专利名称：天山雪莲抗寒基因SiCOR3708及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中基因克隆和生物体转化技术领域，具体的，本发明涉 及一种天山雪莲抗寒基因及其在植物抗寒中应用的技术领域。
背景技术：
温度是植物正常生长、生存的重要条件之一，同时也是限制植物形态和分布的重 要因素之一。低温伤害植物已成为全球公害。我国纬度跨度大，气候多样，寒害时有发生， 而且近年来看在非寒冷季节寒害已经成为我国重要自然灾害之一，并且有逐渐加剧趋势， 有可能成为农业生产中最大的自然灾害。目前，解决寒害基本途径有三条第一，采取更加 先进的栽培技术；第二，对已有植物品种，尤其是具有较高经济价值的植物品种进行改良， 然而传统改良方法费时、费力，并缺乏针对性；第三，随植物抗寒机制的研究，抗寒相关基因 的克隆以及转基因技术的发展，以相关受体植株的转基因植物的研究，使得基因工程培育 高效抗寒品种成为一种重要途径，因此，迫切需要开发抗寒的相关基因与蛋白。在1970年Weiser提出低温锻炼可能会引起基因表达改变的设想，之后通过大量 研究表明大多数植物在低温锻炼过程中均有冷调节物质的存在，目前已经从棉花、大麦、水 稻、冬葡萄、花椰菜、拟南芥、黑麦、沙冬青、胡萝卜、红景天等多种植物中发现冷调节基因。 而天山雪莲有着极强的生命力，耐寒能力很强，是天山上植物分布最高上线的惟一大型高 等植物，其有效积温的生理功能具有很高的利用性。如果将获得这种雪莲抗冻蛋白基因与 植物表达载体连接，再导入棉花、小麦、水稻、玉米等农作物中，可提高植物的抗寒性能，产 生巨大的经济效益，尤其是可挽回4月至5月“倒春寒”对农作物造成的经济损失，甚至可 使农作物提前早播或延长种植期，把对霜冻敏感的农作物改造成耐霜冻的农作物，并延长 农作物的生产期。因此，这一技术应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天山雪莲中克隆抗寒相关基因SiC0R3708及其制备方法。本发明所提供的SiC0R3708基因如序列表中序列1所示，由632个碱基组成，该基 因的编码框为自5’端28至585碱基；以及与序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性， 且编码具有相同功能蛋白质的DNA序列。序列1所述的DNA序列，是通过以下技术得到。将雪莲组培苗在4°C培养0.5小 时后，提取其mRNA，同时提取20°C生长的雪莲无菌苗的mRNA，采用抑制差减杂交技术，得到 雪莲低温诱导cDNA差减文库，对文库中的cDNA片断进行序列测定，得到雪莲SiC0R3708基 因。经Northern杂交试验发现该基因的表达受低温诱导，与雪莲抗寒性有密切关系。本发明的另一个目的在于提供雪莲SiC0R3708基因在植物抗寒中应用。具体的， 本发明将构建的SiC0R3708基因表达载体转入拟南芥中，可以显著提高植株的抗寒能力。以植物表达载体pCHF3为基础，将雪莲SiC0R3708基因克隆于Smal位点，
3SiC0R3708基因的表达受启动子CaMV 35S的调控，将其命名为pCHF3_SiC0R3708。将重组 载体pCHF3-SiC0R3708转入农杆菌GV3101后，以农杆菌“浸花法”导入模式植物拟南芥中， 通过卡那霉素抗性筛选得到转基因拟南芥纯系。提取转基因拟南芥和野生型拟南芥总DNA， 进行PCR扩增确定雪莲SiC0R3708基因已经整合在基因组中；提取转基因拟南芥和野生型 拟南芥总RNA，进行RT-PCR，确定雪莲SiC0R3708基因在转基因拟南芥中正确表达。将温室 中生长2周的转基因拟南芥和野生型拟南芥同时在_8°C处理6小时，之后继续在温室中生 长2周，统计冻后存活率，结果表明转基因拟南芥的存活率显著高于野生型拟南芥。通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果1、提供了一种天山雪莲抗寒相关基因SiC0R3708。2、将构建的SiC0R3708基因重组表达载体转入拟南芥中，可以显著提高植株的抗 寒能力。
