黑色素前体的制造方法

专利名称：黑色素前体的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种通过酶反应有效地从酪氨酸或其衍生物制造黑色素前体的制造 方法。
背景技术：
已知5，6_ 二羟基吲哚满等黑色素前体通过空气中的氧而转变为黑色素，利用这 一点而将其用于空气氧化型染发剂中。作为在染发剂中使用的黑色素前体的获得方法，是通过化学合成反应进行制造 的，但是，存在有副反应引起的收率下降、单离目的反应产物等引起的时间消耗、成本高、担 心因溶剂残留产生的影响等问题。此外，作为通过酶反应制造黑色素前体的技术，已知有使 用漆酶制造吲哚类或吲哚满类的方法(专利文献1)。但是，使用的漆酶需要从漆树等植物 中精制等。此外，在制造效率性、以及得到的黑色素前体不兼备染色性和稳定性方面，也是 不充分的。另一方面，在专利文献2中，公开了来自新型曲霉菌的酪氨酸酶基因MelB。专利文献1 日本专利特开2002-291496号公报专利文献2 日本专利特开2002-191366号公报

发明内容
本发明提供一种黑色素前体的制造方法，包括工序(a)，在反应液中，使用 选自曲霉(Aspergillus)属、脉胞菌(Neurospora)属、根毛霉(Rhizomucor)属、木霉 (Trichoderma)属和青霉(Penicillium)属的丝状菌的儿茶酚氧化酶或表达所述酶的细 胞，对酪氨酸或其衍生物进行氧化，将其转变为黑色素前体的工序；工序(b)，从所述反应 液中除去所述酶或所述细胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，对所述反应液进 行处理，提高5，6- 二羟基吲哚和/或5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸的浓度的工序；所述黑色素 前体包含多巴色素(D0pachr0me)、5，6-二羟基吲哚和5，6-二羟基吲哚-2-羧酸。


图1是表示在制造例1中，酪氨酸酶产生细胞引起的L-DOPA氧化反应的反应液中 的L-DOPA浓度和黑色素前体浓度推移的图。
具体实施例方式本发明涉及一种通过酶反应有效地从酪氨酸或其衍生物制造黑色素前体，并将其 作为染料使用，而使染色性和制造简便性提高的空气氧化型染发剂。
本发明的发明人发现，含有使用特定的方法通过酶或含有酶的菌体制造的黑色素 前体的空气氧化型染发剂，显示了优异的性能。所谓在本发明中使用的黑色素前体，是从酪氨酸或其衍生物制造的，并且能够用 于空气氧化型染发剂的染料，即通过空气中的氧迅速氧化聚合而形成黑色素的物质，作为 具体例子，可以列示5，6- 二羟基吲哚满、5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸等吲哚满衍生物，5， 6- 二羟基吲哚、5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物等。由于DOPA的氧化聚合速度慢， 缺乏作为染发剂用染料的实用性，所以，不包含在本发明所说的黑色素前体中。此外，作为 来自酪氨酸的氧化反应中间体，存在有多巴色素、吲哚醌等，但由于它们只在短时间稳定， 不具有长时间(例如1个月)的稳定性，所以不能用作染发剂用染料。因此，它们也不包含 在本发明所说的黑色素前体中。但是，当能够通过一般的化学处理等从这些中间体制造具 有作为上述空气氧化型染发剂的要素的稳定化合物时，这样的稳定化合物就包含在本发明 所说的黑色素前体中。此外，在本发明中的黑色素前体不一定限于单体，也可以包含满足上 述空气氧化型染料的要素的二倍体以上的低聚物。在本发明中使用的黑色素前体由以下方 法制造。-氧化工序(A)-〈原料〉作为原料(底物化合物)，使用酪氨酸或其衍生物。作为具体例子，可以列举(1) D型或L型酪氨酸、(2)D型或L型多巴(D0PA;3-(3，4-二羟基苯基)丙氨酸)、(3)多巴 胺(Dopamine ；3，4-二羟基苯基乙胺)、(4)酪氨酸的低级(C1-4)烷基酯、(5) DOPA的低级 (C1-4)烷基酯、(6)N-烷氧基(例如乙酰氧基)化或N-烷基(例如乙基)化的DOPA或酪 氨酸等，也可以是其异构体。其中，从可以得到天然型黑色素前体出发，优选L-酪氨酸和 L-D0PA,从对酶的亲和性出发，更优选L-D0PA。这些酪氨酸或其衍生物，都可以单独或组合 2种以上使用。〈显示儿茶酚氧化酶活性的酶〉所谓儿茶酚氧化酶活性，指的是催化由儿茶酚的氧化引起邻醌生成的活性。在具 有儿茶酚氧化酶活性的酶(以下简称为“儿茶酚氧化酶”)中，包含称为儿茶酚氧化酶、单 酚氧化酶、二酚氧化酶、邻二酚酶、酪氨酸酶等酶。这些酶通常具有单酚氧化酶的活性。此 外，不具有单酚氧化酶的活性，但具有多酚氧化酶活性的漆酶、过氧物酶也被包含在具有儿 茶酚氧化酶活性的酶中。其中，从因对L-DOPA的亲和性高而能够有效制造天然型黑色素前 体的方面出发，优选使用酪氨酸酶。此外，当使用酪氨酸作为底物化合物时，优选使用酪氨 酸酶。儿茶酚氧化酶可以是来自任何生物的酶，但从表达效率高，并且在宿主细胞内稳 定的方面出发，优选来自丝状菌的酪氨酸酶。此外，在进行从酪氨酸衍生物到黑色素前体 的氧化反应的工序中，为了不使原料残留，优选反应收率(相对底物的氧化生成物的比例) 高的酶。作为这样的丝状菌，可以列举曲霉(Aspergillus)属、脉胞菌(Neurospora)属、根 毛霉(Rhizomucor)属、木霉(Trichoderma)属和青霉(Penicillium)属等。其中，从对热 比较稳定，并且安全性确切的方面出发，优选曲霉属丝状菌的酪氨酸酶，具体来说，可以列 举与米曲霉(Aspergillus oryzae)的melB基因(日本专利特开2002-191366号公报)、 melD基因(日本专利特开2004-201545号公报)或melO基因(Molecular cloning andnucleotide sequence of the protyrosinase gene，melO，from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995Mar 14 ；1261 (1) 151-154)编码的酪氨酸酶实质上同一的酶。