专利名称:一种利用黑曲霉生产羧肽酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产羧肽酶的新方法，属于生物工程技术领域：
。具体而言是指使用黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I菌株固态发酵生产羧肽酶的新技术。
背景技术：
羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦味的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限， 价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌 (Aspergillus、Penicillium)中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。
曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其发明专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima 等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为0. 36U/ml滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶0，酶活为463. Omkat/kg。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。
羧肽酶属于次级代谢产物，霉菌的次级代谢产物通常是在霉菌进行分化时形成的，液态培养抑制真菌分化，所以真菌固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高。羧肽酶的产生量受碳源氮源及无机离子影响，通过改变发酵过程中的培养基组分可逐步提高产酶量。本专利中利用黑曲霉LW-I菌株固态发酵生产羧肽酶为丝氨酸羧肽酶，可用作氨基酸测序，食品工业的脱苦剂等，其固态发酵产量最高可达阳84. 2U/g麸皮。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。本发明利用黑曲霉固态发酵生产羧肽酶的酶活性高于国内水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和豆饼粉等农副产品为发酵基料，利用黑曲霉LW-I固态发酵生产羧肽酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下
固态发酵实验室小试生产羧肽酶
1、菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I,由江南大学筛选和保藏。该菌种已经于2008年在《农业生物技术学报》杂志的Vol. 16 No. 2 Pg. 346公开。
2、斜面种子培养去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH;121°C灭菌20min，放置斜面；冷却后接种LW-I菌株，30°C培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等。每3个月转接1次。
3、麸曲种子的制备250mL三角瓶中装IOg基料(即麸皮IOg)，(NH4)2SO4 0. Ig,自来水12mL，自然pH，充分混勻。121°C灭菌40min，冷却后接种LW-I试管斜面种子，30°C培养 96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
4、固态发酵250mL三角瓶中装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉1 2g，玉米粉 0 Ig)，(NH4)2SO4 50 IOOmg, MgSO4 5 IOmg, CaCl2 5 IOmg, KH2PO4 30 50mg,自来水12 15mL，自然pH。121°C灭菌40min，冷却后接种黑曲霉LW-I斜面种子，30°C培养 84 96h，期间分别于20 24h和44 48h各翻曲一次。
5、粗酶液提取固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入10mL50mM柠檬酸钠缓冲液(PH5. 0)，碾磨lOmin，静止一定时间后后过滤，离心、4000rpm、IOmin)后得到的上清液即为粗酶液。测定时经缓冲液稀释适当倍数。
6、分析方法
酪氨酸标准曲线的制作
分别取2mmol/L的标准酪氨酸溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. OmL于试管中，用水补足至2mL。再加入ImL茚三酮显色液，充分混勻后，盖住试管口，在100°C水浴中加热20min， 用自来水冷却。放置5min后，用分光光度计测定波长为570nm处的吸光值(0D570nm)。以 0D570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
茚三酮法测羧肽酶酶活
将0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温 20min，调pH 6. 0终止反应。从酶底物反应液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸馏水，得到 LOmL的稀释后样品，按照标准曲线方法测定。产物浓度通过标准曲线计算。IU定义为每分钟产生Iyg酪氨酸的酶量。
本发明的有益效果本发明的突出优点是采用廉价的麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为发酵主原料，是一种充分利用自然界可再生资源的生产方式。同时，本发明所采用的菌株黑曲霉(Aspergillus niger)是公认安全(GRAS)的微生物，因此利用黑曲霉发酵生产酶制剂具有安全、可靠和不产生毒素等优点；利用黑曲霉LW-I菌株固态发酵法生产羧肽酶，符合生态系统中的自然法则，是一种绿色环保且可持续的生产方式，且具有设备简单、 投资少、生产成本低等优势。本发明利用黑曲霉LW-I菌株，采用固态发酵生产羧肽酶，实验室小试产羧肽酶活性可达5584. 2U/g麸皮。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述内容的范围仅局限于下述实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
4[0020]1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶中装IOg发酵基料(即麸皮IOg)，(NH4)2SO4 50mg, MgSO4 5mg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自来水 13mL,自然 pH。
