一种禽网状内皮组织增殖症dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及动物病毒学领域，提供了一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗及其构建与应用，本发明将密码子优化的禽网状内皮组织增殖症病毒的env基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，克隆于pec启动子下，构建重组质粒Puc57-pec-env，质粒瞬时转染CEF后通过间接免疫荧光与荧光定量PCR可以检测到env基因的体外表达，将该重组质粒免疫SPF鸡后，鸡体可以产生较高的抗体水平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用，为禽网状内皮组织增殖症的防控提供了一种全新的免疫方式。
【专利说明】一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗 及其构建与应用。
【背景技术】
[0002] 禽网状内皮组织增殖症（Reticuloendoetheliosis，RE)是由反转录病毒科的禽 网状内皮组织增殖症病毒（Reticuloendoetheliosis virus，REV)引起的鸡、鸭、火鸡和 其它禽类的一组综合症，包括致死性网状细胞瘤、矮小综合症以及淋巴组织和其他组织的 慢性肿瘤。REV感染后禽生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；引起感染鸡的免疫抑制，干扰 其它禽病疫苗的免疫效果，导致免疫失败。REV与鸡马立克氏病病毒（Marek' s disease virus, MDV)以及禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV)已经成为鸡群中最主要的致 肿瘤病毒。目前，REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率可 能高达 21. 4% -71.0%。
[0003] 到目前为止，世界上还没有商品化地用于预防REV的疫苗，一方面是低毒力具有 良好免疫原性的弱毒株没有选育出来，另一方面，灭活疫苗的免疫效果不是很理想。目前， 国内外对RE疫苗的研究多集中于基因工程疫苗上。国内外对于RE相关疫苗也有所报道， Drechslor等人（Drechsler et al，2013)构建了一种能同时表达REV-env基因和禽疱疹 病毒2型VP22基因的DNA疫苗，给鸡免疫后，不能起到阻止感染REV，只是提供部分的保护 力。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中预防REV的疫苗存在的现实，本发明的发明人结合DNA疫苗技术， 提供了一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗及其构建与应用，本发明将密码子优化的禽网 状内皮组织增殖症病毒的env基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，克隆于pec启动子 下，构建重组质粒Puc57-pec-enV，质粒瞬时转染CEF后通过间接免疫荧光与荧光定量PCR 可以检测到env基因的体外表达，将该重组质粒免疫SPF鸡后，鸡体可以产生较高的抗体水 平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用，提供了一种全新的免疫方式。
[0005] 发明人首先获得了一种重组真核表达质粒Puc57-pec_env，对于该质粒，发明人将 其转化大肠杆菌DH5 α，即得到重组大肠埃希氏菌PuC57-peC-enV，为了验证其活性，发明 人将其进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其 保藏编号为：CGMCC No. 9363,验证结果为存活。
[0006] 发明人还给出了该质粒的具体构建方法，具体过程如下：
[0007] 首先对REV-env基因进行了密码子优化提高了 REV env基因在宿主鸡体内的表达 量，经过优化后的REV-env基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 之后将该质粒分别克隆入不同启动子（PEC、CMV和SV40)的下游，并对三种质粒进 行了体外表达活性的测定，最终筛选出了重组真核表达质粒Puc57-p ec-enV，该重组质粒在 鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF)中具有较强的转录活性，env基因可以 在CEF中高效表达，该表达质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；其中含有env表达盒 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 获得上述重组真核表达质粒Puc57-peC-enV后，发明人将其直接免疫SPF鸡，发现 免疫后的鸡体可以产生较高的抗体水平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用。
[0010] 为了进一步验证该质粒转化后的活性，发明人将其转化大肠杆菌DH5 α，即得到重 组大肠埃希氏菌Puc57-pec-enV，为了验证其活性，发明人将其进行了生物保藏，保藏单位 为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 9363,具体 保藏信息如下：
[0011] 保藏信息
[0012] 保藏时间：2014年6月19日
[0013] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0014] 保藏编号：CGMCC No. 9363
