专利名称：禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白的线性中和表位多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗原表位多肽及其应用，尤其涉及一种针对禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的中和性抗原表位多肽。属于分子检测领域。
背景技术：
禽网状内皮组织增生症是由禽网状内皮组织增生症病毒 (Retieuloendotheliosis Viruse, REV)群引起的火鸡、鸡、鸭、鹤鹁和我鸟等以淋巴-网状细胞增生为特征的一组综合症(Witter R L，Fadly A Μ· Reticuloendoetheliosis. In Disease of Poultry,Ilth edn，2003，517-535. Edited by Y M Saif, H J Barnes, J R Glisson，et al.Ames，IA, USA Iowa State Press.)，这些综合征包括急性网状细胞肿瘤形成、生长抑制综合症、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成。目前REV群包括缺陷型T株、雏鸡合胞体病毒、鸭传染性贫血病毒、脾坏死病毒和其他来自火鸡、鸡、鸭、雉和鹅的非缺陷型分离株。REV—般感染低日龄鸡，特别是新孵出的雏鸡及胚胎，感染后引起严重的免疫抑制或免疫耐受。而高日龄鸡免疫系统发育完善，感染后一般不出现或仅出现一过性病毒血症。Bagust等研究证明，REV可以直接或间接传播(Bagust T，Grimes T， Dennet D，et al. Infection studies on a retieloendotheIiosis contaminant of a commercial marek’s diseasevaccine. Aust Vet J，1979，55 :153-157.)。石开究结果表明， 污染REV的商业禽用疫苗也是其传播的一个重要因素，通过给鸡接种REV污染的马立克氏病疫苗、禽痘疫苗，亦可引起人工传播(McDougall J, Shilleto RiBiggs P M. Experimental infection of chickens with an Australian strain of retieuloendotheliosis virus in the turkey. Avian Pathol，1981，10 :163-169 ;Brunovskis P，Velicer LThe Marek’s disease virus unique short region alpha herpes virus homologs,fowlpox virus homologs, and Marekr s disease virus-specific genes.Virology,1995,206 324-338 ；Theodros T，Willie M. Detection of specific retieuloendotheliosis virus sequence and protein from REV-integrated fowlpox virus strains. Journal of virological Methods，2003，110 :99-104.) 另外，REV与鸡痘病毒和马立克氏病毒重组现象的发生，也必将成为造成REV临床发病率增高的一个重要因素(Kim T，Tripathy N. Reticuloendoetheliosis virus integration in the fowl poxvirus genome not a recent event. Avian Dis，2001，45 :663-669 ;Cui Z，Zhuang Q，Xu X，et al. Molecular and biological characterization of a Marek’ s disease virus field strain with retieuloendotheliosis virus LTR insert.virus genes，2010，40 :236-43)。禽网状内皮组织增生症病毒属于正反转录病毒亚科Y反转录病毒属的成员， 其核酸是单股正链线性RNA(ssRNA)的二聚体，即其基因组核酸是双倍体正股RNA，完全复制 REV 的基因组大约为 8. 3kb (Barbosa T，Zavala G，Cheng S，et al. Full genome sequence and some biological peoperties of retieuloendotheliosis virus strainAPC—566 isolated from endangered Attwater s prairie chickens. Virus Res，2007， 124 :68-77 ；Lin C，Chen C，Wang C，et al. Isolation，identification and complete genome sequence of an avian retieuloendotheliosis virus isolated from geese. Veterinary Microbiology，2009，136 (3-4) :246-249.)，不完全复制型(或缺陷型)T 株的基因组仅有约 5. 7kb (Cohen M，Rein R，Stephens C，et al. Baboon endogenous virus genome. III. non-Molecular cloning and structural characterization of defective viral genomes from the DNA of ababoon cell strain. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A， 1981,78 :5207-5211.), REV全基因组编码相应蛋白的顺反子图谱是5 ' -pl2_ppl8/pp2 0-p30-pl0-pol-gp90-gp20-p2 (E) -3r，这些蛋白成熟后根据其功能又可分为酶蛋白、囊膜蛋白和核心蛋白。