在本发明中，所谓与上述基因(melB基因、melD基因或melO基因)“实质上同一”， 指的是和其中任一种以上基因，作为氨基酸序列具有70%以上、更优选具有80%以上、最 优选具有90%以上的相同性，并且具有酪氨酸酶活性或单酚氧化酶活性。这样的酶从多巴 向多巴色素的反应收率高，能够有效降低在可以进行氧化反应的氧化工序中的最终多巴浓度。上述酶可以直接向反应液中添加使用。此外，从提高酶的稳定性、使用后的容易分 离程度、避免蛋白质混入反应系统的方面出发，也优选制成固定化酶。酶的固定化方法没有 特别限定，例如，可以列举通过固定化载体将酶分子之间进行交联的方法、使之内包在藻酸 凝胶这样的凝胶中的方法等公知的固定化方法。酶既可以是含有来自生物夹杂物的粗标 品，也可以是精制酶，但在固定化时，希望是精制的酶。〈显示儿茶酚氧化酶活性的细胞〉作为显示儿茶酚氧化酶活性的细胞，使用相当于以下(a) (d)的1种以上的细 胞。(a)使编码具有儿茶酚氧化酶活性的多肽的基因在比原本表达的启动子更高活性 的启动子的下游表达的细胞。(b)具有多拷贝的编码具有儿茶酚氧化酶活性的多肽基因的细胞。(C)通过具有编码具有儿茶酚氧化酶活性的多肽的突变基因而显示高儿茶酚氧化 酶活性的细胞。(d)通过进行酪氨酸酶活化处理而显示高儿茶酚氧化酶活性的细胞。关于(a)，例如，将儿茶酚氧化酶基因克隆入在蛋白质大量表达中通常使用的载体 中后，将该重组载体导入宿主细胞中，培养以重组入宿主染色体中的状态或者以质粒状态 含有该基因的宿主细胞，由此能够大量产生儿茶酚氧化酶。由此，在比原本表达该基因的启 动子更高活性的启动子下游表达该基因即可。关于(b)，例如，使用将儿茶酚氧化酶基因导入能够保持多拷贝儿茶酚氧化酶基因 的2倍体以上的细胞后的细胞即可。此外，例如在实用酵母中，因为也存在3倍体和4倍体 的细胞，所以这些也可以适合地使用。这样，通过使该基因的拷贝数多于原本的拷贝数，就 能够制成显示高儿茶酚氧化酶活性的细胞。关于(C)，也可以使用通过儿茶酚氧化酶基因的突变而儿茶酚氧化酶活性变高的 细胞，或将这样的突变儿茶酚氧化酶基因导入后的细胞。这样，通过制作显示比天然型酶更 高活性的突变型酶，就能够制成显示高儿茶酚氧化酶活性的细胞。关于(d)，也可以使用通过实施使2价铜离子配位的处理、和以pH2. 8 3. 2的酸 性溶液的处理等，而提高了该儿茶酚氧化酶活性的细胞。其中，优选(a)使编码具有儿茶酚氧化酶活性的多肽的基因在比原本表达的启动 子更高活性的启动子的下游表达的细胞。产生儿茶酚氧化酶的细胞种类没有特别的限定，但从容易大量培养方面出发，优 选为微生物。作为容易使用的微生物，可以列举大肠杆菌、酵母和丝状菌。其中，酵母由于安全、儿茶酚氧化酶的产生效率高，而且是单细胞，并且细胞沉降速度快，因此在反应后能够 以转速比较低的离心分离来进行分离，因此优选使用。其中，由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌体坚固，因此能够抑制来自菌体的蛋白质向反应液中流出，并且基因操作 容易，因此优选使用。此外，从有效的利用、使用后分离的容易程度的方面出发，也可以使用以载体结合 法、包埋法、交联法、光交联法等公知的方法固定化的细胞。<活化处理>为了显示酪氨酸酶等儿茶酚氧化酶活性，需要在催化活性中心配位2价铜离子。 在野生型细胞中，因为儿茶酚氧化酶的表达量少，所以，通过在该细胞内存在的2价铜离子 的配位就显示了充分的活性，但是在儿茶酚氧化酶表达量通过转化等得以提高的细胞中， 有时不能得到充分的儿茶酚氧化酶活性。因此，在使用显示儿茶酚氧化酶活性的酶、细胞的 任一种时，也优选通过预先以2价铜离子处理酶或细胞，而使2价铜离子配位在儿茶酚氧化 酶的催化活性中心。具体来说，优选通过将酶或转化体悬浮在0. 1 2mM左右的硫酸铜溶 液等中，在30 40°C左右下静置0. 5 2小时左右，使2价铜离子充分地配位在细胞内的 儿茶酚氧化酶中。此外，在儿茶酚氧化酶中，酪氨酸酶，特别是来自米曲霉的酪氨酸酶通过以 PH2. 8 3. 2左右的酸性溶液处理而成熟化、活化。因此，在使用显示儿茶酚氧化酶活性的 酶、细胞的任一种时，例如，也优选通过悬浮在20 200mM左右的醋酸钠缓冲溶液(pH = 3) 中，在0 40°C左右下静置0. 5 1小时左右，进一步提高儿茶酚氧化酶活性。此外，儿茶酚氧化酶也可以通过以胰蛋白酶等选择性地切断特定肽键的内肽酶这 样的蛋白酶处理来活化。通过蛋白酶处理，切除在酶的N末端和/或C末端侧的序列，提高 酶活性。当细胞是酵母时，使用L-DOPA作为底物时，优选使用具有0. 1U/0D_以上、更优选 具有0. 5U/0D_以上、进一步优选具有1U/0D600以上的儿茶酚氧化酶活性的细胞。当为酵 母以外的细胞时，也可以使用具有同样的儿茶酚氧化酶活性的细胞。细胞的儿茶酚氧化酶 活性的上限没有特别限定，通常为5U/0D_左右。当使用显示儿茶酚氧化酶活性的酶、细胞的任一种时，在使用Imol的L-DOPA作为 底物时，通常优选在5X 105U/mol以上，更优选在5X 106U/mol以上。每Imol L-DOPA的儿 茶酚氧化酶活性的上限没有特别的限定，通常，只要是5X107U/mol左右就是充分的，在此 以上成本就变高。此外，在本发明中，酶或细胞的儿茶酚氧化酶活性，是以在30°C下使酶或细胞与 ImL含有0. 8 μ mol DOPA的溶液反应5分钟时，使在475nm的吸光度增加1个吸光度的活性 作为1U，细胞的儿茶酚氧化酶活性，是将其除以在反应中使用的菌体密度(在600nm的吸光 度；OD6J 后的值(U/0D6QQ)。在本发明方法中，通过使儿茶酚氧化酶相对于底物为过剩存在的状态，从底物化 合物生成的黑色素前体进行进一步聚合，黑色素生成速度更快，从底物化合物生成黑色素 前体，黑色素前体在反应系统中高效地积累。< 反应 >反应开始时的原料(底物化合物)的浓度，通常为10 60mM左右，更优选为15
