专利名称：一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的分子育种方法，具体涉及一种快速获得大量转基因天山雪 莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)新品种的分子育种方法。
背景技术：
^LijH^ (Saussurea involucrata Kar. et Kir) 禾中#■白勺$貞巾胃， 胃 独特的生境，目前天山雪莲还不能在一般的生长条件下栽培，更谈不上人工培育天山雪莲、 品质资源的创新和生物学研究等。长期以来，由于对天山雪莲资源的掠夺，天山雪莲已近濒 危，现已被列为国家二级濒危植物，拯救天山雪莲已到了刻不容缓的地步。转基因生物技术无疑是现代生物技术应用最为迅速的重大技术之一，在培育植物 优良品种方面具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用转基因生物技术获取转基因天山雪莲新品种的分 子育种方法。本发明通过将携带目的基因的表达载体转化农杆菌后，将此农杆菌与通过植物组 织培养技术培养的天山雪莲外植体共培养，使得目的基因插入到外植体基因组中，经过抗 性素筛选后，再通过分子检测方法对抗性愈伤或者抗性芽进行检测，含有目的基因的抗性 株即为转化株，将此转化株通过芽增殖途径可以获得大量的转化株，转化株经栽培后，即可 获得转基因天山雪莲新品种，从而实现了本发明的目的。本发明的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，包括以下步骤a)外植体的培养该外植体为天山雪莲实生苗的叶片或者再生芽的叶片、叶柄或 者根茎结合部；所述的再生芽是通过以下方法制备的将天山雪莲种子灭菌后，接种到不 含激素的1/2MS基本培养基中，24士 1°C下，黑暗下培养，待种子萌发后，将其移至光下培 养，切取培养的天山雪莲的叶片，接种于芽诱导培养基上，诱导出从生芽，然后将丛生芽转 移至从生芽伸长培养基，光下培养获得再生芽；b)将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌菌液中，该表达 载体含有潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为筛选基因，然后将外植体移至共培养基中共培 养，24士 1°C下，黑暗条件下培养，然后去除外植体上的根癌农杆菌，移至抗性愈伤筛选培养 基中，24士 1°C下，黑暗条件下培养，再将抗性愈伤移至抗性芽再生培养基中，24士 1°C下，光 下培养，待长出抗性芽，将抗性芽接种到抗性芽伸长培养基中，光下培养，切取伸长的抗性 芽接种到抗性芽生根培养基中，光下培养，诱导生根；c)转基因植株的分子检测利用表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目的 基因的序列进行PCR分子检测法、Southern杂交方法或者RT-PCR检测法，检测抗性愈伤或 者抗性芽或者抗性植株是否已是转基因材料；d)转基因植株的移栽将检测含有目的基因的生根的转基因植株从培养基中取出，洗净，置于灭菌的蛭石中，17士 1 °C，光下培养，正常生长，得到转基因天山雪莲；所述的芽诱导培养基为每升MS培养基添加1. 5mg benzyladenine (ΒΑ)、 0. Imga-Naphthalene acetic acid (NAA), pH 为 5.8 ;所述的丛生芽伸长培养基为每升MS培养基添加0. 2mg BA、0. Olmg NAA, pH 5. 8，所述的共培养基为每升MS培养基添加Img BA、0. Img NAA,0. Img2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、10mg 乙酉先丁香If，pH 为 5. 5,所述的抗性愈伤筛选培养基为每升MS培养基添加Img BA、0. Img NAA、0. Img2， 4-D、15 30mg潮霉素、500mg头孢霉素，pH为5. 8，所述的抗性芽再生培养基为每升MS培养基添加1. 5mg BA、0. Img NAA、0. 25mg Gibberellic Acid(GA3)、15 30mg 潮霉素、250mg 头孢霉素，pH 为 5· 8，所述的抗性芽伸长培养基为每升MS培养基添加0. 