专利名称：人聚角微丝蛋白基因原核表达系统及其表达蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及人聚角微丝蛋白基因，即Filaggrin基因(含 瓜氨酸肽编码序列)原核表达系统构建及其表达蛋白的应用。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾 病，由于早期临床表现不典型，极容易被忽视。因缺乏高效、特异的早期诊断技术和方法，以 致错过最佳治疗时机，预后较差，严重影响生活质量。RA特异性自身抗体中有一类重要的抗体，包括抗核周因子抗体(APF)、抗角蛋白 抗体(AKA)、抗丝集蛋白(filaggrin)抗体及抗瓜氨酸抗体(抗CCP抗体)。由于这几种自 身抗体具有共同抗原决定簇环瓜氨酸肽，而瓜氨酸是上述抗体识别filaggrin表位的组成 成分，而被称之为抗filaggrin相关抗体。这类抗体的敏感性> 97%，特异性50 91 %，其 敏感性和特异性均较其他指标高(RF、抗Sa蛋白抗体、抗BiP/p68抗体和抗GPI抗体等)。 研究显示抗filaggrin相关抗体在RA早期即出现，是反映早期RA的重要指标。但由于APF 和AKA的抗原的特殊性(人颊黏膜上皮细胞和大鼠食道中段角质层)以及检测手段不易标 准化，使它们的常规化有一定难度。目前，国内部分实验室有使用filaggrin单抗用于RA 早期诊断，但因成本较高，未能广泛应用。关于fiaggrin蛋白来源主要有以下三方面一是从组织、细胞中直接抽提、纯化 获得filaggrin蛋白，由于该方法受组织、细胞来源的局限，目前仅用于研究。二是通过人 工体外合成filaggrin蛋白CCP，但因人工合成的CCP造价比较昂贵且技术要求较高，同时 此种肽与体内filaggrin蛋白空间结构存在的必然差异，限制了以CCP为抗原的AFA试剂 盒的研制。三是采用基因工程技术构建filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的蛋白表 达系统，从而诱导filaggrin蛋白表达、纯化获得目的蛋白。此种方法较前两种方法复杂， 目前国内外尚未见相关报道，但有其不可逾越的优点通过原核表达载体表达filaggrin， 蛋白经复性后，形成具有生物活性的空间结构，与体内AFA上的结合位点基本一致，为试剂 盒的批量生产提供足够的、高纯度且低成本的包被抗原，从而弥补了人工合成方法带来的 不足。
发明内容
本发明涉及人filaggrin基因原核表达系统构建，以及纯化蛋白的应用开发，具 体包括人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的PCR钓取、原核表达载体的构建、工程 菌株的建立、目的蛋白分离纯化，以及ELISA检测试剂盒的研制。根据人filaggrin基因序列，本发明构建了含瓜氨酸肽序列 pET28a(+)-filaggrin原核表达质粒，并诱导其在Rosetta-gami (DE3)菌株中表达。分离纯 化蛋白，Western Blot鉴定。将纯化蛋白定量，包被酶标反应板，经牛血清白蛋白封闭，洗涤，用于检测样本血清，测定血清抗体效价。人聚角微丝蛋白重组基因，其特征在于该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1。所述的人聚角微丝蛋白重组基因的表达蛋白。含有人聚角微丝蛋白重组基因的表达载体。含有人聚角微丝蛋白重组基因的宿主菌。含有所述表达蛋白的检测试剂盒，包括用所述表达蛋白溶液包被的酶标反应板、 PBS稀释液、羊抗人IgG-HRP溶液、TMB-H202底物工作液、阳性对照、阴性对照。本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)，其特征在于编码Filaggrin蛋白的核苷酸 序列是 SEQ ID NO :1ο所述的人Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的表达蛋白属于本发明保护范围。所述的pET28a(+)_fiIaggrin重组质粒所用的表达载体及工程菌株应用也属于 本发明保护范围，表达载体是包含该基因的pET28a(+)-filaggrin重组质粒，工程菌株为 Rosetta-gami (DE3)菌株。所述的重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)在临床检测试剂开发及应用也属于 本发明的保护范围。本发明的详细描述1、PCR 扩增人 Filaggrin 基因以人淋巴细胞提取出的DNA为模板，PCR特异性扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳 鉴定及扩增产物割胶回收纯化。2、人Filaggrin基因原核表达质粒的构建与鉴定目的片段经酶切，连接至经同样酶切的pET_28a(+)原核表达载体，挑选阳性克隆 进行酶切鉴定，并作测序验证。