图1所示为雪莲Si⑶R3708基因受低温诱导表达情况，图中第一排为雪莲组培苗 总RNA变性胶电泳，第二排为雪莲组培苗Northern杂交结果，其中1为生长于22°C雪莲苗， 2为雪莲苗在4°C下培养30min，3为雪莲苗在4°C下培养lh，4为雪莲苗在4°C下培养2h，5 为雪莲苗在4°C下培养3h。图2所示为pCHF3_SiC0R3708重组表达载体结构图。图3所示为转基因拟南芥PCR鉴定结果，图中1为标准DNA分子量，从上至下依次 为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2为野生型拟南芥，3_16为转基因拟南芥。图4所示为转基因拟南芥RT-PCR鉴定结果，图中1为标准DNA分子量，从上至下依 次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2为野生型拟南芥，3_16为转基因拟南芥。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的 说明中，如无特别说明，则％皆指质量百分比。实施例1 天山雪莲SiC0R3708基因的克隆将雪莲实生苗在4°C培养0. 5小时，采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总 RNA，利用 cDNA 抑制差减试剂盒(PCR-Select cDNA Subtraction kit，Clontech 公司)， 按其操作步骤，构建与天山雪莲抗寒有关的cDNA差减文库，从中挑选1800个cDNA，分别与 正向、反向差减cDNA进行杂交，从中挑选有正向杂交信号，而没有反向杂交信号的cDNA进 行核苷酸序列测定，得到雪莲SiC0R3708基因，序列见序列表1，基因全长为632bp，具有一 个完整的阅读框(28-588bp)以及5，非翻译区(l-27bp)和3，非翻译区(589_632bp)，阅 读框为28-588bp，5，非翻译区为l-27bp，3，非翻译区为589_632bp，该序列在NCBI中经 Blast比对，未发现同源序列。将雪莲组培苗分别在20°C、4°C下培养0.5小时后，用Trizol 试剂(Invitrogen公司)提取总RNA后，以同位素标记的雪莲SiC0R3708基因为探针进行 Northern杂交，结果表明SiC0R3708基因的表达受低温诱导，参见附图1。实施例2 :SiC0R3708基因组成型高效表达载体的构建表达载体pCHF3_Si⑶R3708的构建过程为首先以雪莲cDNA为模板，扩增得到 SiC0R3708基因全长cDNA，扩增引物如下，两端带有SmaI酶切位点
正向引物5，-CCCGGGATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-GGGCCCCTTACTCATATCCCGCCTCCA-3，反应条件为95°C，4min，l个循环；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 个循 环；72°C，lOmin，结束反应。将得到的扩增产物进行纯化后，进行Small酶切、纯化，同时对 载体pCHF3也进行Small酶切、脱磷反应并纯化，之后进行连接反应，对得到的重组载体首 先用限制性内切酶SpecI和SalI进行双酶切，挑选酶切片断中有400bp的重组载体，接着 进行PCR鉴定，所用引物序列如下正向引物5，-GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3，反向引物5，-ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3，反应条件如下95°C，4min，l个循环；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 个 循环；72°C，10min，结束反应。挑选扩增产物大小为400bp的重组质粒进行测序。经过上述 步骤最终得到高效表达SiC0R3708基因的植物表达载体pCHF3-SiC0R3708。载体包括CaMV 35s启动子、RBCS终止子、目的基因SiC0R3708基因、卡那霉素抗性基因NPTII、壮观霉素抗 性基因SpeC、半乳糖苷酶基因LacZ。详细载体结构参见附图2。实施例3 :pCHF3-SiC0R3708表达载体转化农杆菌接种农杆菌GV3101单菌落于50mlYEB培养基中，28°C、200rpm振荡培养至0D_ 为0. 4，冰浴30分钟，4000rpm离心10分钟，收集菌体并用IOml 0. 15M CaCl2悬浮。再次 离心收集菌体，悬浮于Iml 20mM CaCl2溶液中，取IOOul菌液装入无菌1. 5ml离心管中，加 入0. 5ug pCHF3-SiC0R3708质粒，轻轻混勻，冰浴30分钟，在液氮中迅速冷冻1分钟，37°C 融化后，加入Iml YEB培养液，280C、IOOrpm培养2小时，4000rpm离心30秒后弃上清，加入 lOOulYEB培养液，菌体充分悬浮后涂布于含有50ug/ml壮观霉素的YEB固体培养基上，28°C 培养至单菌落长出，碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定。