2mg BA、0. Olmg NAA, 15 30mg 潮霉素、250mg头孢霉素，pH 5. 8，所述的抗性芽生根培养基为每升MS培养基添加0. 2mg NAAU5 30mg潮霉素、 250mg头孢霉素，pH为5. 8。所述的含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌是通过以下方法构建的将 目的基因插入表达载体的启动子之后，将构建好的携带目的基因的表达载体导入根癌农杆 菌，经抗性筛选，获得含有携带目的基因表达载体的根癌农杆菌。所述的根癌农杆菌优选为根癌农杆菌EHA105。所述的抗性愈伤筛选培养基、抗性芽再生培养基、抗性芽伸长培养基和抗性芽生 根培养基中的潮霉素含量优选为每升培养基中含有20mg潮霉素，在该浓度的筛选压下，筛 选获得的抗性愈伤组织、抗性芽、抗性植株均是转基因材料。因此在进行天山雪莲转基因时 采用20mg Γ1潮霉素筛选压可以确保所获得的抗性植株是转基因植株，减少后期检测是否 是转基因植株的工作量。所述的表达载体的启动子优选为玉米的Ubiquitin启动子或烟草花椰菜花叶病 毒的CaMV35S启动子，两个启动子都能很好的启动目的基因在天山雪莲中表达。Ubiquitin 启动子属于已知的启动子，它是一个在单子叶植物中有较强表达的启动子，来自于玉米多 聚泛素蛋白基因(maize polyubiquitin gene)。CaMV35S启动子也属于已知的启动子，它 是双子叶植物中最常使用的组成型启动子，来源于烟草花椰菜花叶病毒。所述的a)步骤中将天山雪莲种子灭菌，优选的灭菌步骤为用75% (体积分数) 的酒精浸泡天山雪莲的种子30秒，然后将种子移至含有0.05% (体积分数)吐温80和5% (质量分数)的次氯酸钠的无菌水中浸泡30分钟，之后用无菌水冲洗5 6次，所述的b) 步骤中共培养后的外植体去除农杆菌的方法，其步骤为用含有0.05% (体积分数)吐温 80的无菌水冲洗共培养后的外植体5 6次。应用上述方法灭菌既能对天山雪莲种子进行 灭菌，又不破坏天山雪莲种子，保证天山雪莲种子在无污染的条件下萌发。所述的a)步骤中的待种子萌发后，将其移至光下培养是在24士 1°C、光照强度为 35 μ moln^s—1、光照时间为14小时/每天条件下培养，天山雪莲的幼苗在此条件下，生长健 康快速。所述的b)步骤中将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌， 其操作步骤优选为先将含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌悬浮在含有10mg/l乙
5酰丁香酮的MS培养基(pH5.2)中，常规培养至0D_ = 0.4 0.5，然后将外植体浸泡于该 根癌农杆菌菌液中，时间为20min。所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法可参考书籍(谭文澄、 戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京中国林业出版社，1991.)。本发明培养基的各个组份，如 benzyladenine (BA)、a—Naphthalene acetic acid(NAA)、2，4-Dichlorophenoxyacetic acid(2，4_D)、Gibberellic Acid(GA3)、潮霉素、 头孢霉素和乙酰丁香酮属于市售的已知产品。本发明建立的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，应用该方法 可以有目的性的导入外源基因改良天山雪莲的性状，从而获得具有优良性状的天山雪莲新 品种。天山雪莲的实生苗的叶片或者通过组织培养技术获得的再生芽的叶片、叶柄或者 根茎结合部都可以成为有效的转化受体。本发明通过组织培养技术获得的再生植株可长期 在实验室条件下无菌保存，且在需要使用的时候，可以通过组织培养技术进行增殖，因此外 植体来源不受限制，随时可以进行转基因的操作，同时，还省去了为供转基因所需，不断去 野外采集种子，而浪费宝贵天山雪莲种子资源。