3、原核表达及纯化将重组质粒pET28a(+)-filaggrin转化入表达菌株DE3，IPTG诱导表达，过柱纯 化，经SDS-PAGE和Western blot鉴定后，经Bradford蛋白浓度定量后，-70°C保存。4、ELISA检测抗fi Iaggrin抗体(AFA)的方法学建立及评价纯化蛋白经定量稀释后，包被酶标反应板，洗涤、封闭，作血清标本AFA测定。本发明提供了包含人Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)重组体的构建、含 该基因的表达型重组体的工程菌建立及诱导表达的方法，为重组人Filaggrin蛋白(含瓜 氨酸肽)的大规模制备、纯化，以及试剂盒的研发提供了技术路线。本发明采用基因工程技术获得人filaggrin重组蛋白，并以纯化蛋白为包被抗 原，研制RA特异性早期诊断试剂盒。通过联合多中心采样，检测RA初诊患者、确诊患者、随 访患者及骨关节炎、正常体检人群等血清中AFA效价，分析该试剂盒的诊断特异性及灵敏 度，建立一套较为完善的RA新型ELISA检测试剂盒，并予以推广应用，以提高RA早期诊断 水平，促进治疗，改善患者预后。
图1是pET_28a(+)-filaggrin重组质粒限制性酶切分析图。
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图2是SDS-PAGE分析fiIaggrin蛋白表达情况图。图 3 是 SDS-PAGE 和 WB 检测 fiIaggrin 蛋白图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的技术路线做进一步的阐述，但不仅仅局限于所述的实施 例实施例1 编码重组人Filaggrin蛋白的基因获得(1)人 Filaggrin 基因的获得健康体检者静脉血5mL，EDTA-Na2抗凝，灭菌蒸馏水低渗破红细胞，PBS洗涤，酚/ 氯仿法抽提基因组DNA。根据GenBank 人 filaggrin 基因全长 cDNA 序列(NM_002016)，通过 DNAstar 软件 分析其潜在的优势抗原表位，使用Primer Premier 5. 0软件在主要抗原表位编码区的两侧 设计 1 对引物。上游引物为 5 ‘ -CCGGAATTCCACGGACAGACTGCACCCAGCACT-3 ‘(划线为 EcoR I 限制性酶切位点)；下游引物为5' -CCGCTCGAGGTGCCTGG-AGCCGTCTCCTGATT-3'(划线 为Xho I限制性酶切位点)，其扩增片段含瓜氨酸编码序列。以上述人基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段。PCR反应体系50 μ 1，含DNA模 板 1. 5μ 1，引物各 25pmol，10mmol/L dNTP 1 μ 1，DNA 聚合酶 3U。PCR 扩增条件为95°C预 变性 5min ；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C lmin，共 30 个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR 扩增产物以 1. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并割胶纯化回收得到324bp左右的DNA片断。人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的DNA序列为5 ‘ -CCGGAATTC ca cggacagact gcacccagca ctggaggaag acaaggatcc4441 cgccatgagc aggcacgaaa cagctctagg cactcagcat cccaagacgg tcaggacacc4501 attcgtggac acccggggtc aagcagagga ggaaggcagg gatcctacca cgagcaatca4561 gtagataggt ctggacactc agggtaccat cacagccaca ccacacccca gggaaggtct4621 gatgcctccc atgggcagtc aggacccaga agtgcaagca ggcaaacaag aaatgaggaa4681 caatcaggag acggctccag gcac CTCGAGCGG-3‘重组人fiaggrin基因编码的氨基酸序列为HGQTAPSTGGRQGSRHEQARNSSRHSASQDGQDTIRGHPGSSRGGRQGSYHEQSVDRSGHSGYHHSHTT PQGRSDASHGQSGPRSASRQTRNEEQS⑶GSRH实施例2 :PET28a(+)-filaggrin原核表达质粒的构建及蛋白表达(1)原核表达质粒的构建及鉴定PCR扩增出的目的片段及pET_28a (+)经EcoRI和Xho I双酶切后，分别纯化回收 后，经T4DNA连接酶16°C水浴连接过夜，转化到E.coli DH5 α中，涂布到卡那霉素抗性的 LB培养板上，37°C培养12 16h，挑选单克隆进行菌落PCR及质粒双酶切鉴定，挑选2个阳 性克隆进行测序，鉴定目的片段的序列及编码框是否正确。