专利名称：重组人硫氧还蛋白的制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组人硫氧还蛋白的制备方法，具体涉及从原核表达重组人硫氧还蛋白，重组人硫氧还蛋白的纯化及鉴定，构建重组人硫氧还蛋白菌种库、测定种子库的传代稳定性，鉴定重组人硫氧还蛋白的体外生物活性等。
背景技术：
硫氧还蛋白(Trx)是分子量约为12kDa的小分子蛋白质，它的氨基酸序列中含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基，该结构位于保守序列=Cys-Gly-PiO-Cys中，为其活性中心。氧化条件下，Cys32和Cys35之间形成二硫键(Trx_S2),该二硫键能被TrxR通过 NADPH供氢还原，还原型Trx (Trx- (SH) 2)含有巯基。Trx就是通过二硫键和巯基的互换来实现其氧化还原调节功能的。研究发现Trx广泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳动物中，结构高度保守，人类Trx有105个氨基酸组成。哺乳动物细胞中的Trx在活性中心以外还存在另外3个半胱氨酸残基，可以通过后修饰改变Trx的活性。人的Trx可分为胞衆型(Trxl)和线粒体型(Trx2)两种亚型。Trx系统,包括Trx、 Trx还原酶(TrxR)、还原型辅酶II (NADPH)和Trx过氧化物酶(TrxP)，是一个控制细胞还原 /氧化状态和细胞增殖/生存的广泛表达的氧化还原酶系统。Trx在TrxR的作用下可以从氧化型转变为还原型，还原型的Trx可以催化许多含有二硫键蛋白质的还原反应。TrxP可以在还原型Trx的参与下将过氧化氢还原为H20。研究发现，Trx除了基本的氧化还原调节功能，还有抗炎、抗凋亡等许多其他生物学活性，因而其与人类疾病的关系日益受到人们的重视。人体内的Trx是一类防御蛋白，能对多种应激状况做出响应，对细胞进行保护。除了其抗氧化效应，Trx具有抗凋亡和抗炎作用，并且抑制白细胞趋化和趋化因子的表达。已证明在动物模型中，在心血管疾病中扮演着重要角色，是维持心血管稳态的关键调节分子。 动物体内注射重组人Trx或者Trx在动物体内的过表达都可以有效地发挥抗氧化和抗炎作用。可以通过减少氧化/硝化应激、抑制心肌细胞凋亡来减弱心肌缺血/再灌注损伤，改善心脏功能，减少心梗面积，从而发挥其心脏保护作用。并且Trx溶解性好，作为其它蛋白的融合表达标签，可以有效促进蛋白的可溶性表达。Trx有较好的热稳定性，在4°C可保存一个月以上，可以短时间耐受80°C的温度。Trx 在哺乳动物体内的半衰期并不相同，在小鼠体内是I小时，大鼠是2小时，猴子是8小时，随尿液排出体外。虽然硫氧还蛋白有着广泛的应用前景，但目前用于实验室及临床试验的Trx主要有两大类，其中主要以从动物组织中提取的多见，但从动物组织中提取的Trx产量少、纯度低、免疫源性强、价格昂贵。还有少数是采用基因工程重组的，但这些基因工程重组的Trx 大都是带有标签的，这种带有标签的Trx无法应用与人体，只有少数是不带标签的，但大多仅限于实验室规模，工艺可行度低、难以扩大生产，无法满足成药性评价这些都使Trx应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种人硫氧还蛋白的制备方法，本发明的制备方法步骤简单，快速可靠，成本低，仅仅使用了两步离子交换层析就完成了纯化过程，且纯度达到95 % 以上。此方法制备的人硫氧还蛋白具有生物学活性，可以和鼠抗人硫氧还蛋白抗血清特异性结合，还可使胰岛素二硫键还原，其活性和标准品无差别。“重组人硫氧还蛋白”(rhTrx)的DNA序列如SEQ ID No 1所示。本发明的重组人硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，该制备方法包含以下步骤I)诱导培养含有重组人硫氧还蛋白的重组菌，离心获得菌体；2)超声波裂菌，破碎细胞，离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清上样于阴离子交换层析柱，收集目的蛋白所在洗脱峰，得到一次纯化产物；4)将得到的一次纯化产物上样于阳离子交换层析柱， 收集目的蛋白所在洗脱峰，得到重组人硫氧还蛋白。最终获得纯度达95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、或100%的目的蛋白质。步骤I)中，当培养至0D600nm达到7-8时，加入终浓度为ImM的IPTG作为诱导剂， 所述菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明所述人硫氧还蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所不。