本发明的分子育种方法经多次重复试验，证明其转化频率可达15 18%，因转化 所用的外植体易大量获得，所以一次转化试验操作就可以获得所需的转基因株系。本发明每个转化的外植体均能产生丛生芽，丛生芽又能通过继代增殖，且大部分 能生根发育成正常的植株，因此应用本发明的分子育种方法在5个月内可以获得大量的转 基因植株，而且大部分的转基因植株能够成功的移栽到土壤中，保证了分子育种方法培育 的品种栽培成功，实现了天山雪莲新品种培育。本发明的转基因天山雪莲的分子育种方法克服了传统育种和栽培方法应用于天 山雪莲育种中的障碍，满足现时对天山雪莲这种珍贵中药优良株系培育筛选、生物学和药 学的学术研究的迫切需要，为天山雪莲种质资源的创新、研发和可持续发展提供了珍贵的 遗传材料。因此本发明在天山雪莲可持续发展中具有显著的生态、经济和社会效益。
图1是PCR检测转基因抗性愈伤和转基因抗性芽的电泳图，其中WT是未转化株， Tl和T2是转PCAMBIA1301质粒所得的抗性愈伤，T3和T4是转pCAMBIA1301质粒所得的抗 性芽，该检测用的是hpt基因的引物。图2是通过Southern blot检测转基因抗性愈伤和转基因抗性芽的电泳图，其中 WT是未转化株，Tl和T2是转PCAMBIA1301质粒所得的抗性愈伤，T3和T4是转pCAMBIA1301 质粒所得的抗性芽，该检测用的是hpt基因的探针，采用XhoI对DNA进行酶切。图3是构建好的P1390ubiHd3a质粒的T-DNA区域的结构图，其中35Spro为烟草 花椰菜花叶病毒的CaMV35S的启动子，Ubipro为玉米的ubiquitin启动子。图4是通过PCR检测转Hd3a的抗性愈伤(Tc)、抗性花(Tf)、抗性植株(Tp)、抗性 芽(Ts)和未转化株(WT)，其检测用的是Hd3a的引物。图5是通过RT-PCR检测转Hd3a的抗性愈伤(Tc)、抗性花(Tf)、抗性植株(Tp)和 未转化株(WT)，其检测用的是Hd3a的引物。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 (1)目的基因植物表达载体的构建选取质粒pCAMBIA1301(可以从生物试剂公司购买到)作为表达载体，该质粒中含 有烟草花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，在启动子后面是转β-葡糖醛酸酶基因(gus报 告基因)，该质粒中还含有潮霉素磷酸转移酶筛选基因hpt。(2)含有目的基因植物表达载体的工程菌种的制备通过冻融法将pCAMBIA1301质粒导入根癌农杆菌EHA105。具体方法如下取 1 μ gpCAMBIA1301质粒加到200 μ 1冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min，液氮中速 冻5min，37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，加入800 μ 1 YEP液体培养基中，28°C轻摇4 6hr。取50 200 μ 1菌液涂布于含有50mg Γ1卡那霉素和50mg Γ1利福平的选择培养基 YEP上，28°C倒置培养2天，挑选单菌落进行检测。然后将上述转化的根癌农杆菌EHA105接 种到含有50mg Γ1卡那霉素和50mg Γ1利福平的YEP液体培养基中，28 °C条件下培养24小 时，离心去菌液，将菌细胞悬浮在含有IOmg Γ1乙酰丁香酮的MS培养基(pH5. 2)中，常规培 养至0D600 = 0. 4 0. 5，备用。(3)用于转化的外植体的培养将从野外采集的天山雪莲种子用自来水冲洗干净，后用75% (体积分数)酒精浸 泡30秒，将种子移至含有0.05% (体积分数)吐温80和5% (质量分数)的次氯酸钠的无 菌水中浸泡30分钟进行灭菌处理，之后用无菌水冲洗5 6次，最后，将种子接种到不含激 素的1/2MS基本培养基中，置24士 1°C，黑暗下培养，当种子萌发后，将其移至光下培养，其 培养条件为24士 1°C、光照强度为35 μ mol πΓ2^、光照时间为14小时/每天条件下培养。切 取培养的天山雪莲的叶片切成0. 5X0. 5cm大小的小块，接种于芽诱导培养基(每升MS培 养基添力口 1. 5mg benzyladenine (ΒΑ)、0· Img a-Naphthalene acetic acid (NAA) ,pH 5.8)， 24士 1°C，光下培养。