625mM左右。如果在上述范围内，则在能够得到充分量的黑色素前体的同时，不会产生由黑色 素生成量过度增加而引起黑色素前体收率下降和未反应底物的残留。此外，当使用D0PA、 Dopamine等作为原料时，作为染发剂的原料，在安全性上不理想。因此，优选在本氧化工序 中消耗，使得在染发剂中实质上不含有作为原料或中间体的DOPA或Dopamine。作为更优 选的形态，可以列举以L-DOPA为原料，使其浓度在反应开始时在15mM以上，反应结束时在 0. ImM以下的氧化工序。此外，在由酶催化的从DOPA开始的反应工序中的多巴色素等的氧 化生成物的收率，在使其大概为30 70%的范围是经济的，因而优选。此外，反应液的pH，只要是酶可以催化底物氧化反应的范围即可，但从抑制黑色素 的生成、在反应液中使黑色素前体高效积累的方面出发，通常优选维持在4 9左右，更优 选维持在5 7左右。通过使用缓冲液作为反应液，反应液的pH也能够维持在上述范围内， 但是由于盐浓度一旦增高，有时就会因黑色素前体聚合而促进黑色素生成，因此，优选通过 少量添加氢氧化钾、氢氧化钠等强碱或硫酸、盐酸等强酸来调整。反应液中的细胞量，从反应后的菌体分离容易、提高黑色素前体的收率的方面出 发，在实现上述儿茶酚氧化酶活性的范围内越少越好，细胞投入量优选相对于反应液在20 容量％以下，更优选在10容量％以下。反应温度，只要是酶可以催化底物氧化反应的范围即可，但从充分地进行氧化 反应、防止酶失活、抑制黑色素化的方面出发，优选维持在5 40°C，更优选维持在15 350C，进一步优选维持在20 30°C。刚开始反应后，因为在氧化反应中必须有大量的氧，所以，优选通过搅拌反应液而 大量地通气。但是，由于搅拌速度一过快，就会引起细胞的损伤等，所以，优选监视反应液中 的氧浓度，如果氧浓度不再下降，就减少通气量和搅拌速度。反应液中的氧浓度优选维持在 0. 1 Sppm左右，更优选维持在1 2ppm左右。当通过通气和搅拌而在反应液中产生大量 气泡时，也可以添加有机硅树脂那样的消泡剂。反应可以以间歇式和连续式中的任一种进行，但从可以分离未反应的底物和生成 物的方面出发，优选间歇式。采用间歇式时的反应时间，从将黑色素前体的聚合反应抑制 在最小限度的同时将底物化合物充分地转变为黑色素前体的方面出发，通常优选为10分 钟 2小时左右，更优选为30分钟 1小时左右。采用连续式时，将底物供给含有细胞的反应容器，使得底物浓度为10 60mM左 右，更为15 25mM左右，同时连续地回收反应液即可。或者，向充填了将酶或细胞固定化 的载体柱中添加1 IOmM左右、更为3 6mM左右的底物，和作为电子供给体的2倍于底 物浓度的过氧化氢即可。当使用酪氨酸或DOPA作为底物化合物时，通过上述酶反应，底物化合物被氧化， 生成多巴色素(Dopachrome)。这里，如果使用抗坏血酸、连二亚硫酸等还原剂使反应停止 和还原，作为黑色素前体，就可以得到5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸。此外，如果进一步保持 该反应液，通过多巴色素的自发脱碳酸，就生成5，6- 二羟基吲哚，或者，通过在细胞中所含 的多巴色素互变异构酶、或通过非酶的异构化，从多巴色素生成5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸。 由此，可以得到包含多巴色素、5，6_二羟基吲哚和5，6_二羟基吲哚-2-羧酸的黑色素前体。 这些黑色素前体的反应收率，优选为20 70%，更优选为40 70%。此外，例如使用多巴胺(Dopamine)作为底物化合物时，通过底物化合物的氧化生成多巴胺的醌体。这里，如果使用连二亚硫酸等还原剂使反应停止或还原，就可以得到5， 6-二羟基吲哚满。此外，如果进一步保持该反应液，就生成二羟基吲哚。而且，在黑色素前 体中，有时也含有其2 5分子左右聚合的水溶性低聚物。如果使用烷基酯作为底物化合物，则能够制作生成黑色以外的黑色素的黑色素前 体。作为具体例子，如果使用酪氨酸乙酯、DOPA乙酯等作为原料，则由生成的黑色素前体聚 合后的黑色素就成为黄色，能够用于染发剂的调色。-后处理工序(B)-作为在本发明的染发剂中使用的黑色素前体的制造方法的氧化工序(A)，是通过 以上所示的酶或菌体引起的反应。以下，记述用于在染发剂中使用的后处理工序(B)。(1)黑色素前体的回收在含有通过氧化工序(A)得到的黑色素前体的反应液中，除黑色素前体外，也包 含使用的酶或细胞，还包含因通气和搅拌引起细胞破损而产生的蛋白质或从细胞流出的蛋 白质、和黑色素前体聚合后的黑色素。因此，为了作为染发剂用的染料而利用，需要将其从 反应液中除去。酶或细胞的除去可以通过超滤、过滤、离心分离等方法进行，回收后的酶或 细胞可以返回氧化工序用容器再利用。此外，蛋白质和黑色素的除去可以通过超滤、凝胶过 滤色谱法等方法进行。在氧化工序(A)中得到的黑色素前体，是成为分子量在3000以上的高分子物(黑 色素)之前的状态，即从具有吲哚或吲哚满骨架的各种单体至低聚物的状态(分子量小于 3000)，主要包括多巴色素或5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸。在本发明中，也可以将该粗黑色 素前体作为空气氧化型染发剂的染料配合，配制组合物。此外，将在本发明的氧化工序中得到的黑色素前体进行氧化聚合，作为分子量仅 为3000以上的黑色素，也能够配合在毛发用化妆材料(免洗型或冲洗型)中。例如，可以 列举洗发水、染发液、护发素、发胶、定型剂、电烫剂、蜡、亮发剂、生发剂等。(2)黑色素前体组成的调整在本发明中，根据目的，优选在经过提高以下所示的黑色素前体溶液中的5，6_ 二 羟基吲哚和5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸中的任一种的浓度的工序(工序(I ))之后，再配 合于染发剂中。本工序既可以在上述回收工序(除去来自反应液的酶、细胞、蛋白质、黑色 素等)之前进行，也可以在之后进行，还可以二者兼用，也可以在以下所示的工序(I )的 环境下进行回收工序，在工序(I )的处理时间中包含回收工序的时间。优选经过提高 5,6- 二羟基吲哚和5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸浓度的工序，再配合于染发剂中。作为更优 选的形态，如果处于以5，6-二羟基吲哚为主要成分，与此相对含有少量的5，6-二羟基吲 哚-2-羧酸的状态，则制成染发剂后就可以染为自然色调。作为提高在工序(I )中的上述任一种化合物浓度的方法，可以列举(i)pH调整 处理、(ii)添加水溶性有机溶剂、(iii)添加无机盐、(iv)利用缓冲液进行处理、(ν)添加 抗氧化剂等。这些也可以组合2种以上使用，例如，在上述(i)pH调整处理时，组合(ii) (ν)的任一种以上，就可以更有效地完成本工序。(i)pH调整处理作为pH的调整范围，优选为pH5 11，更优选为pH5 10，进一步优选为pH6 9， 只要在该范围内，就有效地进行向吲哚衍生物的转变。与此相对，在强酸性中发生沉淀，在