步骤2)中，加入裂菌缓冲液进行裂菌，菌体和裂菌缓冲液的比例为Ig菌体加IOml 裂菌缓冲液，所述裂菌缓冲液为STE裂菌缓冲液，该裂菌缓冲液由IOOmM NaCl、lmMEDTA、pH 8. O 的 50mM Tris-HCl 组成。步骤3)中，所述阴离子交换层析柱为DEAE阴离子交换层析柱，具体为 DEAESepharose Fast Flow层析柱。步骤4)中,所述阳离子交换层析柱为SP阳离子交换层析柱，具体为SP Sepharose Fast Flow层析柱。在步骤3)中，上清上样前，先用A液(20mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 8. O)充分平衡 DEAE Sepharose Fast Flow (high sub) (GE 公司)层析柱；上清上样后，用 B 液(20mM Tris-HCl，ImM EDTA, IM NaCl，pH 8. O)(洗脱缓冲液)连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰(见图8)，再加150倍体积C液(20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ImM EDTA, pH 4. O)(透析液)，透析24h，中间换液三到四次。在步骤4)中,先用C液充分平衡SP Sepharose Fast Flow (GE公司)层析柱,再将透析后的上清上样，用D液(20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，IM NaCl, ImM EDTA，pH 4.0) (洗脱缓冲液)连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰(见图9)，将其对 150 倍体积的 PBS (NaCl 10g/L, KCl 0. 2g/L, Na2HPO4. 12H20 2. 9g/L, KH2PO4O. 2g/L)分 3 次透析，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌,分装后-20°C保存备用。由图10、12、13可知，仅仅通过一个阴离子交换层析和一个阳离子交换层析，就可以获得纯度很高的重组人硫氧还蛋白，纯度可以达到95%以上、96%以上、97%以上、98% 以上、99%以上、或100%。重组人硫氧还蛋白的纯度鉴定和活性鉴定，采用SDS-PAGE和免疫印迹的半定性分析，HPLC，质谱分析；重组人硫氧还蛋白的体外生物活性鉴定，采用的是胰岛素二硫键还原法。
本发明的制备方法中，超声裂菌后的上清仅仅只需要经2步离子交换作用层析就可以完成目的蛋白的纯化过程，其中，裂菌上清经DEAE离子交换作用层析可去除50%以上的杂蛋白，在经SP离子交换作用层析可得到纯度大于95%的目的蛋白。
图I所示为重组质粒pET_22b (+) -Trx的双酶切鉴定图；A 图pET-22b (+) -Trx/Nde I 和 BamH I 双酶切位点示意图；B图为酶切后的凝胶电泳图M为DNA marker,左边泳道I为目的条带。图2所示为pET_22b (+) -Trx的测序结果图。图3所示为重组菌的菌落形态鉴定。图4所示为重组菌的革兰染色鉴定。图5所示为重组菌的透射电镜鉴定；A图为放大5000倍；B图为放大10000倍。图6所示为重组工程菌传代稳定性检定-重组质粒酶切图谱，其中，重组质粒用 Nde I和BamH I双酶切，进行I %琼脂糖电泳，M. DNA marker, I.原代，2. 10代，3. 20代， 4. 30 代，5. 40 代，6. 50 代。图7所示为重组工程菌传代稳定性检定-产物表达水平检定，其中EpiOtein marker ；1.诱导前；2.原代；3. 10 代；4. 20 代；5. 30 代；6. 40 代；7. 50 代。图8所示为重组人硫氧还蛋白的诱导表达结果，其中；A图随发酵时间变化的OD值，在发酵6h时加入ImM IPTG诱导表达；B 图1 protein marker ;2 :未诱导 BL21/pET_22b (+)-Trx ；3 lmM IPTG 诱导 BL21/pET-22b (+) -Trx Ih ；4 lmM IPTG 诱导 BL21/pET_22b (+)-Trx 2h ；5 lmM IPTG 诱导 BL21/pET-22b (+) -Trx 3h ；6 lmM IPTG 诱导 BL21/pET_22b (+)-Trx 4h。图9所示为DEAE阴离子交换层析结果，其中，A 图裂菌上清经 DEAE Sepharose Fast Flow 层析图；B图1 protein marker ；2 :裂菌上清；3 :收集穿过液；4 ;收集峰_目的蛋白。