[0015] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0016] 分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli
[0017] 综上所述，本发明的发明人利用最新的DNA疫苗技术，提供了一种重组真核表达 质粒Puc57-pec-env，并将其作为禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗，将该重组质粒免疫SPF 鸡后，鸡体可以产生较高的抗体水平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用，提供了一种 全新的免疫方式，弥补了现有技术中REV疫苗的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明所提供puc57-pec_env真核表达质粒的构建示意图；
[0019] 图2为本发明中含不同启动子真核表达质粒的构建示意图；
[0020] 图3为含不同启动子的重组真核表达质粒转染细胞48h后的间接免疫荧光实验结 果示意图，
[0021] 图中 A 为 puc57-pec_env 重组质粒，B 为 pcDNA3. 1-cmv-env 重组质粒，C 为 puc57-sv40_env重组质粒，D为阴性对照；
[0022] 图4为含不同启动子的重组真核表达质粒转录活性比较示意图。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1REV env基因密码子优化
[0024] 通过基因设计使基因与宿主的密码子使用频率相匹配来提高蛋白表达水平，为了 提高REVenv基因在宿主鸡体内的表达量，根据REV env基因编码的氨基酸序列，参照鸡密 码子的偏好性，特别是密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译过程中不同的顺式元件，筛 选以及优化参数，调节疫苗基因表达和免疫原性，最终发明人设计合成了新的表达REN env 蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0025] 实施例2禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗的制备
[0026] 1、含不同启动子表达REV env真核表达质粒的构建
[0027] 根据GeneBank上查阅的REV-env的序列，经密码子优化后，送南京金斯瑞生物科 技有限公司合成。然后利用传统的分子生物学方法将密码子优化的REV env序列经Hindlll 和EcoR I双酶切定向克隆在PEC启动子的下游，具体克隆方法见图1 (含PEC启动子表达 REV env真核表达质粒的构建示意图），用同样的方法将密码子优化的REV env序列克隆 在CMV或SV40启动子的下游；这样就分别构建了 3个在不同启动子调控下的表达REV env 基因的真核表达质粒，构建成功的3个真核表达质粒分别命名为puc57-sv40-env-sv40pA、 pcDNA3. l-CMV-env_sv40pA 和 puc57-pec_env-sv40pA, 3 个真核表达质粒图见图 2,其中重 组真核表达质粒Puc57-pec-env，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；含有env表达盒序列， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0028] 2、含不同启动子表达REV env真核表达质粒体外表达活性的测定
[0029] 把构建成功的3种含不同启动子的重组真核表达质粒和空载体puc57根据 Lipofectamine?LTX and Plus Reagent(Cat.no. 11514-015)试剂盒进行转染，转染 48 小时后，经间接免疫突光检测，含3个启动子的质粒在鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF)均获得了成果表达（图3);
[0030] 为了定量检测不同启动子构建的重组真核表达质粒在CEF中的转录水平，将3种 质粒转染CEF 48h后，利用荧光定量PCR定量检测env基因的转录水平，结果见图4,综合 图3和图4的结果表明，与传统真核表达启动子SV40和CMV相比，含有PEC启动子的重组 表达质粒在CEF中具有最高的转录水平。
[0031] 实施例3禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗免疫效果评估
[0032] 100只SPF鸡分为5组，每组20只鸡，免疫之前所有鸡采血做REV抗体检测，所有 鸡REV抗体均为阴性。3周龄进行首免，6周龄进行二次免疫，免疫方式为质粒直接肌肉注 射，各组免疫方案见表1。免疫后至攻毒前每周采血做抗体检测。
[0033] 表1疫苗免疫方案
[0034]
【权利要求】
1. 一种重组真核表达质粒Puc57-pec-env，其特征在于：包含该质粒的大肠埃希氏菌， 其保藏编号为：CGMCC No. 9363,该质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. -种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗，具体为重组真核表达质粒Puc57-pec-en V。
3. 根据权利要求2所述的禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗，其特征在于：该质粒中整 合了 env表达盒序列，env表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【文档编号】A61P31/14GK104195163SQ201410422626
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】陈瑞爱 申请人:肇庆大华农生物药品有限公司, 广东大华农动物保健品股份有限公司