囊膜蛋白(env)是糖蛋白，包括env基因编码的2个糖蛋白gp90和 gp20两条肽链，较小的gp20贯穿病毒的囊膜，称为穿膜蛋白(TM)，较大的gp90通过二硫键和氢键与TM相连，暴露于囊膜之外，称之为表面蛋白(SU)，TM和SU是env基因编码的前体蛋白经水解后产生的(Tsai ff, Copeland T, Oroszlan S, et al. Purification and chemical and immunological charaterization of avian retieuloendotheliosis virus gag-gene-encoded structural proteins. Virology, 1985,140 :289-312.)。其中，gp90 作为病毒的囊膜外糖蛋白，其C-末端表位位于感染细胞表面，其上有许多糖基化位点，在自然状态下可结合多糖；而且因gp90含有顺序和构象表位，所以它是REV的免疫显性蛋白， 且具有病毒的型特异性；另外，其C-末端抗原簇具有受体结合的功能，可诱导宿主机体产生补体介导的细胞毒性反应(Davidson I, Yang H, Witter R, et al. The immunodominant proteins of retieuloendotheliosis virus. Vet Microbo,1995,49 :273-284 ;Chen I,Cui Z, Lee L, et al. Serologic difference among nondefective retieuloendotheliosis virus. Arch Virol, 1987,93 :233-246.)。gp90还是诱导宿主产生中和抗体的主要蛋白质, 它非常容易发生变异，REV抗原的高度变异性主要体现在这一蛋白上。分析和确定病毒保护性抗原表位，已成为病毒诊断和开发表位疫苗的重要基础性研究工作。对于病毒的治疗方面，也将更多地依赖于功能性抗原表位尤其是中和活性表位的筛选与鉴定。传统的抗原表位分析方法，即抗体筛选重叠合成肽法，需预先明确抗原的氨基酸序列，再合成大量的肽段进行筛选，成本高，操作比较复杂，对于糖基化抗原及构象型抗原表位的筛选其局限性更明显。噬菌体随机肽库展示技术是将随机合成的一定长度的DNA插入噬菌体外壳蛋白III或VIII的基因中表达，从而在噬菌体表面展示出随机肽， 这种随机肽库容量很大，可用于研究分子间的相互作用，尤其适于筛选生物活性大分子的配体，应用该技术已成功地筛选到多种病毒抗原(HPV，HBV, HIV和HCV等)及多种肿瘤抗原的表位或模拟表位，并证实其中一些噬菌体呈现的短肽具有很强的免疫原性，所激发的抗体能识别天然抗原(Smith G. P.，and Petrenko V. A. , 1997, Phage display, Chemical Reviews,97(2) :391-410 ;Daniels D.A., Lane D.P.,1996, Phage peptide libraries, Methods Enzymol,9 :494-507 ；Zozulya S. , Lioubin M. , Hill R.J. , Abram C. , and Gishizky M. L. ,1999,Mapping signal transduction pathways by phage display,Nature Biotechnology, 17 :1193-1198.)。该技术弥补了传统方法的不足，使得经抗体途径分析和鉴定病毒保护性的抗原表位成为可能，对于病毒感染中的临床诊断和筛选疫苗候选分子具有重要的借鉴作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白的线性中和表位多肽，本发明所述的线性中和表位多肽其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明还提供了编码所述的线性中和表位多肽的核苷酸序列。进一步的，本发明提供了所述的线性中和表位多肽在制备检测或诊断禽网状内皮组织增生症病毒的试剂中的用途。及所述的核苷酸序列在制备检测或诊断禽网状内皮组织增生症病毒的试剂中的用途。本发明的一种检测或诊断禽网状内皮组织增生症病毒的试剂，其特征在于所述试剂中包括本发明所述的线性中和表位多肽。为了达到以上所述的目的，本发明采用的技术手段为本发明采用M13噬菌体随机12肽库(Ph. D. -12 )，对一株禽网状内皮组织增生症 gp90蛋白的(具有中和活性的)单克隆抗体A9E8进行3轮生物淘选，获得8个噬菌体阳性克隆，均能与A9E8发生特异性结合反应。继而对阳性克隆的融合12肽进行序列测定和序列比对，分析出A9E8所识别的表位肽基序为SVQYHPL (SEQ ID NO. I所示)，位于gp90的第 213 219位氨基酸之间。将gp90蛋白213SVQYHPl219序列及其逐一截短序列插入pGEX-6p-l 载体进行融合表达及western blot分析，确定了单克隆抗体A9E8识别禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的线性B细胞表位，该序列位于gp90蛋白213SVQYHPl219位氨基酸。将此基序与GenBank中已公布的所有非缺陷型禽网状内皮组织增生症病毒(REV-A)、缺陷型禽网状内皮组织增生症病毒(REV-T)、四株鸭脾坏死病毒(SNV)及一株鸡合胞体病毒的gp90氨基酸序列进行比对后发现，该基序在禽网状内皮组织增生症病毒群间高度保守，由此推断， A9E8表位可能是禽网状内皮组织增生症病毒群特异性表位。本发明为基于表位的基因工程诊断试剂的研制和多肽疫苗的设计提供依据。
图I为单克隆抗体A9E8与8个噬菌体克隆特异结合的ELISA检测结果；图2为表位基序与GenBank中所有REV群氨基酸序列比对结果；图3为目的蛋白的表达与分析；图4为融合表达多肽与单克隆抗体A9E8反应的Western blot分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。单克隆抗体和生化试剂(I)分泌抗禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (A9E8)由本实验室制备；其微生物保藏号是CGMCC NO 4143 ;保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2010年9月3日。该菌种已在发明名称为“抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体及其应用”的专利申请中保藏，该专利的申请号为 201010518065. 7，专利
发明者崔红玉, 王云峰, 王玫, 石星明, 赵妍 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所