图10所示为SP阳离子交换层析结果，其中，A 图粗纯产物经 SP Sepharose Fast Flow 层析图；B图1 protein marker ;2、3 :收集峰_目的蛋白低浓度上样;4、5 :收集峰_目的蛋白中浓度上样；6、7、8 :收集峰-目的蛋白高浓度上样。图11所示为重组人硫氧还蛋白的纯化结果,其中，I protein marker ；2 :裂菌上清；3 =DEAE阴离子交换作用纯化目的蛋白；4 SP阳离子交换作用纯化目的蛋白。图12所示为通过本发明的制备方法获得的重组人硫氧还蛋白的免疫印迹鉴定， 左右均为纯化出的蛋白。图13所示为通过本发明的制备方法获得的重组人硫氧还蛋白的HPLC分析图。图14所示为通过本发明的制备方法获得的重组人硫氧还蛋白的质谱分析图。图15所示为通过本发明的制备方法获得的重组人硫氧还蛋白的活性测定结果； 反应液中有lug/ul标准品Trx ；
■反应液中有lug/ul本方法纯化出的Trx ；空白对照。
具体实施例方式实验材料(I)主要仪器5415C台式离心机，Eppendorf公司；GS_15R高速台式冷冻离心机,美国Beckman 公司；V0RTEX_2混合器，Scientific industries公司；PHS_3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂；CSI0I-IE电热鼓风干燥箱，中外合资重庆四达实验仪器有限公司；DY-C1转移电泳仪，江苏省兴化市分析仪器厂；SHH-3生化培养箱，重庆四达实验仪器厂；恒温水浴箱， Pharmacia(LKB)公司；SBD50_1 bio 恒温水浴摇床，丹麦 Heto master Shaker 公司；恒温空气摇床，德国GALLENKAMP ;蛋白电泳仪，Bio-Rad公司；紫外透射反射分析仪，浙江永嘉上塘教学仪器厂J2-HS全自动高速冷冻离心机，美国Beckman公司；J_6B大容量离心机，美国Beckman公司；377型全自动序列分析仪，PE公司；Labo Autoclave高压灭菌仪， ANYO公司；1815TC C02恒温孵育箱，美国Shel-Lab公司；TH_2C恒温震荡器，江苏太仓实验设备厂；常压液相色谱仪控制器Phamacia GP-IO ;螺动泵Phamacia P_1 ;紫外检测仪 Phamacia Uricord SII ;分部收集器Phamacia RediFrac ;超净工作台，安徽蛘埤净化设备厂；MiIIi-QUF 纯水器，MiIIipore 公司；Lambda UV/VIS 分光光度计，PE 公司；DW1.0-60E 冷冻干燥机，丹麦Heto公司。(2)主要试剂材料细菌菌种E. coli DH5 a，E. coli BL21 (DE3)由大四军医大学生物技术中心提供质粒载体pET_22b由大四军医大学生物技术中心提供分子生物学试剂质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒购自上海博亚公司Jrizol为 Invitrogen公司产品；M_MLV逆转录酶为promega产品；限制性核酸内切酶Nde I和EcoR I 购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，DNAMarker购自TaKaRa公司；蛋白Marker 购自Pharmacia公司；DNA凝胶回收试剂盒购自omiga公司；离子交换层析柱购自QIAGEN 公司。抗人硫氧还蛋白单克隆抗体购于Abcam公司。羊抗小鼠IgG-HRP,购自Santa公司。 硫氧还蛋白标准品购自sigma公司。主要化学试剂胰蛋白胨，酵母提取物为Oxide公司产品，Tris base为Promega公司产品，IPTG 为Solon公司产品，TEMED购于Bio-Rad公司。丙烯酰胺、N，N' - 二甲基双丙烯酰胺、SDS、 过硫酸铵、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甘油、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸氢钠、硫酸铵、氯化铵等均为国产分析纯试剂。主要工作液的配制LB培养液胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/LLB固体培养基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂15g/L，氯化钠5g/L种子培养基胰蛋白胨I. 6g/L,酵母提取物lg/L,氯化钠O. 5g/L,甘油2ml/L发酵培养基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，甘油20ml/L，硫酸镁O. 6g/L，
磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸氢钠14g/L，硫酸铵2. 4g/L，氯化铵 O.04g/L发酵补料培养液胰蛋白胨16g/L，酵母提取物8g/L，甘油80ml/L，硫酸镁lg/L，PBS NaCl 10g/L, KCl O. 2g/L, Na2HPO4. 12H20 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L实施例一构建重组人硫氧还蛋白基因表汰载体pET~22b (+) -rhTrx(I)获得人硫氧还蛋白全长cDNA收集HEK293 (人胚胎肾)细胞并加入ImL Trizol试剂，总RNA的提取按说明常规操作。紫外分光光度计测定RNA的纯度A260nm/A280nm = I. 90。根据已报道的人Trxl基因编码区序列设计引物，基因登陆号为Gene ID :7295,由华大基因公司合成。上游引物5’GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC 3’下游引物5’GCGGATCCTTAGACTAATTCATTAATG 3’cDNA 第 I 链的合成按照 Promega 公司 M-MLVReverse Transcriptase 说明书进行，主要的操作步骤如下在聚合酶链反应管中加入总RNA1. 5 μ g，随机引物 oligo (dT) 2 μ L(浓度为 10 μ mol/L)，DEPC 水补足至 12 μ L，混匀，70 °C 孵育 5min 后迅速冰浴，加入 M-MLV 5XBuffer4y L, 10mmol/L dNTPmix 2 μ L, M-MLVReverse Transcriptase (2OOU/μ L) I μ L，力口 ddH20至总体系 20 μ L，42°C反应60min，70°C孵育 IOmin 灭活反转录酶以终止反应。cDNA的聚合酶链反应总反应体积为25 μ L :Template cDNA 4 μ L,上游引物 2 μ L,下游引物 2 μ L, Taq DNA Polymerase 12. 5 μ L，加H20 M 25 μ L0反应条件如下94°C预变性4min ;94°C变性30s, 55°C退火30s， 72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸lOmin。聚合酶链反应产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳分析后，快速取350bp左右处的条带进行割胶纯化。(2) pET-22b (+) -rhTrx 的构建及鉴定所得DNA片段经Nde I和BamH I双酶切后连入同样用Nde I和EcoR I双酶切得到的pET-22b(+)载体片段，连接产物用CaCl2法转入E. coli DH5 α感受态细胞。提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图1)，DNA测序结果显示序列正确(图2)。将此质粒命名为pET-22b (+) -rhTrx。实施例二构津重组人硫氧还蛋白菌种库(I)感受态细胞的制备取E. coli BL21 (DE3)甘油菌种按I : 100的比例接种于LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至0D600约0. 4左右(无菌操作)。将菌液冰浴lOmin， 离心(3000rpmX 5min, 4°C )后弃去上清，加入1/2体积预冷的100mmol/L CaC12,轻轻吹起沉淀，冰浴40min,离心(3000rpmX5min,4 )，弃上清后加入1/25体积的含25%甘油的 100mmol/L CaC12,吹起沉淀,分装入Eppendorf管中，-70°C保存备用。(2)感受态细胞的转化和培养将大肠杆菌感受态细胞从-70 °C中取出，冰浴溶解5-10min，加入 pET-22b (+) -rhTrx的连接产物，轻微混匀，冰浴20min，42°C热休克90s，然后铺板，37°C培养过夜。(3)质粒的提取和鉴定
