专利名称：检测肠道病毒71型的专用引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测肠道病毒71型的专用引物及其应用。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)是1969年首次从加利福尼亚一名患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离而来的。不同亚型EV71感染人后的临床症状不完全相同，通常可引起患者手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病。该病致残及病死率较高，尤其患儿发病时并发症和死亡率较高。自20世纪60年代逐渐明确其病原体以来，手足口病已在全世界范围内多次暴发或流行，累及地域广泛、人口众多。最近几年来，我国肠道病毒EV71感染导致的手足口病流行日趋严重。传统的普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法等常需要花费较长时间或者需要特定的仪器，难以满足暴发疫情快速诊断的需要。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用4条特异引物(F3，FIP，B3和BIP)在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断复制扩增核酸。在反应体系中可添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环结构结合启动链置换合成，周而复始。 扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
发明内容
本发明的目的是提供检测肠道病毒71型的专用引物及其应用。本发明提供的专用引物包括序列表的序列1至序列4所示的DNA。所述专用引物还可包括序列表的序列5所示DNA和/或序列表的序列6所示DNA。所述专用引物优选由序列表的序列1至序列6所示DNA组成。F3(序列 1) :5，-CTTCCCGGTCTCAGCACA-3，；B3(序列 2) :5，-GCGGTGTATAGGCTATGAGC-3，；FIP(序列 3) :5，-TGACCCAGCAAGGTGGATTGCTTTTAGCAGGGAAAGGTGAGCT-3，；BIP (序列 4) 5，-TGCGGGTACTACACCCAATGGTTTTTAGCCATGAAGGACCCAGTA-3，；LF(序列 5) :5，-CGGCTCTGAACACCGCACAC-3，；LB (序列 6) 5，-GGATCATTAGAAGTCACCTTCATGT-3，。所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的5’端和/或3’端还可根据靶序列进行延长；所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LF、LB还可进行碱基的替换和/或取代和/或插入，保持85%的同源性即可；所述专用引物物还可由？3』3、？1 、81 、1^、1^的反向互补序列组成。本发明还保护所述专用引物在辅助鉴定肠道病毒71型中的应用。本发明还保护一种辅助鉴定肠道病毒71型的方法，包括如下步骤(1)提取待测病毒的RNA ；
(2)用所述的专用引物进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)；(3)检测扩增产物确定待测病毒是否为肠道病毒71型。所述环介导等温扩增反应条件可为60 65°C反应30 60min，然后75°C 2min 终止反应。所述环介导等温扩增反应条件具体可为63°C反应35-60min，然后75°C ^iin终止反应。所述环介导等温扩增反应体系中，F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LB和LF的浓度均为20pmol/L。所述肠道病毒71型具体可为BrCr毒株或F8-Henan-08毒株。本发明还保护所述专用引物在制备辅助鉴定肠道病毒71型的试剂盒中的应用。RNA提取可采用常规方法，如使用Qiagen RNeasy Mini kit或其他同类试剂盒。对结果进行分析判定的方法如下(1)通过反应液的浊度进行判定核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列； 可以采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测反应液的浊度变化，如果实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本来自肠道病毒71型。(2)通过荧光染料的颜色变化进行判定应用本方法进行判定时，LAMP体系中需要有钙黄绿素、Mg2+和Mn2+ ；反应初始时钙黄绿素与Mg2+结合，反应液显示透明的橙色，核酸大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，焦磷酸根离子的存在，使得Mg2+游离出来，钙黄绿素和Mn2+结合，反应液显示微浊的黄绿色； 基于该原理，可以根据反应液的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列；自然光下，如果反应液由透明橙色变为微浊的黄绿色，则表明待测样本来自肠道病毒71型；紫外光下，如果反应液显示强荧光则表明待测样本来自肠道病毒71型。本发明适用于对肠道病毒71型(EV71)进行特异性检测和定量分析。本发明的优点(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成(如用6条引物仅需35分钟)；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。