3.固态发酵条件121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30°C静置培养96h，期间分别于24h和4 各翻曲一次。
4.粗酶液提取
固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入10mL50mM柠檬酸钠缓冲液 (ρΗ5· 0)，碾磨lOmin，静止30min后过滤，离心(4°C>4000rpmU0min)后得到的上清液即为
粗酶液。
5.茚三酮反应
将0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温 20min，调pH 6. O终止反应。从酶底物反应液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸馏水，得到 1. OmL的稀释后样品，按照标准曲线方法测定。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，成熟固态发酵曲料的羧肽酶平均酶活性达到3194. 4U/g麸曲。
实施例2
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶中装IOg发酵基料(即麸皮8g，豆饼粉lg，菜籽饼粉 Ig)，(NH4)2SO4 75mg，MgSO4 7. 5mg，CaCl2 10mg，KH2PO4 40mg，自来水 13mL，自然 pH。
3.固态发酵条件121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳LW-I麸曲种子，30°C静置培养96h，期间分别于24h和4 各翻曲一次。
4.粗酶液提取
固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入10mL50mM柠檬酸钠缓冲液 (ρΗ5· 0)，碾磨lOmin，静止30min后过滤，离心(4°C>4000rpmU0min)后得到的上清液即为
粗酶液。
5.茚三酮反应
将0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(ρΗ3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温 20min，调pH 6. O终止反应。从酶底物反应液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸馏水，得到 1. OmL的稀释后样品，按照标准曲线方法测定。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，成熟固态发酵曲料的羧肽酶平均酶活性达到3868. 9U/g麸曲。
实施例3
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶中装IOg发酵基料(即麸皮8g，豆饼粉lg，菜籽饼粉 Ig)，(NH4)2SO4 75mg，MgSO4 7. 5mg，CaCl2 10mg，KH2PO4 40mg，自来水 13mL，自然 pH。
3.固态发酵条件121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30°C静置培养96h，期间分别于24h和4 各翻曲一次。[0041]4.粗酶液提取
固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入10mL50mM柠檬酸钠缓冲液 (pH5. 0)，碾磨lOmin，静止Mi后过滤，离心、4000rpm、IOmin)后得到的上清液即为粗酶液。
5.茚三酮反应
将0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(ρΗ3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温 20min，调pH 6. O终止反应。从酶底物反应液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸馏水，得到 1. OmL的稀释后样品，按照标准曲线方法测定。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，成熟固态发酵曲料的羧肽酶平均酶活性达到5584. 2U/g麸曲。
权利要求
1.一种小试生产羧肽酶的新方法，其特征在于以麸皮、豆饼粉和玉米粉为固态发酵培养基的基料，并添加适量的无机氮源、无机盐和自来水，在250mL三角瓶中，利用黑曲霉 (Aspergillus niger)Lff-l菌株固态发酵生产羧肽酶。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的菌种是黑曲霉LW-I。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的发酵工艺是固态发酵。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的固态发酵培养基配方为250mL三角瓶中装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉1 2g，玉米粉0 lg)，(NH4)2SO4 50 lOOmg， MgS045 10mg，CaCl2 5 10mg，KH2PO4 30 50mg，自来水 12 15mL，自然 pH。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的固态发酵条件为发酵培养基121°C 灭菌40min，冷却后接种一菌耳LW-I麸曲种子，30°C培养84 96h，期间分别于20 24h 和44 48h各翻曲一次。
专利摘要
一种利用黑曲霉生产羧肽酶的方法，属于生物工程技术领域：
。本发明采用麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为发酵基料，通过适当改变培养基中碳源和氮源的比例，优化酶液提取时间，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株固态发酵生产羧肽酶。本发明提供了实验室小试生产的固态发酵培养基配方和培养条件，成熟发酵曲料的羧肽酶活性达到3194.4U/g～5584.2U/g。本发明具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低廉、对环境友好以及羧肽酶活性较高等特点，有利于羧肽酶的开发和利用，具有较高的经济和实用价值。
文档编号C12N9/48GKCN102154251SQ201010602818
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月24日
发明者吴静, 唐存多, 李剑芳, 邬敏辰, 闵柔, 陈伟 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan