一种真菌硫氧还蛋白的多肽、编码序列及制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种真菌硫氧还蛋白的多肽、编码序列及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及真菌杨树菇(v4groc少^ ^gehto)硫氧还蛋白基因序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽的制 备方法，同时还涉及多肽在医药、抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
杨树菇04groc;;&eflegen'to)隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田 蘑属。又名柱状田头恭、杨树燕、茶薪燕、柳松茸等。富含人体必需的八种氨基 酸，其中赖氨酸高达1.75%，其营养价值超过香菇、金针菇等其他食用菌，同时 又具有独特的药用价值，民间常用于抗癌、降压，治疗胃冷、肾炎、水肿等有独
特疗效，有"中华神菇"之美誉，但其中的药理成分并不明确，本发明中涉及的杨 树菇硫氧还蛋白是我们首次发现的重要药理成分。
硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)是一种NADffl依赖的包含 FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员。其主 要功能是催化NADPH将硫氧还蛋白(thioredoxin， Trx)上的-S2还原成(-SH)2的反 应，即维持Trx的还原型，而Trx在氧化还原调节和抗氧化防御中有着重要作用。 TrxR的底物专一性不强，除Trx外许多内生的和外来的化合物，如维生素K3、硫辛 酸、DTNB和四氧嘧啶、磷脂氢过氧化物等，都可被TrxR还原。TrxR参与机体多种 生物学活性，并与人类许多疾病有关，如肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、自身免 疫性疾病等。
TrxR在肿瘤细胞中表达量是正常组织的10倍。用免疫细胞化学法测定TrxR
在人原发乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌及恶性黑色素瘤中的定位与 表达，结果显示，侵袭力强的肿瘤过度表达TrxR，其增殖力强、凋亡率低、转移力 高，因此，TrxR在癌及肿瘤的形成中有重要作用，可作为抗癌治疗的靶点。本发明中提供一种真菌来源的硫氧还蛋白，具有抗肿瘤活性，可能作为TrxR 的抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种多肽核苷酸序列，该序列能编码上述杨树菇 硫氧还蛋白多肽序列。该序列与SEQ ID NO. 1中1-327位的核苷酸序列有至少 70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中 1-327位的核苷酸序列杂交。70%的同源基因可以通过突变试剂盒进行突变，或 者通过插入，缺失等基因操作获得。较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷 酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO. 1中1-327位核苷酸序列编码具有SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。该序列是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通 过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列，连接于表达载体，生产杨树 菇硫氧还蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一种真菌硫氧还蛋白的多肽(SEQ ID NO. 2) 所示的氨基酸序列，该多肽具有多种活性抗肿瘤活性，在医药上具有广泛的应 用价值。
本发明还涉及一种杨树菇硫氧还蛋白多肽的制备方法，该方法是构建原核表 达载体，利用亲和层析方法纯化杨树菇硫氧还蛋白，该方法简便，成本低廉。
本发明还涉及一种真菌硫氧还蛋白活性的多肽(SEQ ID NO. 2)所示的氨基 酸序列在作为制备治疗或预防宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌 等多种肿瘤疾病药物中的应用。它可以抑制多种肿瘤细胞的生长，杀死肿瘤细胞， 对肿瘤细胞的抑制作用优于或类似于临床应用的化疗药物阿霉素效果，该硫氧还 蛋白有开发成抗肿瘤药物的潜力。
为实现上述任务，本发明采用以下技术措施
本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该序列编码一种新的杨树菇 硫氧还蛋白。在本发明中；真菌杨树菇硫氧还蛋白的cDNA核苷酸序列是以杨 树菇总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR方法得到的。具体方法如下杨树 菇菌种为福建省三明真菌研究所提供的栽培种Ag21 (食用菌学报，1999， 6(3): 1-7)，取杨树燕的新鲜菌丝或子实体，提取总RNA或mRNA为模板(市售的提
4取RNA和mRNA试剂盒，如Clontech， Promega， Stratagene等公司产品，按照 说明书操作)，合成逆转录弓I物5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6 (a/c/g)3'，进行逆 转录得到cDNA第一链。根据杨树菇硫氧还蛋白cDNA序列，设计引物5' atggttgtcaaagctatcacct 3'为正向引物，以5， gacaagggtggccgcctccttg3，为反向引物， 以上述cDNA第一链为模板，进行PCR，获得约350bp目的片段，将此片段克 隆测序，得到SEQ ID NO. 1的cDNA核苷酸序列。