在连接产物转化后37°C培养过夜的培养皿上挑取边缘整齐，生长状态良好的单克隆，接种到IOOmL含Amp的LB培养基中，37°C，200rpm培养9h，用质粒提取试剂盒提取质粒 50管，用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳观察是否有插入片段以及插入的片断是否与预期的大小一致。将酶切鉴定阳性的克隆送北京华大基因有限公司进行DNA测序。将测序正确者命名为pET-22b (+) -rhTrx。(4)甘油菌的制备在连接产物转化后37°C培养过夜的培养皿上挑取边缘整齐，生长状态良好的克隆，接种到IOOmL含Amp的LB培养基中，37°C，200rpm培养9h，取菌液加入50%甘油，分装于菌种管内，封口，制备50管，-70°C保存。(5)种子库的检定菌落形态检定呈典型的大肠杆菌菌落形态，无其他杂菌生长(图3);革兰氏染色检定为典型的革兰氏阴性杆菌(图4);透射电镜检定为典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其它微生物的污染(图5);抗生素抗性检定与原始菌种抗性相符；工程菌的生化反应特性符合大肠杆菌生物学性状。(6)工程菌的传代稳定性检定工程菌在LB平板上划痕传代50次，每10代观察质粒酶切图谱、产物的的表达水平和裂菌上清rhTrx活性，结果显示，质粒酶切图谱、工程菌表达水平和裂菌上清硫氧还蛋白活性均与原始菌种一致(图6、7)。实施例三重组人硫氧还蛋白的表汰(I)重组人硫氧还蛋白的实验室培养在实验室研究阶段，我们采用三角摇瓶对工程菌进行培养，具体步骤如下重组质粒pET-22b (+) -Trx转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，摇床37°C培养过夜，次日以
I 100的比例接种于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，37°C继续培养至细菌密度达到0D600 = O. 4 O. 6，加入ImM IPTG，诱导4h后收集菌体。(2)重组人硫氧还蛋白发酵工艺的建立将_70°C保存的甘油菌种划线接种于含氨苄青霉素(100mg/L)的固体LB平板， 37°C恒温孵箱培养过夜，挑生长良好的单克隆接种于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L) 中，摇床37°C培养至细菌密度达到0D600 = 0. 6，以1%接种于50ml种子培养基中(含氨苄青霉素100mg/L)37°C，220rpm培养过夜为一级种子液；次日以I : 100的比例接种于新鲜 LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L) 100mlX2瓶中，37°C，220rpm继续培养至细菌密度达到 0D600 = 0. 4 0. 6，生长为二级种子液。准备用于上发酵罐。采用Biostat_CT5自控发酵罐，发酵体积为5L，溶氧控制在30% -60%,通过调节通气流速(AIRFL)以及搅拌转数(STIRR)对其进行控制，当转数达到最大(800rpm)，气流为4. 00L/Min时，通入纯氧；温度控制为37°C ；pH控制在7左右，当pH值低于该值时，用补加氨水来控制；采用分批补料流加方式发酵前3h不加补料，4-7h流加速率为100ml/h， 7-10h为200ml/h。整个发酵过程中，通过控制pH值、活化和诱导时间、溶解氧饱和度和补料的流加速率，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。每30min取样测定0D600nm值，当培养至0D600nm达到7-8时加入终浓度为ImM的IPTG，继续培养4h后收集菌体，取小量进行SDS-PAGE检测蛋白表达水平，其余菌体保存与_70°C用于纯化。(3) SDS-PAGE 电泳鉴定30 μ L超声裂菌上清，加入30 μ I 2 X载样缓冲液，混匀。沸水中煮lOmin，冷却后12000rpm离lOmin，取IOy I上清加样于15%分离胶6%浓缩胶，上样后电压为80V约 30min，样品进入分离胶后电压升至120V约2h，用O. 5%考马斯亮兰R-250振荡染色2_3h， 脱色直至背景清晰后制备干胶保存。从图8中可知，当培养至0D600nm达到7_8时，重组菌的细胞增殖进入了快速分裂增殖期，此时是加入诱导剂的最佳时间；当1禮IPTG诱导4h时，重组蛋白质的表达量最大， 因此选择ImM IPTG诱导4h最佳。实施例四重组人硫氧还蛋白的纯化(I)超声裂菌取IOg 表达湿菌，将其悬浮于 IOOmL STE(IOOmMNaCl, 50mM Tris. Cl, ImM EDTAjPH 8. O)中，在冰浴中300W超声裂菌，超声5s，间歇10s，全程40min，离心(12000rpmX 40min, 4°C )，保留上清，用O. 45 μ m滤膜过滤除去杂质。(2)离子柱层析收集的上清用A液20mM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA充分平衡的DEAE Sepharose Fast Flow (high sub) (GE 公司)层析纯化，用 B 液20mM Tris-HCl, ImM EDTA, IMNacl, pH 8. 