一个月后将丛生芽移至丛生芽伸长培养基(每升MS培养基添加0. 2mg ΒΑ,Ο. 0ImgNAA, ρΗ 5. 8)，24士 1°C，光下培养，一个月后，可以获得大量的再生芽。将天山雪 莲实生苗的叶片或来源于再生芽的叶片、叶柄或根茎结合部切成0. 5X0. 5cm大小的外植 体，供农杆菌浸染所用。(4)抗潮霉素植株的获得将外植体浸泡于上述备用的含有携带pCAMBIA1301质粒的根癌农杆菌菌液中，时 间为20分钟，取出外植体，置无菌纸上，吸干多余的菌液，然后将外植体移至共培养基中 (在每升MS培养基中添力卩 Img BA、0. Img ΝΜ、0· Img 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2, 4-D)、10mg乙酰丁香酮，pH为5. 5)，置24 士 1°C，黑暗下培养2至5天。然后用含有0.05% (体积分数)吐温80的无菌水冲洗共培养后的外植体5 6次，置外植体于超净工作台的无 菌纸上，吸干水，将外植体移至抗性愈伤筛选培养基(在每升MS培养基添加Img BA、0. Img NAA,0. Img 2，4-D、20mg潮霉素、500mg头孢霉素，ρΗ为5. 8)，置24士 1 °C，黑暗下培养18 天。将抗性愈伤移至抗性芽再生培养基中(在每升MS培养基中添加1. 5mg BA、0. Img NAA、 0. 25mg Gibberellic Acid(GA3)、20mg 潮霉素、250mg 头孢霉素，ρΗ 为 5. 8)，置 24士 1°C，光下培养，5周后可以观察到有抗性芽的再生(每3周更新培养基)，8周后切取抗性芽接种到 抗性芽伸长培养基中(在每升MS培养基中添加0. 2mg ΒΑ,Ο. Olmg NAA，20mg潮霉素、250mg 头孢霉素，PH 5. 8)，24士 1°C，光下培养，3周后切取伸长的抗性芽接种到抗性芽生根培养基 (在每升MS培养基中添加0. 2mg NAA、20mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5. 8)，24士 1°C， 光下培养，诱导生根。(5)转基因植株的分子检测由于pCAMBIA1301含有gus报告基因，可按Jefferson等(1987)的⑶S染色方法 进行染色检测gus基因的表达情况。取抗性愈伤、抗性芽和未转化株(未转入PCAMBIA1301 质粒)浸于X-Gluc染色液中，于37°C保温3 5小时，用70%乙醇脱色，观察蓝色着色 情况。经检测，分别来源于实生苗叶片、再生芽叶片、再生芽根茎结合部和再生芽叶柄的 转pCAMBIA1301质粒的抗性愈伤呈现蓝色，转pCAMBIA1301质粒的抗性芽为蓝色，而未转 PCAMBIA1301质粒的未转化株则没有呈现蓝色，说明通过以上方法，gus基因已成功地导入 了天山雪莲并在转化株中稳定表达。通过PCR方法，采用筛选基因hpt的特异性引物HFw(5’ -CGA TCT TAG CCA GAC GAG CGG GTT C-3’ )HRe(5， -GCT GGG GCG TCG GTT TCC ACT ATC GG-3，)，扩增条件为94 V条件下5min，94°C下30s、60 V条件下30s、72 °C条件下Imin、一共 30个循环，最后在72°C延伸IOmin。如图1所示，应用上述PCR方法均能从抗性愈伤(Tl和T2)、抗性芽(T3和T4)中 扩增到目的片段629bp，而未转pCAMBIA1301质粒的转化株中则扩增不到该片段。因为hpt的片段置于XhoI之间，采用XhoI对DNA进行酶切，如果是转化株则可以 酶切出1094bp大小的hpt特异性片段，进一步通过Southern杂交的方法，对以hpt为探针， 如图2所示，在抗性愈伤(Tl和T2)和抗性芽(T3和T4)中均能观察到在1094bp出有杂交 信号，而未转PCAMBIA1301质粒的未转化株没有信号，再次说明通过以上该方法，hpt基因 已成功地导入了天山雪莲的基因组。经实验发现，本实施例得到的抗性愈伤组织、抗性芽和抗性植株全部是已经转入 PCAMBIA1301质粒的转基因材料，这说明经20mg Γ1潮霉素筛选获得的抗性愈伤组织、抗性 芽、抗性植株均是转基因的材料。