图1为实施例3中在自然光㈧和紫外灯⑶下各个样本的颜色比较结果；1至6 依次为样本1至样本6。图2为实施例3的实时浊度仪扩增曲线。图3为实施例4的实时浊度仪扩增曲线。图4为实施例6的实时浊度仪扩增曲线。图5为实施例7的实时浊度仪扩增曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用无机化学试剂和有机试剂均符合分子生物学实验的要求。引物由上海英骏技术公司合成，RT-LAMP 试剂盒RNA Amplification Kit (RT-LAMP),日本荣研公司，CodeNo: LMP244。LAMP 荧光检测试剂 fluorescent Detection Reagent，日本荣研公司，CodeNo LMP221。RNA 提取试剂盒Rneasy Mini Kit，QIAgen 公司产品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor)大连宝生物(TAKARA)公司产品，CatNo. D2310。LA-320C 实时浊度仪，日本荣研公司产品。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒B3、脊髓灰质炎病毒均获自中国药品生物制品检定所。肠道病毒71型FS-Henan-os毒株中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保证可在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后向公众提供；参考文献韩剑锋，安康，等.河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征.军事医学科学院院刊，2008，32 (6) :523-524.。肠道病毒71型brcr毒株中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保证可在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后向公众提供；参考文献Arita M, Shimizu H，Nagata N，et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 7lshow attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005. 86(PT 5) :1391_1401o实施例1、专用引物的设计以及各个专用引物的制备根据肠道病毒71型(EV71)中国流行株VP3蛋白设计特异性引物序列如下F3(序列 1) :5，-CTTCCCGGTCTCAGCACA-3，；B3(序列⑴5，-GCGGTGTATAGGCTATGAGC-3，；FTP(序列；3) :5，-TGACCCAGCAAGGTGGATTGCTTTTAGCAGGGAAAGGTGAGCT-3，；BIP(序列 4) :5，-TGCGGGTACTACACCCAATGGTTTTTAGCCATGAAGGACCCAGTA-3，；LF(序列 5) 5' -CGGCTCTGAACACCGCACAC—3，；LB (序列 6) :5，-GGATCATTAGAAGTCACCTTCATGT-3，。引物卩3、83、卩1 、81 、1^和1^组成专用引物甲。引物？3、83、？1 、81卩和1^组成专用引物乙。引物？3、83、？1 、81卩和1^组成专用引物丙。引物F3、B3、FIP和BIP组成专用引物丁。
用于实施例3至实施例6的检测。实施例2、病毒样本的制备肠道病毒71型FS-Henan-OS毒株的病毒液，通过蚀斑形成单位计算感染性滴度 (PFU/ml)。使用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释，得到5种不同浓度的病毒液(浓度分别为 3X 102PFU/ml,3X lO'PFU/ml,3PFU/ml,0. 3PFU/ml、0. 03PFU/ml)。将得到的 5 种病毒液和DMEM培养基(阴性对照)作为六个样本，分别进行实施例3和实施例4的检测。样本1 浓度为 3X 102PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。样本2 浓度为 3 X Io1PFUAiI 的 F8-Henan_08 病毒液。样本3 浓度为3PFU/ml的F8-Henan_08病毒液。
样本4 浓度为 0. 3PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。样本5 浓度为 0. 03PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。样本6 =DMEM培养基。实施例3、专用引物甲的应用(检测F8-Henan-08毒株)用专用引物甲对实施例2制备的6种病毒样本进行检测。一、病毒基因组RNA的提取(采用RNA提取试剂盒)将210 μ 1样本转至新的1. 5ml离心管中，补加700 μ 1 RLT溶液和7 μ 1 β _巯基乙醇，振荡混勻后加入490μ 1无水乙醇，剧烈振荡后分两次加至硅胶柱中，进行硅胶柱过
滤ο硅胶柱过滤将加样后的硅胶柱10，OOOg离心15s ；加700 μ 1 Rffl缓冲液， 10，OOOg离心15s ；用RPE缓冲液离心洗硅胶柱两次(每次500 μ 1)；将硅胶柱转至新的离心管中，10，OOOg离心2min ；将硅胶柱转至新的离心管中，加入50 μ 1无核酸酶水，室温静置 2min，然后10，OOOg离心2min，收集洗脱液；在洗脱液中加入1 μ 1 RNA酶抑制剂，-70°C保存，即为待测RNA。待测RNA用于步骤2或步骤3的检测。二、应用专用引物甲检测(采用RT-LAMP试剂盒)用实施例1中的专用引物甲检测步骤1得到的待测RNA，在试管中进行反应。LAMP反应体系(25 μ 1) :F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为 40pmol/L, LB 和 LF 的浓度均为 20pmol/L，2XEnzyme Buffer 12. 5ul (含 Mg2+和 Mn2+)， Enzyme Iul ,Fluorecent Detection Reagent Iul (含钙黄绿素)，1 μ 1 待测 RNA，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水定容；以上浓度均为体系中的终浓度。LAMP反应体系在63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应。终止反应后，自然光下试管的照片见图1A，终止反应后紫外灯照射下试管的照片见图1B。图IA中，样本1至样本3为阳性，样本4至样本6为阴性。图IB中，样本1至样本3为阳性，样本4至样本6为阴性。采用肉眼观察，检测方法的灵敏度为3PFU/ml。待测RNA中病毒RNA的浓度= 3PFU/mlX210X10_3ml + 50y 1 ^ 0. OlPFU/μ 1。每个 LAMP 反应体系中病毒 RNA 的含量= 0. OlPFU/μ ΙΧΙμ 1 = 0. OlPFU。即灵敏度为 0. OlPFU/反应体系。采用紫外灯照射下观察，检测方法的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。三、用专用引物甲检测EV71病毒(实时浊度仪)LAMP反应体系中不含有Fluorecent Detection Reagent，其它同步骤二的LAMP 反应体系。将LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应。实时浊度仪扩增曲线见图2。