实施例4 :PCHF3-SiC0R3708表达载体农杆菌介导法转化拟南芥在OD6tltl为0. 8的pCHF3-SiC0R3708表达载体农杆菌溶液中，加入蔗糖至终浓度为 5%，将拟南芥花在其中浸泡5秒钟后取出，继续培养至结种。收集单株种子，播种在含有 0.5%卡那霉素的MS培养基中，置温室中培养，挑选黄苗和绿苗数量比例为3 1的株系， 进行再一次播种筛选，直至在含有0. 5%卡那霉素的MS培养基中长出的幼苗均为绿苗，即 为转基因拟南芥纯合株系。实施例5转基因拟南芥检测PCR 检测采用CTAB法提取转基因拟南芥的总DNA，以此为模板，阳性对照为质粒 pCHF3-SiC0R3708,阴性对照为非转基因拟南芥总DNA，PCR扩增所用引物如下正向引物5，-ATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-CTCATATCCCGCCTCCACCA-3，扩增条件为94°C, 3 分钟，1 个循环；94°C, 30s, 53°C，30s, 72°C，lmin, 30 个循环； 72°C，10min，反应结束后在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳，得到大小为560bp的条带，见附图 3，初步证明该株系为转基因株系。RT-PCR 检测为了检测SiC0R3708基因在转基因植株中是否得到了表达，进一步利用RT-PCR
5法进行检测。用CTAB法提取样品总RNA，1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，使用RT-PCR试剂盒 (Takara公司)进行RT-PCR反应，扩增SiC0R3708基因所用引物为
正向引物 5 ‘ -GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3 ‘
反向引物 5 ‘ -ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3 ‘扩增条件为94 °C，3 分钟，1 个循环；94 V，30s, 54 V，30s, 72 V，Imin, 30 个循 环；72°C，10min，反应结束后在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳，大小为400bp的条带，则证明 SiC0R3708基因在拟南芥中得到了表达，参见附图4。实施例5 转基因拟南芥抗冻性能检测将转基因拟南芥纯合株系和野生型拟南芥同时置于_8°C冰箱中处理6小时后取 出，置于温室中培养，二周后统计植株存活率，结果显示转基因拟南芥的存活率为80%，显 著高于野生型的存活率(25% )，证明SiC0R3708基因的导入能提高拟南芥的抗寒性，且差 异显著。以上实验均设置三个重复，利用Spassll. 5对数据进行统计分析，采用One-way ANOVA处理以获得平均数与标准误差，并用t-test检测显著性差异(LSD)。
权利要求
一种天山雪莲中克隆抗寒相关基因SiCOR3708如SEQUENCE LISTING所示，其特征在于，该SiCOR3708基因由632个碱基组成，该基因的编码框为自5’端28至585碱基；一个完整的阅读框为28 588bp，5’非翻译区为1 27bp，3’非翻译区为589 632bp。
2.如权利要求1所述的天山雪莲中克隆抗寒相关基因SiC0R3708在植物抗寒中应用。
全文摘要
本发明公开了一种天山雪莲抗寒基因SiCOR3708及其在植物抗寒中的应用。通过将雪莲组培苗在4℃培养0.5小时后，提取其mRNA，同时提取20℃生长的雪莲无菌苗的mRNA，采用抑制差减杂交技术，得到雪莲低温诱导cDNA差减文库，对文库中的cDNA片断进行序列测定，得到雪莲SiCOR3708基因。该雪莲SiCOR3708基因由632个碱基组成，该基因的编码框为自5’端28至585碱基，将构建的SiCOR3708基因表达载体转入拟南芥中，可以显著提高植株的抗寒能力。将获得这种雪莲抗冻蛋白基因与植物表达载体连接，再导入棉花、小麦、水稻、玉米等农作物中，可提高植物的抗寒性能，具有广泛的应用领域。
文档编号A01H5/00GK101899448SQ20101016669
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者徐虹, 李晨华, 欧阳平凯, 王博, 王志方, 艾秀莲 申请人:南京工业大学;新疆农业科学院微生物应用研究所;中国科学院新疆生态与地理研究所