因此在进行天山雪莲转基因时采用20mg Γ1潮霉素筛选 压可以确保所获得的抗性植株是转基因株，减少后期检测转基因株的工作量。(6)转基因株的移栽将经过上述检测的已转入pCAMBIA1301质粒的生根的转化植株从培养基中取出， 洗尽培养基，置灭菌的蛭石中，用保鲜膜罩住，在保鲜膜上打些小孔，置17 士 1°C，光照培养 箱中培养下，大约有75%的植株可以存活。通过以上方法，5个月内可以获得大量的转基因 植株。按照上述方法获得转基因植株，其转化频率可达15 18%，在本实施例中的转化频 率为16%。实施例2 本实施例与实施例1基本相同，只是抗性愈伤筛选培养基、抗性芽再生培养基、抗 性芽伸长培养基和抗性芽生根培养基中的潮霉素含量为每升培养基中含有30mg潮霉素。 在该筛选压下，能获得转入PCAMBIA1301质粒的抗性愈伤、抗性芽或者抗性植株，但是量比较少。实施例3 本实施例与实施例1基本相同，只是抗性愈伤筛选培养基、抗性芽再生培养基、抗 性芽伸长培养基和抗性芽生根培养基中的潮霉素含量为每升培养基中含有15mg潮霉素。 在该筛选压下，抗性愈伤、抗性芽或者抗性植株不一定全部是已经转入PCAMBIA1301质粒 的，需要通过后续的分子检测才能确定是转入PCAMBIA1301质粒的转基因的材料，在该筛 选压下，只是后续的工作量比较大。实施例4 (1)目的基因植物表达载体的构建以来源于水稻的开花基因Hd3a为目的基因，该基因在水稻和拟南芥中超表达可 以显著地使转基因植株提早开花。我们通过以下方法构建了由ubiquitin启动子驱动的 Hd3a的植物表达载体。采用HindIII和BamHI从质粒pAHC27中切下Ubiquitin启动子， 将该片段插到质粒PCAMBIA1390的HindIII和BamHI位点处，构建质粒pl390Ubi。提取 水稻叶片mRNA，反转录为cDNA，根据水稻Hd3a (GeneBank登录号为0s06g0157700)的序 列设计引物 Hd3aFw :5，-AATGAATTC(EcoRI 位点)ATGGCCGGAAGTGGCAGGGAC-3 和 Hd3aRe 5，-AATGAATTC (EcoRI 位点)CTAGGGGTAGACCCTCCTG-3，，从 cDNA 中扩增 Hd3a 片段，将该片段 克隆至pGEM-T载体，经测序验证后再将该片段插到质粒pl390Ubi的EcoRI位点处，经酶切 和测序验证，即获得构建好的质粒P1390UbiHd3a，具体结构如图3所示。该质粒还含有筛选 标记基因hpt，可用于筛选转化的细胞。(2)含有目的基因植物表达载体的工程菌种的制备，该步骤与实施例1相同；(3)用于转化的外植体的培养，该步骤与实施例1相同；(4)抗潮霉素植株的获得；将外植体浸泡于步骤(2)获得的含有携带P1390UbiHd3a表达载体的根癌农杆 菌菌液中，时间为20分钟，取出外植体，置无菌纸吸干多余的菌液，然后将外植体移至共 培养基中(每升 MS 培养基添力口 Img BA、0. Img ΝΑΑ、0· Img 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) UOmg乙酰丁香酮，pH为5. 5)，置24士 1°C，黑暗下培养3天。然后用含有 0.05% (体积分数)吐温80的无菌水冲洗共培养后的外植体5 6次，置外植体于无菌纸 上，吸干水，将外植体移至抗性愈伤筛选培养基(每升MS培养基添加Img BA、0. Img NAA、 0. Img 2，4-D、20mg潮霉素、500mg头孢霉素，pH为5.8)，置24士11，黑暗下培养18天。将抗性愈伤移至抗性芽再生培养基(每升MS培养基添加1. 5mg BA、0. Img NAA、 0. 25mg Gibberellic Acid(GA3)、20mg 潮霉素、250mg 头孢霉素，pH 为 5. 8)中，24士 1°C，光 下培养，12天时就观察到抗性愈伤直接分化为花，8周后切取抗性芽接种到抗性芽伸长培 养基中(每升MS培养基添加0. 2mg BA、0.01mg NAA，20mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH 5.8)， 24士 1°C，光下培养，3周后切取伸长的抗性芽接种到抗性芽生根培养基(每升MS培养基中 添加0. 2mg NAA、20mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5. 8)，24士 1°C，光下培养，诱导生根。(5)转基因植株的分子检测采用Hd3a的特异性引物Hd3aFw 5' -ATGGCCGGAAGTGGCAGGGAC-3‘Hd3aRe :5’ -CTAGGGGTAGACCCTCCTG-3‘