8强碱性中加速氧化聚合而生成黑色素。此外，优选在厌氧条件下进行处理，但在工序(I ) 时，只要能够得到充分的收量，也不一定否定氧的存在。这里，通过将pH调整为中性 弱酸性侧或碱性侧，可以调整黑色素前体的组成， 使得所希望的化合物的比例提高。例如，从多巴色素或5，6_ 二羟基吲哚满-2-羧酸向5， 6- 二羟基吲哚的转变容易在pH5以上、8以下时发生，从5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5， 6-二羟基吲哚-2-羧酸的转变容易在pH8以上、11以下发生。即，在中性 酸性区域，生成 5,6- 二羟基吲哚，在碱性区域，有效地生成5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸。pH调整时的温度，优选为5 40°C，更优选为15 30°C，通常在室温状态进行pH 调整即可。也可以将5，6_ 二羟基吲哚满衍生物变化的时间作为指标而保持处理时间。根 据温度，也可以在30分钟以上，因为转变物(5，6-二羟基吲哚衍生物)比较稳定，所以，在 工序(I )后，如果在隔绝氧的状态下，即使放置长时间，例如放置1周以上也没有问题。(ii)添加水溶性有机溶剂作为水溶性有机溶剂，可以使用具有在水中10重量％以上相溶性(在90g水中溶 解IOg以上)的有机溶剂，例如，可以使用甲醇、乙醇、苯甲醇等醇类，聚乙二醇、甘油等多元 醇，丙酮等酮类，乳酸、柠檬酸等有机酸类，醋酸、丙酸等脂肪酸类，烷基胺类，一乙醇胺等烷 基醇胺类等。其中，从安全性出发，更优选乙醇、丙酮。特别是通过醇类、多元醇类、酮类、有机酸类或脂肪酸类的添加，可以促进从5， 6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6_ 二羟基吲哚的转变。例如，通过添加50重量％的乙醇， 从5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6- 二羟基吲哚的转变被促进大约2倍。此外，通过上 述烷基胺类或烷醇胺类的添加，可以促进从5，6_ 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6_ 二羟基吲 哚-2-羧酸转变。例如，通过添加5 50重量％的一乙醇胺，就能够以70%以上的选择性 从5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸转变。水溶性有机溶剂优选以总量中的5 70重量％，更优选为30 60重量％的浓度 添加于反应液中。即使溶剂添加量多，也没有特别的问题，相反，具有转变速度变快、能够除 去生成的黑色素这样的效果，但只要上述范围内，就能够在实际应用上，在可以使5，6_ 二 羟基吲哚衍生物的比例提高的同时安全地进行后处理。(iii)添加无机盐作为无机盐，可以使用选自盐酸、硝酸、硫酸和碳酸的碱金属盐、碱土类金属盐或 铜(II )盐。其中，铜(II )盐可以促进5，6_ 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6_ 二羟基吲 哚-2-羧酸的转变，此外，铜(II )盐以外的无机盐可以促进5，6_ 二羟基吲哚满-2-羧酸 向5，6_ 二羟基吲哚的转变。从转变效率、防止盐和黑色素析出的方面出发，反应液中的无 机盐浓度优选在40重量％以下，更优选为0. 1 20重量％，进一步优选为1 5重量％。作为添加无机盐，例如，列举硫酸铜处理，通过向反应液中添加添加硫酸铜，使其 为0. 1 20mM左右，优选5 10mM，保存例如10 30分钟左右，就促进黑色素前体中的 5,6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸的转变。(iv)利用缓冲液进行处理作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液。作为磷酸缓冲液，可以列举磷酸钠缓冲液、磷 酸钾缓冲液、柠檬酸-磷酸钠缓冲液、三磷酸缓冲液。通过磷酸缓冲液处理，可以促进5， 6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸的转变。
(ν)添加抗氧化剂作为抗氧化剂，可以使用抗坏血酸、抗坏血酸钠、亚硫酸钠等，若添加2. 5重量％ 的抗坏血酸钠，则促进从5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸向5，6- 二羟基吲哚的转变速度。(3)黑色素前体的浓缩·保存含有黑色素前体的液体，优选以反渗透浓缩、喷雾干燥、冷冻浓缩等公知方法除去 水分、浓缩黑色素前体。进而，黑色素前体的单独品或混合物，还可以直接、以浓缩状态、以 干燥粉末状态等任意一种形态保存。进而，例示特定的黑色素前体的保存方法，5，6_ 二羟基吲哚满、5，6_ 二羟基吲哚 满-2-羧酸等吲哚满衍生物优选以粉末状的盐形态(优选盐酸盐、溴酸盐等)，优选在无氧 条件下保存。此外，5，6_ 二羟基吲哚、5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物可以在实质 上无氧的条件下，以溶液或粉末状态保存。作为以染发剂利用的形态，5，6- 二羟基吲哚满、5，6- 二羟基吲哚满-2-羧酸等吲 哚满衍生物，优选在使用前以无氧状态并且与水隔绝的状态(包含粉末状、油剂中的悬浮 状态)保管，在临使用前，和水、碱剂等一般的染发剂基剂混合，直接涂布在毛发上作为染 发剂使用。