生素处理置4°C冰箱，4h后接种于MDCK细胞，在5% C0237°C条件下培养，第二天观察细胞病变效应(CPE)，病变细胞采用甲型、乙型流感病毒单 克隆荧光抗体检测，荧光显微镜下观察鉴定甲型、乙型流感病毒。3) RT-PCR鉴定用Trizol法提取病毒RNA ；以血凝素基因片段设计引物， MMLV(takara)37°C作用 Ih 将 RNA 反转录为 c_DNA ；进行 PCR，循环条件为94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。扩增产物凝胶电泳观察产物bp数，鉴定甲型流感病毒亚型。4) 8个片段测序引物RT-PCR及序列分析用Trizol法提取病毒RNA ；用Oligo(dT) 和随机六核苷酸引物，MMLV(takara) 37°C作用Ih将RNA反转录为c_DNA ；以血凝素、神经氨 酸酶、病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)、基质蛋白、核蛋白、非结构蛋白8个基因片段设计引物，进 行 PCR，循环条件为94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。扩增产物凝胶 电泳切割回收提纯后在DNA序列自动分析仪上测序。5)8个片段基因进化分析用MEGA4软件对测序的8个片段基因进行系统发生分 析构建进化树。结果显示1)MDCK细胞为狗肾二倍体上皮细胞，细胞呈上皮样形态；细胞感染流感病毒后可 以出现细胞圆缩、拉网等的细胞病变。采用Dako Cytomation公司制备的IMAGEN 甲、乙型流感(Code no k6106)单克 隆荧光抗体，在荧光显微镜下观察鉴定为甲型流感病毒。2)病毒经Oligo (dT)和随机六核苷酸引物RT为cDNA，经HA片段特异引物PCR成 功扩增出Hl亚型43 Ibp目的条带。3)分离株病毒经Oligo (dT)和随机六核苷酸引物RT为cDNAJ5HA、NA、PB1、PB2、 PA、M、NP、NS的8个片段的特异测序引物PCR成功扩增出1641bp的HA，1376bp的NA，2255bp 的 PB1，2229bp 的 PB2,2098bp 的 PA, 1015bp 的 M, 1492bp 的 NP 和 878bp 的 NS。4)本发明方法中采用的细胞系为本领域公知的MDCK细胞。5)本发明A/shanghai/570/2009 (HlNl)毒株是上海市2009年12月分离自哨点医 院流感患者分离株，与2009年北美猪源甲型Hmi A/California/04/2009 (HlNl)及WHO推 荐疫苗株A/California/07/2009 (HlNl)基因99%同源。本发明甲型Hmi流感的基因序列 变异提供了重要的生物信息；补充了上海甲型Hmi基因数据和病毒毒种株；可用于疫苗的 研究。本发明属微生物病毒领域，具体涉及一种新型甲型Hmi流感病毒毒株及其用途。 本发明通过患者咽拭标本分离培养和DIF、RT-PCR鉴定，以及病毒的8个基因全序列测序比 对，证实所分离的病毒为甲型Hmi流感病毒毒株，命名为A/shanghai/570/2009 (HlNl)，保 藏号为CCTCCN0 :V201015。本发明毒株得到甲型Hmi的8个基因全序列，补充了我国流 感病毒的极有价值的遗传信息和具有8个基因全序列测序的流感病毒毒种保存，对该病原 引起感染监测体系的完善有重要作用。本发明A/shanghai/570/2009 (HlNl)毒株还可用于 制备甲型Hmi病毒感染的快速诊断试剂和疫苗研究。
图1是培养液替换为不含病毒是病毒接种液后36小时的正常MDCK对照细胞。图2是接种该流感病毒100 TCID50病毒后36小时的MDCK细胞。图3是荧光显微镜观察甲、乙型荧光标记单克隆抗体染色的正常对照细胞。图4为荧光显微镜观察甲、乙型荧光标记单克隆抗体染色的感染细胞。图5是308bp甲1型流感病毒RT-PCR扩增电泳照片。其中，左第1孔为A/ shanghai/570/2009 (HlNl)，(308bp)；右第 M孔道为 maker (100、200、300、400、500、600bp)。