本发明所要求保护的与上述cDNA序列至少有70%的同源性的基因可以通 插入，缺失、突变等基因操作获得。如可以在设计PCR引物时，在SEQ IDNO. 1 提供的核苷酸序列基础上，可以任意进行插入，缺失和突变的引物合成，用该引 物进行PCR，则可以得到至少有70%同源性的基因。较佳地，所述的序列编码一 多肽，该多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。较佳地至少80%，更佳地 至少90%的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO. 1中卜327位的核苷 酸序列。根据SEQIDNO. 1 1-327位的核苷酸序列，设计引物，引物通常为包含 l-20位核苷酸序列，和与307—327位互补的核苷酸序列，通过PCR或RT-PCR 的方法大量扩增该核苷酸序列。
本发明要求保护的杨树燕硫氧还蛋白活性的多肽可用如下方法生产。该方法 包括以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京科学出版社中所述的条件进行。
一种杨树菇硫氧还蛋白多肽的制备方法，它包括下列步骤
1) 提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链， 以此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸全长序 列；
2) 获得与cDNA至少有70%同源性的基因序列在SEQ ID NO. 1的1-327 核苷酸序列基础上，根据需要，以其中的任意一段核苷酸序列(一般为 20-40bp，也可以长达100bp)为PCR引物，有目的的在引物合成时引入 碱基的插入，缺失和突变，用该引物与SEQ ID NO. 1中设计酶切位点的 两端序列(l一20序列，307—327序列，或307—327互补序列，或或1 一20互补序列)为一对引物，进行PCR扩增可以在原序列中有目的的引 入碱基的插入，缺失和突变，得到与cDNA至少有70X同源性的基因序
5列。
3) 构建重组表达载体步骤2中得到的核苷酸序列和原核表达载体pET28b
(市售，Novagen公司，也可以用市售的其他的各种表达载体)进行酶 切，连接酶切后的cDNA序列和表达载体pET28b,构建重组表达载体 pET28—杨树恭硫氧还蛋白；
4) 将步骤3中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞BL21 (市售， Novagen公司，可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞)，形成 表达杨树菇硫氧还蛋白的重组细胞；
5) 将步骤4中得到的重组细胞在37'C培养过夜获得饱和培养物；将50pL 饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100吗/mL的培养基中，于37"C培 养2小时。取lmL培养物转移至微量离心管中。加异丙基硫代半乳糖 苷IPTG至终浓度为lmmol/L，对培养物进行诱导，诱导8-10小时。
6) 利用Ni2+亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤5中在重组细胞中诱导 表达具有所示的氨基酸序列的多肽。该多肽为SEQ ID N0.2所示的氨基 酸序列。
纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。
本发明所得到的多肽为SEQ ID NO. 2所示的氮基酸序列，该氨基酸序列 可以抑制宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌肿瘤细胞的生 长，杀死肿瘤细胞。基本纯的该硫氧还蛋白多肽或其变异形式可以单独、 或以不同的比例加入其他抗肿瘤药物形成口服的、静脉注射或瘤内注射的 抗肿瘤药物。
在本发明中，'"分离的'"、"纯化的"或"基本纯的"DNA指，该DNA或片段已 从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段己经与天然状态 下伴随核酸的组分分开，而且己经与细胞中伴随的蛋白质分开。
在本发明中，术语"杨树燕硫氧还蛋白(或多肽)编码序列"指编码具有杨 树菇硫氧还蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中1-327位核苷酸序 列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDN0.1序列的编码框l-327位核 苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的
序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO. l中l-327位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。