此时，虽然是空气氧化型染发剂，但是从黑色素前体的稳定性出发，优选制成伴 随混合等操作的双剂型或三剂型。另一方面，由于5，6- 二羟基吲哚、5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物只要在 无氧状态下，即使在水溶液中也是稳定的，所以，可以制成单剂型的空气氧化型染发剂，从 使用简单方面出发是优选的。从制造的容易程度、稳定性和染发性能出发，优选5，6_ 二羟 基吲哚，在黑色素前体中的5，6- 二羟基吲哚的比例，以在280nm的吸光度面积比计，优选在 60%以上。另-方面，由于5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸聚合得到的黑色素的水溶性高，因此 可以在临时染色用的染发剂组合物中利用。-染发剂组合物_通过在染发剂中配合如上操作而得到的黑色素前体，就能够成为仅从容器取出附 着在头发上暂时放置的简便的单剂型空气氧化型染发剂，能够将白发染成黑色素的自然色 调。为了制成单剂型染发剂，在黑色素前体中优选5，6_ 二羟基吲哚，但只要发挥染发性能， 也可以含有至一半左右的其它黑色素前体。在本发明的染发剂组合物中的黑色素前体的含量，从染发性能的观点出发，优选 为0.01 10重量％，更优选为0.05 5重量％，进一步优选为0. 1 1重量％。该含量 可以根据染发剂的使用目的而适当变化，当通过一次染发就染浓(黑)到目的水平时，优选 为0. 5 1重量％，当为慢慢地反复染发，使白发不明显的染发剂时，优选为0. 1 0. 4重 量％。此外，如果配合量在0.01重量％以上，则由于每次以极少量就能够染发，因此可以在 以手处理的染发剂或彩色染发剂用染料、头发用化妆材料的情况下等使用。在本发明中使用的黑色素前体的制造中，通过使用和生物体内同样的酶反应，具 有不需要用于除去由催化剂引起的化学反应产生的副产物的复杂的精制操作的优点。由于 黑色素相关物质以外的副产物几乎不存在，使用和天然存在的物质同样的黑色素前体，所 以，相比于其它的通过化学合成的制造方法或一般的氧化染发剂，在安全性方面也具有优 异的效果。本发明的染发剂组合物的pH优选调整为6 11，更优选调整为7 10. 5。在pH调整中，例如，可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨、胍、烷基胺、碱性氨基酸、碳酸盐等碱剂。作 为烷基胺，可以列举一乙醇胺，作为碱性氨基酸的具体例子，可以列举精氨酸、赖氨酸、组氨 酸等，作为碳酸盐的具体例子，可以列举碳酸钠、碳酸钾、碳酸胍、碳酸氢钠。此外，可以适当 使用盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乳酸等的无机或有机酸和碱剂并用。PH调整剂也可以并用2 种以上，此外，其含量优选为全部组成的0. 01 20重量％，更优选为0. 1 10重量％。作为染发剂的补充成分，可以含有水溶性有机溶剂。作为水溶性有机溶剂，可以 列举乙醇、丙醇等低级醇；乙二醇、丙二醇等二醇类；乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇 单丁醚等乙二醇单醚；二乙二醇单乙醚、二乙二醇单丁醚等卡必醇类；苄氧基乙醇、苯甲醇 等，其中，优选上述低级醇和二醇类。水溶性有机溶剂也可以并用2种以上，特别是当使用 苄氧基乙醇、苯甲醇时，优选并用其它溶剂，特别是低级醇、二醇类。水溶性有机溶剂的含 量，从染色性方面出发，优选为全部组成的5 50重量％，更优选为10 40重量％，进一 步优选为15 30重量％。在本发明的染发剂中，作为调色成分，可以添加氨基酸(特别是半胱氨酸)和现 有的氧化染料、直接染料(酸性染料、碱性染料、分离型染料)。根据目的，其含量优选为 0. 001 5重量％，更优选为0.01 2重量％，进一步优选为0.05 1重量％。本发明的染发剂组合物可通过添加增粘剂而进行粘度调整，由此成为乳剂、凝胶、 洗剂、泡沫等形态。作为增粘剂，可以列举羟乙基纤维素、羟乙基纤维素和环氧丙基三甲基 氯化铵的醚、甲基纤维素、羧甲基纤维素等纤维素衍生物；黄原胶、瓜尔豆胶等天然树胶类； 聚乙烯吡咯烷酮、交联型聚丙烯酸或其盐、聚丙烯酸或其盐、聚丙烯酰胺等合成高分子。其 配合种类和配合量可以根据目的粘度决定，粘度优选为100 50000mPa*S。本发明的染发 剂组合物，在不增粘时可以得到轻的使用感觉，而通过添加增粘剂使之增粘，就能够不损伤 染色能力，并且使用不用担心滴液。此外，在本发明的染发剂组合物中，作为起泡剂和/或均勻剂，可以含有非离子表 面活性剂。作为非离子表面活性剂，可以列举聚氧乙烯油酰醚、聚氧乙烯硬脂酰醚等聚氧乙 烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯 山梨醇酐脂肪酸酯、脂肪酸烷基醇酰胺、聚氧乙烯-仲十四烷基醚等。非离子表面活性剂的 含量优选为0.01 30重量％，更优选为0. 1 10重量％。此外，在本发明的染发剂组合物中，为了确保安全性，希望添加抗氧化剂。作为抗 氧化剂，可以列举抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸酯等抗坏血酸类、亚硫酸钠等无机盐类、 半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等半胱氨酸衍生物、迷迭香提取物、茶提取物等显示抗氧化作 用的植物提取物、生育酚、醋酸生育酚等维生素类、BHT等的清除剂类等。其中，优选抗坏血 酸类，如果考虑使用PH，则优选抗坏血酸钠。此外，作为使稳定性提高的成分，也可以使用 EDTA或其盐、1-羟基乙烷-1，1- 二磺酸或其盐等螯合剂。在本发明的染发剂组合物中，在上述成分以外，根据目的，可以适当配合在通常染 发剂中使用的成分，例如，上述以外的表面活性剂、稳定剂、缓冲剂、香料、触感改善剂、螯合 剂、增溶剂、防腐剂等。作为本发明的染发剂组合物的优选形态，可以列举反复使用的徐染型染发剂。此 外，优选气溶胶的形态。为了将本发明的染发剂组合物制成气溶胶型，向耐压容器(气溶胶罐等)中和染