具体实施例方式采集我国上海市区哨点医院流感样发热患者10例咽拭标本进行培养鉴定。经细 胞培养分离到能产生明显细胞病变并能稳定传代增殖的病毒7株，鉴定为甲型Hmi流感病毒。1)病原体分离培养咽拭标本处理培养参照WHO推荐的方法，标本青霉素、链霉素 处理(终浓度均为100ug/ml)大于4h，1500g 4°C离心lOmin，取上清接种于MDCK细胞，在 5%C02 37°C条件下培养，24h后在倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，病变细胞经DIF 染色，荧光显微镜观察鉴定为甲型流感病毒。2) RT-PCR鉴定细胞培养液用invitrogen公司TRIzol LS Reagent试剂抽提病 毒核酸。设计HA片段引物，MMLV逆转录酶(Promega) 37°C作用Ih将RNA反转录为C-DNA， HA的循环条件为94°C lmin，54°C lmin，72°C IminX 40, 72°C 7min。扩增产物经琼脂糖凝 胶电泳鉴定为新甲型Hmi。3)甲型Hmi流感病毒全基因测序分别采用8个基因片段的测序引物，对8个基因片段进行RT-PCR扩增。细胞培养 液用Invitrogen公司TRIzol LS Reagent试剂抽提病毒核酸，AMY逆转录酶(Promega) 逆转录，逆转录条件为 42°C lh,95°C 5min。保真 PCR(Ex Taq，TaKaRa)，PCR 条件为94°C， 45s，50°C，45s，72°C，60s，扩增30个循环，72°C延伸7min。PCR扩增产物送上海市基康生物 技术有限公司测序。12)结果显示，单克隆直接免疫荧光观察，为甲型流感病毒；RT-PCR证实为甲型 HlNl ；对本发明病毒的HA基因全序列测序并采用MEGA4. O分析软件进行同源性分析，证实 所分离株与始发于北美甲型Hmi最早分离株A/California/04/2009 (HlNl)氨基酸序列有 99%同源甲型Hmi流感病毒。而感染本发明病毒的MDCK细胞出现拉网、团缩、脱落的细胞病变。
权利要求
一种甲型H1N1流感病毒，其特征在于，该病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段，8个片段的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO 1 8所示该病毒的保藏号为CCTCC NOV201015。
2.如权利要求1所述的病毒，其特征在于，该病毒感染MDCK细胞，细胞产生拉网、团聚 变圆、脱落现象。
3.权利要求1所述的病毒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)取流感样患者咽拭标本，经抗生素处理置4°C冰箱，4-5h后接种于MDCK细胞，过夜；(2)观察细胞病变效应，病变细胞采用甲型流感病毒单克隆荧光抗体检测，荧光显微镜 下观察鉴定甲型流感病毒；(3)提取病毒RNA，RNA 反转录为 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 个片段 的弓I物进行PCR扩增，扩增产物测序。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的抗生素是青霉素和链霉素。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的细胞病变效应是指细胞产生团 聚变圆、脱落现象。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，先根据c-DNA扩增产物的 碱基数鉴定甲型流感病毒亚型；然后再用8个片段的引物进行PCR扩增。
7.权利要求1所述的病毒的应用，其特征在于，该病毒株应用于制备甲型流感病毒诊 断试剂。
8.权利要求1所述的病毒的应用，其特征在于，该病毒株应用于制备甲型流感病毒疫
全文摘要
本发明属于微生物病毒领域，提供了一种甲型H1N1流感病毒。该病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段，其核苷酸序列如说明书核苷酸序列表所示。本发明通过患者咽拭标本分离培养和DIF、RT-PCR鉴定，以及病毒的8个基因全序列测序比对，获得并证明所分离的病毒为甲型H1N1流感病毒毒株，命名为A/shanghai/570/2009(H1N1)，保藏号CCTCC NoV201015。本发明的毒株补充了我国甲型流感病毒的极有价值的遗传信息，对该病原引起感染监测体系的完善有重要作用，还可用于制备甲型H1N1病毒感染的快速诊断试剂和疫苗研究。
文档编号C12R1/93GK101974489SQ201010216388
公开日2011年2月16日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者吕锡宏, 姜庆五, 居丽雯, 蒋露芳 申请人:复旦大学