该术语还 包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下能与SEQ ID NO. 1中核苷酸 1-327位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ IDNO. 1 中从核苷酸1-327位核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地 至少90%的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有杨树菇硫氧还蛋白功能蛋白的SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于) 若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核 苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常以120个 以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，"基本纯的"蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20%， 较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或湿重计)。纯 度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC方法测量多肽的 纯度。
在本发明中，术语"杨树菇硫氧还蛋白多肽"指具有杨树菇硫氧还蛋白活性 的SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，该术语还包括具有与杨树菇硫氧还蛋白相同 功能的、SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并 不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个 或数个(通常为40个以内，较佳地为20个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。 例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白 质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改 变蛋白质的功能。该术语还包括杨树菇硫氧还蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、 在高或低的严谨度条件下能与杨树菇硫氧还蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、 以及利用抗杨树菇硫氧还蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了 其他多肽，如包含杨树菇硫氧还蛋白多肽的可溶性片段。通常，该片段具有杨树 燕硫氧还蛋白多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸， 较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约
7100个连续氨基酸。
本发明还提供杨树燕硫氧还蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇 硫氧还蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰 形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变 异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可 以通过定点诱变法或其他分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L一 氨基酸的残基(如D —氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如P、 Y—氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的 代表性的多肽。 '
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式 如乙酰化或羧基化，如那些在多肽的合成和加工中和进一步加工步骤中进行糖基 化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳 动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括磷酸化氨基酸残基(如 磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗 蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括杨树菇硫氧还蛋白多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可 以用于抑制细胞内杨树菇硫氧还蛋白的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有杨树菇硫氧还蛋 白多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样
品中是否存在编码杨树燕硫氧还蛋白的核酸分子。 本发明还包括检测杨树菇硫氧还蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探
针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增 后的产物，其中PCR扩增引物对应于杨树薛硫氧还蛋白多肽的编码序列，并可位 于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为20-50个核苷酸。