0，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰(见图9)，再加150倍体积C 液20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ImM EDTA, pH 4. 0，透析24h，中间换液三到四次。透析后上清用C液充分平衡的SP Sepharose Fast Flow (GE公司)层析纯化,用 D液20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，IM NaCl，ImM EDTA, pH 4. O连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰(见图10)，将其对150倍体积PBS透析，分3次透析，用
0.22 μ m滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存备用。由图11可知，仅仅通过一个阴离子交换层析和一个阳离子交换层析，就可以获得纯度很高的重组人硫氧还蛋白。实施例五重组人硫氧还蛋白的鉴定(I)Lowry’ s法测蛋白质含量标准曲线的制定精确量取标准蛋白质溶液(100yg/ml)0,0.2,0.4,0.6,0.8,
1.Oml分别置于试管中(双管)，加蒸馏水补至lml。其余操作同样品，可得一标准曲线。样品检测方法精确量取一定体积样品(含蛋白50 μ g左右)，迅速混勾，室温放置 30min,650nm 比色。蛋白质含量计算根据OD值从标准曲线上查出所测样品蛋白含量或将OD值代入回归方程计算蛋白含量。注若样品含量超出标准曲线范围，可将样品作适当稀释。(2)重组人硫氧还蛋白的免疫印迹鉴定诱导后的菌体在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、聚偏氟乙烯(PVDF)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇)中100V恒压电泳40分钟，将蛋白转移至PVDF膜上。电泳结束后，取出 PVDF膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，ρΗ7· 5、150mM NaCl,0. 05% Tween-20)清洗后浸入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)中4°C封闭过夜，TBST室温洗3次，每次lOmin，加入人硫氧还蛋白单克隆抗体(I 1000稀释孵育I :15h，TBST室温洗3次，每次lOmin，再加入羊抗小鼠IgG-HRP (按I : 5000稀释)，室温孵育45min, TBST室温洗3次，每次lOmin, PVDF 膜浸入DAB显色液中，室温避光显色lmin，蒸馏水冲洗终止反应(见图12)。(3)高效液相色谱分析用流动相(20mM Tris-HCl pH 8. O)平衡色谱柱至基线平稳，流速为O. 6ml/min，取 25μ I蛋白样品上样，用流动相洗脱，检测波长为280nm，记录并分析结果。见图13，通过本发明的制备方法制备获得的重组人硫氧还蛋白的纯度很高，未见杂质。(4)质谱分析(MALDI-TOF-MS)用截留分子量为3000Da的超滤离心管对纯化的蛋白样品进行除盐、浓缩， O. 22 μ m滤器过滤除菌后，委托西安工业大学对其进行分子量测定。见图14，通过本发明的制备方法制备获得的重组人硫氧还蛋白的纯度很高，未见杂质。(5)重组人硫氧还蛋白体外生物学活性检测取纯化的蛋白调整浓度为40 μ g/40 μ I,加入2 μ I的活化液[activationbuffer IOOmM XN-2 轻乙基喊嚷-N -2 乙横酸(Hepes), 2mM 乙二胺四乙酸(EDTA), lmg/ml BSA, and 2mM dithiothreitol]后在 37°C下孵育 20mins。然后加入 20 μ I 的反应液(reaction buffer 100mM Hepes,2. OmM EDTA,0. 2mMNADPH, and 140 μ M insulin)。在待测样本中加 Λ I μ I哺乳动物Trx还原酶(Trx reductase 1 μ 1,15mU, Sigma),在空白对照样品加入相同体积的去离子水。反应体系在37°C下孵育20min后加入125 μ I反应终止液(Stopping solution 0.2M Tris-CL,10M guanidine-HCl, and I. 7mM 3-carboxy-4-nitrophenyl disulfide)使反应停止,将96孔板置于SpectraMax-Plus培养板分光光度计，于412nm处检测反应后样品的吸光度，结果见图15。