专利名称：大肠杆菌bl21核糖体蛋白亚基l36在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌BL21核糖体蛋白亚基L36在制备抗癌药物中的应用，属于生物医药技术领域
背景技术：
大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻。BL21是常用的大肠杆菌表达菌株，适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失，一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达。BL21 (DE3)，在BL21的基础上整合了 17噬菌体基因组的大肠杆菌，包含lac UVS启动子基因和17聚合酶基因。适合于17表达系统。IaeUVS启动子直接调控I7RNA聚合酶的转录，IacUVS启动子可经IPTG诱导。IPTG是一种半乳糖的结构类似物，具有较强的化学诱导能力，可诱导位于乳糖操纵子控制区下游的基因表达，其诱导表达的机制为通过使结合在乳糖操纵子上的阻遏蛋白失活，解除阻遏蛋白对Lac启动子的抑制，从而启动下游基因的转录。将重组表达质粒转化入BL21(DE3)，在IPTG的诱导下，可诱导表达I7RNA聚合酶，重组表达质粒上的I7RNA聚合酶启动子识别I7RNA聚合酶，从而表达出亚克隆到重组表达质粒上的目的基因的蛋白。大肠杆菌的核糖体小亚基中约有22种蛋白质(编号为SI至S22)，其核糖体大亚基中约有34种蛋白质(编号为LI至L36)。这些蛋白质是免疫学上独立的蛋白质，只有L7与L12之间表现出相互交叉反应。这些核糖体蛋白质中除S6、L7及L12(等电点约为5)之外全部都是碱性蛋白质(等电点约为10)。此外，除了以下列出的三组例外，其余的核糖体蛋白质都是相互有差异的*S20与L26被证实是同一种蛋白质,它是唯种同时出现在大、小亚基中的蛋白质。*L7与L12分别是同一种蛋白质的N端乙酰化版本及肽链内部甲基化版本。*L8是L7(或L12)与LlO的复合物。除分子量为61. 2kD的SI外，其余的核糖体蛋白质的分子量都相对集中地分布于4. 3kD至29. 7kD之间。大肠杆菌核糖体蛋白L36位于核糖体50S大亚基上，由rpmj基因编码，其中文名称为50S核糖体蛋白亚基L36，简写RPL36，别名有B3299，SecX, Rpmj, 50S核糖体亚基蛋白B，该蛋白含有38个氨基酸，分子量为4. 364kD。目前，对大肠杆菌BL21菌株的核糖体蛋白亚基L36的抗癌活性研究及其应用尚未见任何报道。
发明内容
本发明对大肠杆菌BL21菌株的核糖体蛋白亚基L36的抗癌活性进行研究，提供了一种大肠杆菌BL21核糖体蛋白亚基L36在制备抗癌药物中的应用。大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对H印-2细胞的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。发现在低浓度下的效果优于高浓度下的效果，其中浓度为0. 67,0.5ug/ml时大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对Hep-2细胞的生长抑制率最好。
图I为大肠杆菌核糖体 蛋白亚基L36对Hep-2细胞生长的影响；(其中1_9分别为0，20，10，5，2. 5，I. 25，1，0. 67，0. 5 ii g/ml大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36浓度)；图2为不同浓度大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对H印-2细胞的形态影响；(图a至图 i :分别为 Oii g/ml, 20 u g/ml, 10 u g/ml, 5 u g/ml, 2. 5 u g/ml, I. 25 u g/ml, I u g/ml,
0.67 u g/ml,0. 5 u g/ml大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36浓度)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I :大肠杆菌BL21菌株的RPL36蛋白的获得从Genbank数据库中检索到大肠杆菌Escherichia coli K_12substr.菌株RPL36基因序列,根据其序列信息,利用Primer Premier5. 0软件进行引物设计,大肠杆菌BL21菌株RPL36基因引物的上游引物RPL36-F :5' -ATGAAAGTTC GTGCTTCC-3'，下游引物RPL36-R. 5' -TCAGCCTTGG CGCTGTTTAT-3'。以大肠杆菌BL21菌株总DNA为模板，以RPL36-F，RPL36-R为引物进行PCR扩增。采用 50 u I PCR 反应体系=MgCl2 (2. 5mM) 3u I, dNTPs (2. 5mM) 4u 1,10XPCR Buffer5 u I，rTaq DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 25 u 1，菌液 1，引物 RPL36_F、RPL36_R 各 I y I，用灭菌双蒸水补充终体积至50 ill。反应条件94°C预变性4分钟，94°C变性I分钟，46°C退火30秒，72°C延伸30秒，30个循环。72°C 10分钟，4°C保存。I. 0%琼脂糖凝胶检测PCR产物，用GELDoc EQ全自动凝胶成像分析系统记录结果。按照E. Z.N. A* Gel Extraction Kit说明书，对PCR产物进行回收纯化，采用CaCl2法，以大肠杆菌BL21制备感受态细胞，将连接有PCR产物的PUC18-T载体转化进感受态细胞，再于含氨苄青霉素的平板上生长过夜，筛选转化子，利用碱裂解法小量提取阳性单克隆的质粒，以质粒DNA为模板，采用通用引物M13进行PCR扩增，检测克隆结果。选取3个经鉴定的阳性重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，结果显示大肠杆菌BL21的RPL36基因与大肠杆菌Escherichia coli K_12substr.菌株RPL36基因的序列完全一致，由 117bp 组成(大肠杆菌 BL21 的 RPL36 基因序列ATGAAAGITC GTGCTTCCGTCAAGAAATTATGCCGTAACT GCAAAATCGT TAAGCGTGAT GGTGTCATCC GTGTGATTTG CAGTGCCGAGCCGAAGCATAAACAGCGCCA AGGCTGA)，所编码的蛋白也完全一致，即由38个氨基酸残基组成(大肠杆菌BL21 的 RPL36 蛋白亚基序列MKVRASVKKL CRNCKIVKRD GVIRVICSAEPKHKQRQG)。因为大肠杆菌BL21的RPL36蛋白仅由38个氨基酸组成，所以可以采用化学合成的办法获得了大肠杆菌BL21的RPL36蛋白亚基。实施例2 :大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36的抗癌功能实验大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对人喉癌细胞抑制的细胞学实验
2. I材料与方法2. I. I 材料2. I. I. I细胞株人喉癌Ifep-2细胞(购于川北医学院生化与分子免疫研究所)。2. I. I. 2试剂RPMI1640粉末(购于Gibco公司，美国)，胎牛血清(购于四季青生物制品公司，中国)，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司) 2. I. 2 方法2. I. 2. I 细胞培养人喉癌Hep-2细胞株用含有10 %的灭活的胎牛血清(fetalbovine serum,FBS) 100U/ml 青霉素、100 u g/ml 链霉素、pH7. 4 的 RPMI-1640 完全培养液于 37°C、5% CO2 培养箱中进行培养。2. I. 2. 2MTT法检测细胞活性取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后将细胞数调整到I X IO5个/mL，接种于96孔板，每孔细胞液量为200 u L，放入CO2培养箱内，于37°C ,5% CO2及饱和湿度的条件下孵育至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，然后加入大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36使其终浓度分别为250、500、1000、2000、4000 ii g/mL.设6个重复孔，空白组为不含细胞的RPMI1640培养液，放入CO2培养箱内培养24h后取出96孔板，加入MTT (5mg/mL)溶液10 u L，继续培养4h后，然后加入150 ii L的二甲基亚砜(DMSO)振荡lOmin，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶标仪在在490nm的波长下测定各孔的吸光度(OD)值，计算不同浓度下大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36(本实施例采用直接加入培养的生长良好的癌细胞中观察结果，临床中，蛋白质或者多肽类的生物药物多采用注射剂的剂型，肌注或者静脉滴注)作用Hep-G2细胞的抑制率(％ )，公式如下细胞生长抑制率=(I-AmAwa) X 100% 2. I. 2. 3形态学观察将96孔板放在倒置显微镜下观察，拍照记录不同浓度下细胞的形态变化。2. 2 结果2. 2. I大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对Ifep-2细胞生长的影响本研究采用MTT法检测不同浓度大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36在24h下对H印_2细胞生长活性的影响。从图I可以看出，大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对H印-2细胞的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。发现在低浓度下的效果优于高浓度下的效果，其中浓度为0. 67,0. 5 u g/ml时大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对H印-2细胞的生长抑制率最好(见图I)。2. 2. 2大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对Ifep-2细胞形态的影响用倒置显微镜观察不同浓度大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36(0，20，10，5，2. 5,1. 25，1,0. 67,0. 5 u g/ml)处理不同时间24h的Ifep-2细胞形态变化(图2)。从图2可以看到，在24h的处理时间下，与对照组相比，随着大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36浓度的变化，细胞出现变圆，成团，脱落甚至裂解成碎片的现象(参见图2)应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.大肠杆菌BL21核糖体蛋白亚基L36在制备抗癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了大肠杆菌BL21核糖体蛋白亚基L36在制备抗癌药物中的应用。大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对Hep-2细胞的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。发现在低浓度下的效果优于高浓度下的效果，其中浓度为0.67，0.5μg/ml时大肠杆菌核糖体蛋白亚基L36对Hep-2细胞的生长抑制率最好。
文档编号A61K38/16GK102614495SQ20111031391
公开日2012年8月1日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者伍春莲, 侯万儒, 侯怡铃, 孙冰, 李俊, 苏秀兰 申请人:西华师范大学