11发剂组合物一起充填喷射剂即可。作为喷射剂，可以使用在一般气溶胶制品中使用的压缩 气体、液化气体等，作为压缩气体，可以列举氮气、碳酸气、氩气等，作为液化气体，可以列举 液化石油气、低级饱和烃类、二甲醚等。这些喷射剂也可以并用2种以上，为了得到适度的 喷射速度，在全部组成中优选含有1 20重量％，更优选含有3 15重量％。此外，优选 将充填后的气溶胶罐的内压调整为3 5kg/cm2G(25°C )。此外，将在本发明的氧化工序中得到的黑色素前体进行氧化聚合，作为分子量仅 在3000以上的黑色素，能够在头发用化妆材料(免洗型或冲洗型)配合。作为这样的头发 化妆材料，例如，可以列举洗发水、染发液、护发素、发胶、定型剂、电烫剂、蜡、亮发剂、生发 剂等。作为剂型，可以列举气溶胶、泡沫、乳剂、液状、糊状等。实施例制造例1黑色素前体的制造1.米曲霉的酪氨酸酶基因的克隆克隆曲霉属菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的melB酪氨酸酶基因。在蒸米中接种曲霉属菌米曲霉(Aspergillus oryzae) 0SI-1013株(FERM P-16528)，称量1.5g酒曲制作后的酒曲，在液氮中完全破碎。使用日本Gene社生产的 ISOGEN,提取 240 μ g 的总 RNA。使用 TaKaRa 株式会社生产的 01igotex_dT30<Super>，从 120 μ g 的总 RNA 中精制了mRNA。采用 Clontech 社生产的 SMART cDNA Library Construction Kit 将该 mRNA 制成 cDNA 文库，通过 PCR 只扩增 melB cDNA。将得到的PCR产物进行琼脂糖电泳，确认只扩增了约l.SKbp的目的条带。此外， 碱基序列分析的结果也确认内含子序列被正常地除去。2.重组入酵母将由上述1得到的cDNA以能够表达的状态连接于Invitrogen社生产的大肠杆菌 用表达载体pET23b、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用表达载体(日本专利特开 2003-265177号公报)、曲霉属菌米曲霉(Aspergillus oryzae)表达载体(日本专利特开 2001-224381号公报)，由此就能够在各菌体内大量表达酪氨酸酶。特别表示在酵母中表达的例子(以日本专利特开2003-265177号公报为基准)，在 具有SEDl启动子和ADHl终止子的表达载体的启动子的直接下游的Smal部位，插入由PCR 扩增后的melB cDNA。通过在URA3标记内部存在的Stu I部位切断而得到含有melB cDNA 的片断，将该片断作为导入用盒而进行精制。此时，作为宿主的酵母，使用来自在清酒酿造 中使用的实用酵母·协会9号的尿嘧啶缺陷株。3.重组酵母的酪氨酸酶活化和测定(3-1)酪氨酸酶活性测定菌体的酪氨酸酶活性的测定如下进行。将一部分菌体悬浮在水中，向该0. ImL悬 浊液中添加0. 8mL 30°C的IOmM L-D0PA (溶解在0. 005N的盐酸中)和0. ImL的IM磷酸钠 缓冲液(PH6. 0)，在30°C下反应5分钟后，以15000rpm进行30秒钟离心分离，由此除去菌 体，测定在作为DOPA吸收极大波长的475nm的吸光度。调整菌体量，使得在反应后的反应 液的475nm的吸光度在0. 1 0. 3内。(3-2)酪氨酸酶活化处理以常规方法培养在上述2中得到的重组酵母，通过离心分离回收菌体，然后以蒸馏水洗净。将菌体悬浮在10倍于菌体重量左右的含有2mM硫酸铜的50mM Tris-HCl缓冲 液(PH8.0)中，在4°C静置一夜。通过离心分离回收菌体，为了除去过剩的铜离子，以0. IM 的EDTA溶液洗净。将洗净后的菌体悬浮在0.2M的醋酸缓冲液(pH3.0)中，在室温静置1 小时。活化后的菌体通过离心分离回收，成为活化菌体。通过上述(3-1)的测定方法测定活化菌体的酪氨酸酶活性，为1. 9 4. 4U/0D_。 以下使用这样测定后的各转化株。4.多巴色素的积累反应使用在上述3中得到的酵母转化体，以L-DOPA为底物，进行作为黑色素前体的多 巴色素的积累反应。将7. 9g的L-DOPA溶解在500mL的0. 03N硫酸中后，使用2N的氢氧化钾调整至 PH5. 5。在该L-DOPA溶液中，向5L容积反应槽中投入由步骤3得到的2. 7X 105U/L(每IL 反应液的菌体活性值为1. 35X 105U/L的量)重组酵母菌体，使反应液量为2L，开始反应。将反应温度调节至25°C。反应刚开始后，因为需要大量的氧，所以，将通气量和搅 拌调至最大。通过添加硫酸和氢氧化钾将PH调节至5. 5。进行40分钟的反应。以DO (容存氧量)为指标，调节反应液中的搅拌和通气量至2 7ppm。在反应中 进行适当取样，以下述所示的定量方法测定多巴色素、5，6-二羟基吲哚。在图1中表示反应 液中的L-DOPA浓度和黑色素前体浓度的推移。在该反应条件下，由于5，6_ 二羟基吲哚羧酸的生成是极其微量的，所以，前体浓 度以多巴色素浓度和5，6_ 二羟基吲哚浓度的合计值表示。根据条件而多少有所不同，但反 应结束时的多巴色素浓度比5，6-二羟基吲哚浓度高3 5倍，可以说主要成分是多巴色 素。此外，以处于将L-DOPA完全消耗(在通过HPLC测定的检出界限以下)的状态设定为 反应结束的判断基准。以该检出界限以下的状态定义为实质上不含有。核对黑色素前体浓度的经时变化和记录的氧浓度及用于维持pH的酸、碱添加量 的经时变化等，此外，为了完全消耗D0PA，进行40分钟的反应。<黑色素前体各成分的定量方法>使用Waters社生产的HPLC Alliance2695_2996，用以下的条件检出和定量黑色 素前体的各成分。在成分的分离中，使用Imtakt社生产的反相柱Unison UK-C18 (4. 6X 150mm)，流 动相使用1.5%磷酸溶液(A液)和99.9%甲醇(B液)，设定流动相中的B液的梯度为，开 始为0%，5分钟后变为50%。流速为1. OmL/分钟。注入的样品通过下述方法配置相对10 μ L样品，添加100 μ L的20mM的连二亚硫 酸钠(Na2S2O4)和890 μ L的1. 5%的磷酸(H3PO4)溶液，以0. 45 μ m的滤器过滤。将20 μ L 该样品注入上述柱中，进行测定。多巴的检出通过在极大吸收波长280nm的吸光度进行监控。多巴色素作为以上述 测定条件被还原的无色多巴色素(5，6-二羟基吲哚满-2-羧酸)而被定量。5，6-二羟基吲 哚以标准物质(5，6_ 二乙酰氧基吲哚的碱水解物)为根据来定量，5，6-二羟基吲哚-2-羧 酸通过在280nm的峰区面积的比例进行比较。5，6- 二羟基吲哚的极大吸收波长为300nm， 5,6- 二羟基吲哚羧酸的极大吸收波长为320nm。5.黑色素前体溶液的除蛋白