本发明的效果如下a)利用基因人工合成与PCR技术成功构建了重组人硫氧还蛋白基因表达载体 pET-22b (+) -rhTrx,其酶切鉴定结果与预期一致。b)工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx经低浓度IPTG(ImM)诱导后便可高效表达目的蛋白，诱导后菌体的裂菌上清经2步离子交换作用层析，可得到纯度大于95 %的目的蛋白。c)采用免疫印迹法证明重组人硫氧还蛋白可与鼠抗人硫氧还蛋白抗血清特异性
彡口口 d)纯化的重组人硫氧还蛋白与标准品人硫氧还蛋白均能使胰岛素二硫键还原。e)摸索出稳定的适应于工业化生产的中式工艺。
权利要求
1.一种重组人硫氧还蛋白(rhTrx)的制备方法，其特征在于，该制备方法包含以下步骤1)诱导培养重组菌，离心获得菌体；2)裂菌,离心,收集上清；3)上清上样于阴离子交换层析柱，收集目的蛋白所在洗脱峰，得到一次纯化产物；4)将得到的一次纯化产物上样于阳离子交换层析柱，收集目的蛋白所在洗脱峰，得到重组人硫氧还蛋白；最终犾得纯度达95%以上的重组人硫氧还蛋白。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中，当培养至0D600nm达到 6-8时，加入终浓度为ImM的IPTG作为诱导剂。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中，所述菌为大肠杆菌 BL21(DE3)。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，加入裂菌缓冲液进行裂菌，菌体和裂菌缓冲液的比例为Ig菌体加IOml裂菌缓冲液，所述裂菌缓冲液为STE裂菌缓冲液，该裂菌缓冲液由IOOmM NaClUmM EDTA、pH 8. O的50mM Tris-HCl组成。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述阴离子交换层析柱为 DEAE Sepharose Fast Flow 层析柱。
6.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述阳离子交换层析柱为 SP Sepharose Fast Flow 层析柱。
7.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述阴离子交换层析柱使用的洗脱缓冲液由 20mM Tris-HCl, ImM EDTA, IM NaCl, pH8. O 组成。
8.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，收集目的蛋白所在洗脱峰后，再加150倍体积的透析液，分3次透析，所用透析液由20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液， ImM EDTA，pH 4. O 组成。
9.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述阳离子交换层析柱使用的洗脱缓冲液由20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，IM NaCl, ImM EDTA, pH 4. O组成。
10.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，收集目的蛋白所在洗脱峰后，再加150倍体积的PBS，分3次透析。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组人硫氧还蛋白的制备方法。通过该制备方法可获得纯度达95％以上的目的蛋白质，所获得的人硫氧还蛋白具有生物学活性。本发明还构建人重组硫氧还蛋白菌种库，测定了种子库的传代稳定性；采用免疫印迹法证明该重组人硫氧还蛋白可与鼠抗人硫氧还蛋白抗血清特异性结合；还通过胰岛素二硫键还原法测定该蛋白质活性。结果表明，纯化出的重组人硫氧还蛋白具有胰岛素二硫键还原酶活性，且效果明显。本发明方法仅通过两步离子交换作用层析，就完成了目的蛋白的分离纯化，步骤简单、快速、成本低，为人硫氧还蛋白的进一步研究和广泛应用奠定基础。
文档编号C12R1/19GK102586201SQ20121001401
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者孙璐, 屈延, 张立剑, 郭云萍, 陶凌, 高超 申请人:陶凌