(2)蛋白原核表达、纯化及鉴定将重组质粒pET28a(+)-filaggrin 转化入表达菌株 Rosetta-gami (DE3)。挑取 单克隆于LB培养基(含卡那霉素100 μ 1/ml)中培养过夜。然后以1 10的比例转接 到3ml培养基中，37°C培养至A值约为0. 6 0. 8 (约2h)，加入终浓度为0. 4mmol/L的IPTG在30°C诱导5h，取100 μ 1菌液离心，加30 μ 1 IX上样缓冲液悬浮沉淀，煮沸5min后 12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后脱色。以上述方法在IOOOml培养基中大量诱导含 His-filaggrin融合蛋白的表达。离心收集细菌经超声波破碎后收集上清液，过0. 45μπι滤 膜后，使用M离子柱纯化。样品过柱后依次使用洗涤缓冲液(PH 7.9)洗脱过柱。然后使 用500mmol/L的咪唑缓冲液过柱，将目的蛋白洗脱下来，取样进行SDS-PAGE和WB分析。纯 化的蛋白通过超滤管去除咪唑并浓缩，经Bradford蛋白浓度定量后，-70°C保存。洗脱后收集的重组蛋白按常规进行SDS-PAGE并转移至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶 粉的PBS 4°C封闭过夜后，加入鼠抗filaggrin单克隆抗体(1 1000稀释)，室温下反应 2h ；再加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1 2000稀释)，室温下反应lh，最后用DAB显色 试剂显色。实施例3 基于重组fiIaggrin纯化蛋白ELISA检测试剂盒的研制用包被稀释液将纯化的重组蛋白溶解稀释至1 μ g/ml，包被酶标反应板，4°C过夜。 TPBS洗涤4次，加3%牛血清白蛋白封闭，37°C孵育30min。洗涤后分别加1 100PBS稀释 的待测标本血清100 μ 1，37°C孵育2h，洗涤4次。力卩1 10000羊抗人IgG-HRP 100 μ 1， 37°C孵育lh，洗板5次，每孔加ΤΜΒ/Η202底物工作液100 μ 1，置37°C温箱lOmin。终止反应 后置酶标仪450nm处读取A值，健康对照组χ士3S作为临界值。表 1 表1是各组AFA检测结果，其中RA组AFA的A值均值分别与SLE组、OA组、健康 对照组比较，t值分别为12. 004、14. 464、18. 078，P均< 0. 01表 2 表2是AFA检测对RA的诊断价值，其中RA组AFA阳性率与非RA组比较，差异有 统计学意义(x 2 = 67.088，P<0.01)。AFA对RA诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴 性预测值分别为48. 2%、96. 9%、93. 2%和67. 9%，非RA组包括SLE和OA患者及健康体检者表3
表3是AFA与抗CCP抗体在RA诊断中的相关性，其中AFA与抗CCP抗体检测结果 呈相关性(r = 0. 42，P < 0. 05)。两者经平行效度检验，提示AFA与抗CCP抗体检测结果 具有一致性，kappa = 0. 41，说明两种方法一致性较好。
权利要求
人聚角微丝蛋白重组基因，其特征在于该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.权利要求1所述的人聚角微丝蛋白重组基因的表达蛋白。
3.含有权利要求1所述人聚角微丝蛋白重组基因的表达载体。
4.含有权利要求1所述人聚角微丝蛋白重组基因的宿主菌。
5.含有权利要求2所述表达蛋白的检测试剂盒，包括用权利要求2所述表达蛋白溶液 包被的酶标反应板、PBS稀释液、羊抗人IgG-HRP溶液、TMB-H2O2底物工作液、阳性对照、阴 性对照。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及人聚角微丝蛋白基因，即Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)原核表达系统构建及其表达蛋白的应用。本发明涉及人filaggrin基因原核表达系统构建，以及纯化蛋白的应用开发，具体包括人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的PCR钓取、原核表达载体的构建、工程菌株的建立、目的蛋白分离纯化，以及ELISA检测试剂盒的研制。
文档编号C12N15/70GK101906420SQ20101010524
公开日2010年12月8日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者徐巍, 朱敏, 沈波 申请人:浙江省台州医院