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由于使用具有坚固细胞壁的酵母细胞，所以，在上述4的工序中得到的黑色素前 体溶液中不存在或几乎不存在黑色素前体溶液中存在的菌体的碎片和从菌体流出的蛋白 质。但是，当作为染发剂使用时，由于微量含有的蛋白质有成为变应原的可能性，所以通过 超滤除去蛋白质。作为超滤装置，使用Daicen Membrane社生产的超滤模块· A七, FS10-FUS0181 (截留分子量为1万)。将由过滤得到的溶液进行SDS-PAGE和银染，由此确 认蛋白质被除去。之所以没有采用如通常进行的测定在280nm的吸光度的方法，原因在于 多巴色素本身在280nm附近有吸收，而且，由于吲哚的反应性高，所以容易和显色试剂发生 反应等。银染的结果为，在超滤后没有检出可认为蛋白质的条带。6.从多巴色素向5，6_ 二羟基吲哚和5，6_二羟基吲哚-2-羧酸的转变(黑色素前 体的转变方法)在上述5的工序中得到的溶液中所含的黑色素前体主要为多巴色素，即5，6_二羟 基吲哚满-2-羧酸，但作为染发剂，为了生成染发性能或保存稳定性优异的5，6_ 二羟基吲 哚和5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸要进行转变黑色素前体的非酶处理。方法为pH调整、添加 有机溶剂、添加磷酸缓冲液、金属离子处理等，以任任一种方法都可以有效地转变。此外，以下所示的黑色素前体的存在比例，是通过在280nm的吸光度面积比而得 的。(6-1)通过pH调整对前体溶液组成的控制对在上述5的工序中得到的黑色素前体溶液(主要含有多巴色素)，通过pH进行 前体的调整。在无氧状态下，在40°C下保存2小时。如果以酸性 中性附近(pH在5以上、 8以下)进行处理，则5，6_ 二羟基吲哚的比例就提高(在前体中在50%以上，在最佳条件 下在80%以上)；如果以pH8 11进行处理，则5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸的比例提高。此 外，在pH2 4时生成沉淀，是不适于处理的。(6-2)通过有机溶剂的添加对前体溶液组成的控制向在上述5的工序中得到的黑色素前体溶液(主要含有多巴色素)添加乙醇，使 其为全部量的50容量％，在室温下处理2小时。多巴色素被有效地转变为5，6-二羟基吲 哚(5，6_ 二羟基吲哚相对5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸的比例在10倍以上)。使用甲醇、丙 酮、2-丙醇或乙腈代替乙醇时，也可见同样的效果。此外，向在上述5的工序中得到的黑色素前体溶液中添加2-氨基乙醇，使其为全 部量的50容量％，在室温处理2小时。多巴色素被有效地转变为5，6-二羟基吲哚-2-羧 酸(5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸相对5，6_ 二羟基吲哚的比例在5倍以上)。(6-3)通过磷酸缓冲液对前体溶液组成的控制通过向在上述5的工序中得到的黑色素前体溶液(主要含有多巴色素)中添加IM 磷酸缓冲液，制成含有黑色素前体的PH6. 0的0. IM磷酸缓冲液。将该前体溶液在_20°C左 右保存7天。通过在含有作为酸成分的磷酸的磷酸缓冲液中低温保存，多巴色素被有效地 转变为5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸(5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸相对5，6- 二羟基吲哚的比例 在5倍以上)。(6-4)通过氯化钠或抗坏血酸钠对前体溶液组成的控制如果向在上述5的工序中得到的黑色素前体溶液(主要含有多巴色素)添加氯化钠，使其最终浓度为2. 5%，在室温下静置45分钟，则相比于未添加的系统，促进了多巴色 素向5，6_ 二羟基吲哚的转变。此外，如果添加抗坏血酸钠溶液代替氯化钠，则显著量的5， 6- 二羟基吲哚积累(黑色素前体中的5，6_ 二羟基吲哚的存在比例为90% )。(6-5)通过铜(II )盐对前体溶液组成的控制向上述5的工序中得到的黑色素前体溶液(主要含有多巴色素)中添加硫酸铜， 使其最终为ImM，在室温下静置15分钟，促进了多巴色素向5，6- 二羟基吲哚_2_羧酸的转 变(5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸相对5，6- 二羟基吲哚的比例在3倍以上)。7.黑色素前体溶液的浓缩黑色素前体溶液(多巴色素、5，6_ 二羟基吲哚和5，6_ 二羟基吲哚-2-羧酸)可 以如下操作进行浓缩。使用在从海水制造纯水中使用的错流型反渗透浓缩装置(日东电工 Matex社生产)用于浓缩。该装置使溶液在加入有黑色素前体溶液的密闭槽和反渗透浓缩 模块NTR7410-HG-S4F之间进行循环，由反渗透浓缩模块生成的纯水从该模块导入滤过水 槽。伴随纯水的生成，黑色素前体在槽内被浓缩。循环通过泵以2MPa的压力进行。通过约 30分钟的操作，将在步骤5得到的约31L黑色素前体溶液被浓缩为约4L。在该浓缩操作 中，在黑色素前体滤过液中几乎不生成高分子黑色素，作为指标的5，6-二羟基吲哚的浓度 从约9mM上升至约67mM，回收率极高。实施例11.染发剂组合物的配制(1)使用以下物质作为染发剂用的黑色素前体组合物。在使用具有1. 9 4. 4U/0D_的酪氨酸酶活性的导入了来自曲霉菌的酪氨酸酶基 因(melB)的重组酵母(Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母)的氧化工序中，从约20mM 的L-DOPA生成多巴色素(约10 15mM)，将其作为离心分离的上清回收(工序收率约 50 65% )。