PCR 条件94°C下 5min，94°C下 30s、55°C下 30s、72°C下 lmin、一共 30 个循环，最 后在72°C延伸IOmin0经PCR方法检测，如图4所示，均能从转Hd3a的抗性愈伤组织(Tc)、抗性花(Tf)、 抗性芽(Ts)和提早开花的花枝(Tp)的基因组中扩增到Hd3a的539bp特异性片段，而未转 化株中则扩增不到该片段。采用RT-PCR方法，如图5所示，从转Hd3a的抗性愈伤组织(Tc)、抗性花(Tf)和提 早开花的花枝(Tp)的cDNA中扩增到Hd3a的特异性片段539bp，而未转化株(WT)中则扩增 不到该片段，证明转Hd3a的抗性愈伤组织(Tc)、抗性花(Tf)和提早开花的花枝(Tp)中均 有Hd3a基因的表达，而未转化株(WT)则没有Hd3a的表达。以上结果说明应用本发明的技术方法成功地将Hd3a基因导入了天山雪莲基因组 并在转化株中稳定表达，从而改变了转基因植株的再生和开花特性；另外还说明Hd3a基因 可应用于快速地检测植物转基因体系的有效性及筛选鉴定转化体或突变体。(6)转基因株的移栽将经过分子检测的转入P1390UbiHd3a表达载体的生根的转化株从培养基中取 出，洗尽培养基，置灭菌的蛭石中，用保鲜膜罩住，在保鲜膜上打些小孔，置17士 1 °C，光照培 养箱中培养下，大约有75%的植株可以存活。通过以上方法，3个月内可以获得大量的转 Hd3a基因植株，转化频率为16%。由以上实施例可以说明来源于烟草花椰菜花叶病毒的CaMV35S和来源于玉米的 ubiquitin启动子均可用于指导目的基因在天山雪莲中的表达。
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权利要求
一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤a)外植体的培养该外植体为天山雪莲实生苗的叶片或者再生芽的叶片、叶柄或者根茎结合部；所述的再生芽是通过以下方法制备的将天山雪莲种子灭菌后，接种到不含激素的1/2MS基本培养基中，24±1C下，黑暗下培养，待种子萌发后，将其移至光下培养，切取培养的天山雪莲的叶片，接种于芽诱导培养基上，诱导出从生芽，然后将丛生芽转移至从生芽伸长培养基，光下培养获得再生芽；b)将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌菌液中，该表达载体含有潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为筛选基因，然后将外植体移至共培养基中共培养，24±1℃下，黑暗条件下培养，然后去除外植体上的根癌农杆菌，至抗性愈伤筛选培养基中，24±1℃下，黑暗条件下培养，再将抗性愈伤移至抗性芽再生培养基中，24±1℃下，光下培养，待长出抗性芽，将抗性芽接种到抗性芽伸长培养基中，光下培养，切取伸长的抗性芽接种到抗性芽生根培养基中，光下培养，诱导生根；c)转基因植株的分子检测利用表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目的基因的序列进行PCR分子检测法、Southern杂交方法或者RT PCR检测法，检测抗性愈伤或者抗性芽或者抗性植株是否已是转基因材料；d)转基因植株的移栽将检测含有目的基因的生根的转基因植株从培养基中取出，洗净，置于灭菌的蛭石中，17±1℃，光下培养，正常生长，得到转基因天山雪莲；所述的芽诱导培养基为每升MS培养基添加1.5mg benzyladenine(BA)、0.1mga Naphthalene acetic acid(NAA)，pH为5.8，所述的丛生芽伸长培养基为每升MS培养基添加0.2mg BA、0.01mg NAA，pH 5.8，所述的共培养基为每升MS培养基添加1mg BA、0.1mg NAA、0.1mg2，4 Dichlorophenoxyacetic acid(2，4 