样本1至样本3为阳性，样本4至样本6为阴性。浊度仪观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。实施例4、专用引物乙、专用引物丙和专用引物丁的应用(检测FS-Henan-OS毒株)分别用专用引物乙和专用引物丙对实施例2制备的6种病毒样本进行检测，方法同实施例3。用专用引物丁对实施例2制备的6种病毒样本进行检测，实时浊度仪中，反应时间为60min，其它同实施例3。采用专用引物乙肉眼观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系，紫外灯照射下观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。浊度仪观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。采用专用引物丙肉眼观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系，紫外灯照射下观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。用浊度仪观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。采用专用引物丁 肉眼观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系，紫外灯照射下观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。用浊度仪观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。实时浊度仪扩增曲线见图3。结果表明专用引物乙、专用引物丙、专用引物丁与专用引物甲仅在使用实时浊度仪检测判断时，反应时间有差异(采用专用引物甲反应仅需35分钟，采用专用引物丁约需 35分钟)；专用引物乙、专用引物丙、专用引物丁与专用引物甲在应用时，检测灵敏度没有差异；各组专用引物在应用不同的检测判断方法(使用实时浊度仪、肉眼观察或紫外灯观察)时，检测灵敏度没有差异。实施例5、应用各种专用引物检测BrCr毒株一、病毒样本的制备用肠道病毒71型BrCr毒株代替肠道病毒71型F8-Henan-08毒株，其它同实施例 2。二、应用各种专用引物检测BrCr毒株分别用专用引物甲、专用引物乙、专用引物丙和专用引物丁对步骤一制备的6种病毒样本进行检测，方法同实施例3。采用专用引物丙肉眼观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系，紫外灯照射下观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。用浊度仪观察的灵敏度为0. OlPFU/反应体系。采用专用引物甲、专用引物乙、专用引物丙和专用引物丁肉眼观察的灵敏度均为 0. OlPFU/反应体系，紫外灯照射下观察的灵敏度均为0. OlPFU/反应体系。用浊度仪观察的灵敏度均为0. OlPFU/反应体系。专用引物乙、专用引物丙、专用引物丁与专用引物甲仅在使用实时浊度仪检测判断时，反应时间有差异(采用专用引物甲反应仅需35分钟，采用专用引物丁约需60分钟)。实施例6、特异性检测采用专用引物甲分别对肠道病毒71型BrCr毒株和相似症候群毒株柯萨奇病毒 A16、柯萨奇病毒B3、脊髓灰质炎病毒进行检测(待测病毒液的浓度均为3X 102PFU/ml)。方法同实施例3。柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒B5、脊髓灰质炎病毒均为阴性结果， 肠道病毒71型BrCr毒株为阳性结果，说明本发明方法具有良好特异性。实时浊度仪扩增曲线见图4。实施例7、待检样品(患者粪便)LAMP反应检测检测25位志愿者的粪便，将粪便溶解后作为样本用专用引物甲进行检测，方法同实施例3。其中18位为阳性结果(有扩增曲线)，7位为阴性结果(没有扩增曲线)。实时浊度仪扩增曲线见图5。说明LAMP方法能用于检测临床病例标本中包含的EV71病毒。
权利要求
1.专用引物，包括序列表的序列1至序列4所示的DNA。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于所述专用引物还包括序列表的序列5 所示DNA和/或序列表的序列6所示DNA。
3.如权利要求2所述的专用引物，其特征在于所述专用引物由序列表的序列1至序列6所示DNA组成。
4.权利要求1至3中任一所述专用引物在辅助鉴定肠道病毒71型中的应用。
5.辅助鉴定肠道病毒71型的方法，包括如下步骤(1)提取待测病毒的RNA；(2)用权利要求1至3中任一所述的专用引物进行环介导等温扩增；(3)检测扩增产物确定待测病毒是否为肠道病毒71型。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应条件为60 65°C反应30 60min，然后75°C 2min终止反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应条件为63°C反应 ;35-60min，然后 75°C 2min 终止反应。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述环介导等温扩增的反应体系中，F3 和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LB和LF的浓度均为20pmol/ L0
9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述肠道病毒71型为BrCr毒株或F8-Henan-08毒株。
10.权利要求1至3中任一所述专用引物在制备辅助鉴定肠道病毒71型的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测肠道病毒71型的专用引物及其应用。本发明提供的专用引物，包括序列表的序列1至序列4所示的DNA，优选由序列表的序列1至序列6所示DNA组成。本发明的专用引物适用于对肠道病毒71型(EV71)进行特异性检测和定量分析。本发明的优点(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成(如用6条引物仅需35分钟)；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102296064SQ20101021583
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘娟, 姜涛, 秦成峰, 秦鄂德, 韩剑峰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所