.另一方面，本发明还包括对杨树菇硫氧还蛋白或是其片段编码的多肽具有 特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指 抗体能结合于杨树燕硫氧还蛋白基因产物或片段。较佳地，指那些能与杨树菇硫 氧还蛋白基因产物或片段结合但不识别和结合与其他非相关抗原分子的抗体。本 发明中抗体包括那些能够结合并抑制杨树菇硫氧还蛋白的分子，也包括那些并不影响杨树菇硫氧还蛋白的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的杨 树菇硫氧还蛋白基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗 体片段，如Fab'或(Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传过程改造的单链 Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的 抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化的杨树菇硫氧还蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以 诱导多克隆抗体的产生。本发明的抗体也可以是单克隆抗体，可以利用杂交瘤技 术来制备。本发明的各类抗体可以利用杨树菇硫氧还蛋白基因产物的片段或功能 区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多 肽合成仪合成。 本发明的优点和效果
本发明中提供的杨树菇硫氧还蛋白核苷酸序列和蛋白质序列是一种新的硫氧 还蛋白的基因和蛋白质序列，未见报道。因此，本发明的优点是"新"——本发 明是一种新的，具有抗肿瘤活性的硫氧还蛋白，可以应用在医药领域。
本发明中涉及的杨树菇硫氧还蛋白蛋白具有很强的抗肿瘤活性。在相同的浓
度下，对HeLa (宫颈癌细胞)、HepG2 (肝癌细胞)、MCF-7 (乳腺癌细胞)的 抑制效果优于临床使用的化疗药物阿霉素，对Colo 320 (直肠癌细胞)、PC-3 (前 列腺癌细胞)和SGC-7901 (胃癌细胞)的抑制效果与阿霉素相当。对荷S180 骨肉瘤的小鼠进行治疗，可以延长小鼠的生存时间，对肿瘤生长的抑制率为34.6 %。因此，该蛋白及其基因在开发抗肿瘤药物方面将有很大的应用价值。


图1为一种pET28-杨树菇硫氧还蛋白的构建示意图。图中TRX为杨树菇硫氧 还蛋白的基因，pGEM-TRX为TRX的保存质粒。首先设计含有Nco I禾tl Xho I酶 切位点的上下游引物，以质粒pGEM-杨树菇硫氧还蛋白为模板，进行PCR，得 到两端含有Nco I禾t] Xho I酶切位点的PCR产物，用Nco I禾tl Xho I酶分别消 化PCR产物和pET28b质粒，根据回收的量进行连接反应，使TRX插入pET28b
9的多克隆位点，完成pET28—杨树菇硫氧还蛋白(pET28b-TRX)表达载体的构 建。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规实验条件，《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著， 2003,北京科学出版社中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。
编码杨树燕硫氧还蛋白核苷酸序列的制备方法，杨树菇硫氧还蛋白多肽制备 方法，及活性实施例，抗体制备实施例，抗肿瘤实施例。
实施例1
杨树薛硫氧还蛋白的cDNA克隆和测序本实施例中得到一新的cDNA序列， 是前人未报道过的。
1. 引物扩增
以杨树菇总RNA为模板，用寡核苷酸A: 5， gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6 (a/c/g)3'为逆转录引物进行逆转录，得到cDNA的第一链，以寡核苷酸B: 5' atggttgtcaaagctatcacct 3 ，为正向引物，寡核苷酸C: 5， gacaagggtggccgcctccttg 3 ，为 反向引物，进行PCR， PCR条件为95°C起始10min，进入三步循环(95°C lmin， 53°C lmin， 72°C 2min共30个循环)，最后72°C延伸10 min。 20pL反应体系包 含l吗cDNA， 0.2mMdNTP， 20pM正向引物和反向引物，2pL 10Xbuffer， l|xL Taq酶和1.5 mM MgCl2。 PCR产物为一约327bp目的片段。
2. 克隆测序 .
根据pGEM-T easy载体(Promega公司产品)的操作手册，将该扩增片段连接 到pGEM-Teasy载体上，构建质粒pGEM-TRX (pGEM-杨树菇硫氧还蛋白)， 进行测序，详细序列见SEQIDNO.l,其中1-327为编码氨基酸序列的开放阅读 框序列。
根据得到的cDNA序列翻译出杨树菇硫氧还蛋白的氨基酸序列，共109个氨 基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID N0.2。
10实施例2
杨树菇硫氧还蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化本实施例中可以得到大量表 达、纯化的蛋白质样品。
首先设计含有Nco I和Xho I酶切位点的上下游引物，以质粒pGEM-杨树菇 硫氧还蛋白为模板，进行PCR，得到两端含有Nco I和Xho I酶切位点的PCR产 物，用Nco I和Xho I酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，回收杨树菇硫氧还蛋 白片段和目的质粒，根据回收的量进行连接反应，构建原核表达载体pET28b — 杨树菇硫氧还蛋白(pET28b-TRX)(图l)。将原核表达载体转化大肠杆菌宿主 细胞BL21(市售，Novagen公司，可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞)， 形成表达杨树菇硫氧还蛋白的重组细胞。