D)、10mg乙酰丁香酮，pH为5.5，所述的抗性愈伤筛选培养基为每升MS培养基添加1mg BA、0.1mg NAA、0.1mg2，4 D、15～30mg潮霉素、500mg头孢霉素，pH为5.8，所述的抗性芽再生培养基为每升MS培养基添加1.5mg BA、0.1mg NAA、0.25mg Gibberellic Acid(GA3)、15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5.8，所述的抗性芽伸长培养基为每升MS培养基添加0.2mg BA、0.01mg NAA，15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH 5.8，所述的抗性芽生根培养基为每升MS培养基添加0.2mg NAA、15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特 征在于，所述的含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌是通过以下方法构建的将目的基因插入表达载体启动子之后，通过冻融法将构建好的携带目的基因的表达载 体导入根癌农杆菌，经抗性筛选，获得含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌。
3.根据权利要求2所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其 特征在于，所述的表达载体的启动子为玉米的ubiquitin启动子或烟草花椰菜花叶病毒的 CaMV35S启动子。
4.根据权利要求1所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特征在于，所述的抗性愈伤筛选培养基、抗性芽再生培养基、抗性芽伸长培养基和抗性芽生根 培养基中的潮霉素含量优选为每升培养基中含有20mg潮霉素。
5.根据权利要求1所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特 征在于，所述的a)步骤中将天山雪莲种子灭菌，其步骤为将天山雪莲种子在体积分数为 75%的酒精浸泡30秒，然后将种子移至含有体积分数为0. 05%的吐温80和质量分数为 5%的次氯酸钠的无菌水中浸泡30分钟，之后用无菌水冲洗5 6次，所述的b)步骤中共 培养后的外植体去除根癌农杆菌的方法，其步骤为用含有体积分数为0. 05%的吐温80无 菌水冲洗共培养后的外植体5 6次，然后在超净台上吹干。
6.根据权利要求1所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特 征在于，所述的b)步骤中将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌中 的步骤是先将含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌悬浮在含有10mg/l乙酰丁香酮 的MS培养基(pH为5. 2)中，常规培养至OD6tltl = 0.4 0.5，然后将外植体浸泡于该根癌农 杆菌菌液中，时间为20min。
全文摘要
本发明提供一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法。该方法是将携带目的基因的表达载体转化农杆菌，将此农杆菌与通过植物组织培养技术培养的天山雪莲外植体共培养，使目的基因插入到外植体基因组中，经抗性素筛选，再通过分子检测方法对抗性愈伤或者抗性芽进行检测，含有目的基因的抗性株即为转化株，将此转化株通过芽增殖途径可以获得大量的转化株，转化株经栽培后，即可获得转基因天山雪莲新品种。本发明可在5个月内获得大量的转基因的天山雪莲新品种，满足现时对天山雪莲优良株系培育筛选、生物学和药学的学术研究的迫切需要，为天山雪莲种质资源创新提供珍贵的遗传材料，对天山雪莲可持续发展具有显著的生态、经济和社会效益。
文档编号C12N15/82GK101940159SQ201010215828
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者吴国江, 李美茹 申请人:中国科学院华南植物园