进而，通过以pH6附近的处理和超滤、反渗透膜浓缩，得到约1重量％的黑色素前 体溶液1。本溶液在HPLC法中，在280nm作为黑色素前体被检出的物质，其90%以上为5， 6-二羟基吲哚，其10%以下为5，6_ 二羟基-2-羧酸。吲哚满类在以下。原料L-DOPA 未能检出。通过SDS-聚丙烯酰胺电泳法确认不含蛋白质。通过本方法可以有效地制造以 适合染发剂的5，6-二羟基吲哚为主要成分(黑色素前体含量在90%以上)的黑色素前体。(2)使用30g (含有黑色素前体约0.3g)上述黑色素前体溶液1，配制IOOg下述组 成的染发剂(本发明品1)。在配制时，为了防止氧混入而在厌氧条件下进行。将其作为原 液，和喷射剂(LPG) —起各自充填于气溶胶容器中(原液喷射剂=90 10，重量比)。黑色素前体溶液130g (黑色素前体约0. 3g)黄原胶0. 2g氨水(28重量 ％)0. 5g乙醇IOg乂 7夕7 —卟90 (日本触媒社生产) 0. 5g水余量抗氧化剂适量合计IOOg
2.染发试验(以测色计进行评价)将Ig在1中得到的染发剂适用于Ig的白发束，在30°C下染色15分钟。然后，水 洗、洗发、染发，接着干燥。每隔7天重复该操作，共计5次。以分光测色计(Minolta社生 产的CM-2002)测定染色后的发束，根据以下式算出的色差(ΔΕ)进行评价。Δ E = {(L1-L0)2+ (ara0)2+ (brb0)2}1/2(L0, a0, b。)染色前的白发束的测色值(L1, ai; ID1)染色后的白发束的测色值白发束的ΔΕ值在第1次为15、在第3次为28、在第5次为38，慢慢地变黑。3.稳定性在40°C下保存2周后，以HPLC测定的主峰的定量值几乎不变，确认具有高稳定性。实施例2染发剂组合物(泡沫型)混合5g黑色素前体溶液1 (含有黑色素前体约0. 05g)、0. 5g、” ”一 90、 0. Ig黄原胶、0.3g十八烷基三甲基氯化铵、0. Olg聚氧乙烯·甲基聚硅氧烷共聚物、IOg乙 醇和余量水，配制IOOg染发剂。为了防止在配制时混入氧，在厌氧条件下进行。将其作为 原液，和喷射剂(LPG) —起各自充填于气溶胶容器中(原液喷射剂=90 ；10，重量比)。
1权利要求
一种黑色素前体的制造方法，其特征在于包括工序(a)，在反应液中，使用选自曲霉(Aspergillus)属、脉胞菌(Neurospora)属、根毛霉(Rhizomucor)属、木霉(Trichoderma)属和青霉(Penicillium)属的丝状菌的儿茶酚氧化酶或表达所述酶的细胞，对酪氨酸或其衍生物进行氧化，将其转变为黑色素前体的工序；工序(b)，从所述反应液中除去所述酶或所述细胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，对所述反应液进行处理，提高5，6 二羟基吲哚和/或5，6 二羟基吲哚 2 羧酸的浓度的工序；所述黑色素前体包含多巴色素(Dopachrome)、5，6 二羟基吲哚和5，6 二羟基吲哚 2 羧酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述5，6- 二羟基吲哚和/或5，6- 二羟基吲哚-2-羧酸的浓度通过选自(i) pH调节处 理、(ii)添加水溶性有机溶剂、(iii)添加无机盐、(iv)利用缓冲液进行处理、和(ν)添加 抗氧化剂中的1种以上处理来提高。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述儿茶酚氧化酶是酪氨酸酶，所述酪氨酸酶与米曲霉(Aspergillus oryzae)的 melB酪氨酸酶基因、米曲霉的melD酪氨酸酶基因或米曲霉的melO酪氨酸酶基因所编码的 酪氨酸酶实质上相同。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法使用表达所述儿茶酚氧化酶的所述细胞，所述细胞是大肠杆菌、酵母或丝状 菌的细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述儿茶酚氧化酶的底物包含L-DOPA，L-DOPA的浓度在所述工序(a)的转变反应开始 时为15mM以上，在所述工序(a)的转变反应结束时为0. ImM以下。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑色素前体包含5，6- 二羟基吲哚，所述黑色素前体中的5，6- 二羟基吲哚的比例， 以280nm处的吸光度的面积比计，为60%以上。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑色素前体是使用DOPA酯或酪氨酸酯作为所述儿茶酚氧化酶的底物来调制的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用DOPA或多巴胺作为原料或中间体。
全文摘要
本发明提供一种黑色素前体的制造方法，包括工序(a)，在反应液中，使用选自曲霉(Aspergillus)属、脉胞菌(Neurospora)属、根毛霉(Rhizomucor)属、木霉(Trichoderma)属和青霉(Penicillium)属的丝状菌的儿茶酚氧化酶或表达所述酶的细胞，对酪氨酸或其衍生物进行氧化，将其转变为黑色素前体的工序；工序(b)，从所述反应液中除去所述酶或所述细胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，对所述反应液进行处理，提高5，6-二羟基吲哚和/或5，6-二羟基吲哚-2-羧酸的浓度的工序；所述黑色素前体包含多巴色素(Dopachrome)、5，6-二羟基吲哚和5，6-二羟基吲哚-2-羧酸。
文档编号C12P17/10GK101914585SQ20101021624
公开日2010年12月15日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月8日
发明者中村幸宏, 小池谦造, 小畑浩, 秦洋二, 齐藤芳纪 申请人:花王株式会社;月桂冠株式会社