按照前述的原核表达方法，根据不同时间诱导表达重组杨树菇硫氧还蛋白的结 果，诱导表达8-10小时，大量表达。利用Ni柱纯化重组杨树菇硫氧还蛋白，表 达量约为4一8mg/L。
实施例3
杨树菇硫氧还蛋白抗体的制备该实施例可以获得杨树燕硫氧还蛋白的多克 隆抗体，用于检测杨树菇硫氧还蛋白。
将天然蛋白和实施例2中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方 法如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用，也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进 行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund's佐剂乳化。用 50-100ug/0.2mL乳化过的蛋白，对小鼠进行皮下注射。14天后，用非完全Fre皿d's 佐剂乳化同样抗原，对小鼠以50-100ug/0.2mL的剂量进行皮下注射以加强免疫。 每隔14天进行一次加强免疫，至少进行3次。获得的抗血清的特异反应活性用 它在体外结合杨树恭硫氧还蛋白基因翻译产物的能力加以评估(Western方法)。
实施例4
杨树菇硫氧还蛋白对肿瘤细胞和荷瘤小鼠肿瘤组织的抑制作用本实施例中 杨树菇硫氧还蛋白抑制检测的7种肿瘤细胞株，证实杨树菇硫氧还蛋白具有广普 抗肿瘤作用；抑制荷S—180肉瘤小鼠的肿瘤组织生长，延长荷瘤小鼠的生存时
11间，证实杨树菇硫氧还蛋白对荷瘤动物的肿瘤组织有抑制生长作用。
l.杨树燕硫氧还蛋白在体外对肿瘤细胞株的抑制作用
本实施例检测了杨树菇硫氧还蛋白对7种肿瘤细胞株(SW480, HeLa， SGC-7901,MGC80-3,BGC-823,HL-60andS-180)生长的抑制活性。所述的一种 分离的多肽在制备治疗或预防宫颈癌药物中的应用；所述的一种分离的多肽在制 备治疗或预防胃癌药物中的应用；所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防乳腺 癌药物中的应用；所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防直肠癌药物中的应 用；所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防前列腺癌药物中的应用；所述的一 种分离的多肽在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。所有的肿瘤细胞株在 RPMI1640培养基(其中包含10%的胎牛血清，100mg/mL链霉素和100U/mL的青 霉素)中培养。将不同浓度的杨树菇硫氧还蛋白(以培养基配制成5， 10， 50， 100ug/mL)加入肿瘤细胞中，温育24小时后，用MTT方法检测杨树菇硫氧还蛋 白对肿瘤细胞生长的抑制作用。检测结果如表2中所示。杨树菇硫氧还蛋白对所 检测的肿瘤细胞株有很好的抑制作用，对HeLa，MCF-7， HepG2细胞的抑制效果 优于化疗药物阿霉素，在Cok)320， SGC-7901和PC-3等多种肿瘤细胞中表现出与 化疗药物阿霉素在相同的浓度下具有相似的抑制率。
表2杨树菇硫氧还蛮白(TRX)在体外对肿瘤细胞的抑制作用
细胞株5ng/mLlOfig/mL50照/mL100pg/mL100吗/mL
TRXTRXTRXTRX阿霉素
HeLa (宫颈癌)12.1±3.535.6 ±4.245.3 ±5.360.3 ±5.245.2 ±4.5
Colo 320 (直肠癌)20.5 ±5.232.4 ±4.840.2 ±3.954.8 ±5.251.2 ±5.5
SGC-7卯1(胃癌)25.1 ±5.131,2±3.755.2 ±4.666.3 ±4.570.2 ±4.7
PC-3(前列腺癌)15.2 ±5.433.7 ±5.240.6 ±6.152.3 ±4.755.4 ±5.3
MCF-7 (乳腺癌)'24.5±3.636.7 ±4.855.2 ±3.770.5 ±4.860.5 ±5.1
HepG2 (肝癌)18.6 ±4.229.6 ±5.267.6 ±5.479.3 ±4.465.3 ±6.8
2.杨树菇硫氧还蛋白对荷瘤小鼠肿瘤组织生长的抑制作用
在本实施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窝皮下接种O.lmL小鼠
骨肉瘤细胞S-180 (1.18Xl08CellS/mL)，接种3天后，瘤内注射杨树菇硫氧还蛋
白(以生理盐水溶解1.67mg/mL，注射0.06mL) O.lmg/只小鼠，对照注射生理盐 水。此后，隔天注射。在接种肿瘤20天后处死小鼠。切下肿瘤称重，计算抑制率。
12抑制率(％) = [(C - r)/C] X 100。/。(C是对照组平均肿瘤重量，T为治疗组肿瘤
的平均重量)。结果如表3所示。杨树菇硫氧还蛋白对处理的小鼠的肿瘤的抑制 率可达36.36%，并且延长了荷瘤小鼠的寿命。
表3杨树菇硫氧还蛋白对荷S—180瘤小鼠肿瘤的抑制作用
处理死亡率肿瘤抑制率(重量)
0.1mg/2days TRX20%34.6%
0.1mg/2days生理盐水50%-
.在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明分上述讲授内容之后，本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
13SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120> —种真菌硫氧还蛋白的多肽、编码序列及制备方法和应用 <130> —种真菌硫氧还蛋白的多肽、编码序列及制备方法和应用 <160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 327
<212> DNA <213>杨树菇
<400> 1
atggttgtca aagctatcac ctcgttcgcc gagttcaaga ccctcatcga cagcggaaag cccatcctga ttgatttctg ggcaacgtgg tgtggaccct gcagggccat ctcgcccatc ttcgaaaagt tgtccgagag cgcagactac acaggcgttg ggttctacaa ggtcgatgtt gacgagcagc ctgagatttc gcaggaggtc ggcattagag cgatgcccac cttcctcttg ttcaaagacg gaaacaagcg taaggatgtc gttggtgctc gcccacaaga gcttgaggcc ctcatcaagg aggcggccac ccttgtc
60 120 180 240 300 327
<210> 2
<211> 109
<212> PRT <213>杨树菇
<400> 2
Met Val Val Lys Ala lie Thr Ser Phe Ala Glu Phe Lys Thr Leu lie
15 10 15
Asp .Ser Gly Lys Pro lie Leu lie Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly
20 25 30
Pro Cys Arg Ala lie Ser Pro lie Phe Glu Lys Leu Ser Glu Ser Ala
35 .40 45
Asp Tyr Thr Gly Val Gly Phe Tyr Lys Val Asp Val Asp Glu Gin Pro
50 55 . 60
Glu lie Ser Gin Glu Val Gly lie Arg Ala Met Pro Thr Phe Leu Leu 65 70 75 80
Phe Lys Asp Gly Asn Lys Arg Lys Asp Val Val Gly Ala Arg Pro Gin
85 90 95
Glu Leu Glu Ala Leu lie Lys Glu Ala Ala Thr Leu Val 100 .105
1权利要求
1、一种分离的编码真菌硫氧还蛋白的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
2、 一种分离的多肽，其序列为SEQIDNa2所示的氨基酸序列。
3、 权利要求2所述的一种真菌硫氧还蛋白的多肽制备方法，它包括下列步骤A、 提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以 此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO. l所示的全长序列；B、 酶切步骤A得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体；C、 将步骤B中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树 燕硫氧还蛋白的重组细胞；D、 将步骤C中得到的重组细胞在37"C培养过夜获得饱和培养物，将50pL 饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100pg/mL的培养基中，于37'C培养2小 时，取lmL培养物转移至微量离心管中，加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓 度为lmmol/L，对培养物进行诱导，诱导10小时；E、 利用Nr亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤D中在重组细胞中表达的多肽。
4、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防宫颈癌药物中的应用。
5、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防胃癌药物中的应用。
6、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防乳腺癌药物中的应用。
7、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防直肠癌药物中的应用。
8、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防前列腺癌药物中的 应用。
9、 权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种真菌硫氧还蛋白的多肽、编码序列及制备方法和应用。该分离多肽的编码序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是，首先是提取杨树菇的总RNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，得到PCR产物；其次是酶切得到PCR产物和原核表达载体，构建重组表达载体；第三是将得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，得到表达杨树菇硫氧还蛋白的重组细胞；第四是将得到的重组细胞诱导培养过夜获得饱和培养物；等五是利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化在重组细胞中表达的多肽。多肽作为制备治疗或预防肿瘤疾病药中的应用。涉及的蛋白质具有抗肿瘤活性。在开发抗肿瘤药物方面有很大的应用价值。
文档编号A61P35/00GK101497886SQ20091006087
公开日2009年8月5日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者刘洪洪, 帅 姜, 慧 孙, 荣 栾, 一 梁, 涛 车, 陈义杰 申请人:武汉大学