专利名称：禽网状内皮组织增生病病毒快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测禽网状内皮组织增生病病毒的器具，特别是涉及一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒的胶体金试纸条。
背景技术：
禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其他禽类以网状细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生病、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。RE是禽类最重要的免疫抑制性和肿瘤性疾病之一。REV感染的自然宿主有火鸡、鸡、鸭、鹅和日本鹌鹑，其中火鸡最易感染，并且有些病毒株对鸭的致病性比鸡更强。REV主要感染雏鸡，特别是新出孵的幼雏，感染后引起严重的免疫抑制或免疫耐受。而成年鸡的免疫机能较为完善，感染后一般不出现病毒血症。然而，由于该病的临床症状不典型，一直没有引起足够的重视。近年来该病在全球迅速蔓延，对养禽业的危害日趋严重。世界上很多国家和地区均从鸡或其它禽类中分离到REV。我国于1986年首次从南京地区的一患矮小综合征病例鸡群中分离到REV。至今，REV在国内鸡群中的流行已较为严重。2006年，有研究小组对全国5个省份9个规模化养禽企业的100多个鸡群约2400份血清样品进行检测，发现60%以上的鸡群曾感染过REV，不同地区不同鸡群的REV抗体的阳性率平均约为20%。REV感染不仅能引起肿瘤发生，还可引起鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩，使其免疫功能下降甚至丧失，从而导致严重的免疫抑制，以至感染鸡群极易继发感染其他疾病。REV与其他家禽免疫抑制病病毒如马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)共感染导致的混合感染、免疫抑制以及疫苗污染带来的潜在危害使得该病对养禽业的危害大大加剧。REV属于反转录病毒科。虽然不同毒株的致病力不太相同,但都具有相似的抗原性，即属于同一血清型。REV可分为完全复制型和不完全复制型(缺陷型)。完全复制型的REV可在多种禽类体内复制，主要通过鸡胚、火鸡胚、鸭胚及鹌鹑胚的成纤维细胞进行体外增殖培养，不完全复制型REV即为原型病毒T株。RE的诊断主要有常规实验室检测和分子生物学检测两大类方法。常规方法主要有病毒分离鉴定和REV抗体的血清学检测，包括琼脂凝胶沉淀试验(Agar gel precipitation test,AGP)、间接免疫突光抗体试验(Indirectimmunofluorescence assay, IFA)、酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)等方法。分子生物学方法主要有聚合酶链式反应(polymerase chainreaction, PCR)、突光定量PCR和环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)等。REV的病毒分离培养、PCR、荧光定量PCR和LAMP等检测技术操作复杂，需要昂贵的仪器设备，检测过程耗时较长，不适合生产一线或疫病现场的快速诊断需要。而AGP、IFA、ELISA等方法均只能用于REV抗体的检测。ELISA测定方法虽然具有特异、敏感等特点，但操作复杂、费时费力，需要特 定仪器设备和专业技术人员操作，很难在基层普及。因此，研究一种快速检测REV感染的检测技术非常重要而迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题:提供一种结果显示直观、准确、快速检测REV的试纸条，与其他检测方法相比，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、结果显示快速，检测成本低廉。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗REV抗体的检测印迹；所述抗REV抗体为抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成；金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7cm处印制有样品标记线；检测印迹与对照印迹的排列组合为“ Il ”、“/ /”、“ + + ”、“U”、“H--Γ”、“ h P’中的一种。
所述胶体金标记的抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的:
筛选抗REV的单克隆抗体细胞株，扩大培养后用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min收集细胞，以I X IO6 2X IO6个细胞/鼠的细胞量腹腔注射经产母鼠，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清,获得单克隆抗体腹水；
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶:在50 100 mL沸腾的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2% (wt)柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15 20 nm的胶体金溶胶；以0.1 mo I/L的K2CO3调节胶体金溶胶的pH值至8.5 9.5，以1:1000 I: 1300的印迹比将所述的单克隆抗体腹水加入胶体金溶胶中，印迹10 min后,加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的终浓度为 0.05%(wt), 4°C > 1500 3000 r/min 离心 20 min,除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000 r/min离心I h,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗REV单克隆抗体。所述抗REV的单克隆抗体细胞株是由以下方法建立的:
将原核表达REV囊膜糖蛋白gp90基因的载体重组质粒PET-28a-gp90转化大肠杆菌BL-21，挑选阳性单克隆菌培养，经IPTG诱导表达和培养，将超声波裂解后的上清液过镍柱纯化，得到纯化的REV gp90表达蛋白；
将纯化的REV gp90表达蛋白以20 30 μ g/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15 30 d ;最后一次加强免疫3 4 d后，将免疫小鼠眼球放血，拉颈处死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将I X IO8个脾细胞与2X IO7 5X IO7个NSO骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬后，1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞沉淀于37°C水浴中并在I min内缓缓加入0.7 1.0 mL的pH8.5 pH9.0的PEG-1500中，边加边轻轻摇晃，然后再缓慢加入GNK洗液15ml,37°C水浴5 min后补加GNK洗液至总体积为40 mL, 1000 r/min离心10 min,弃上清,将得到的细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，以200 μ /孔铺板至96孔细胞培养板，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养7 10 d，杂交瘤的培养上清用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗REV的单抗杂交瘤细胞株。所述GNK洗液是由以下方法制备的:称取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H2010.68g、NaH2PO4.2Η20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚红 0.03g，混合后加双蒸水至 3000 ml，115。。灭菌15 min。本发明的有益效果:
(I)本发明根据ELISA的基本原理，用免疫层析试纸检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原-抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况，即时获得检测结果，因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。(2)检测特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗的特异性和亲和力(结合力)影响很小，且具有较高的印迹率。(3)操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。(4)结果显示直观、准确。该试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上显示两条棕红色印迹，表示在被检测样品中有病毒检出，结果为阳性；在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示在被检测样品液中未检出病毒，结果为阴性。结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。(5)减少投资和检测成本。使用该试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本，检测费用低。(6)应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
图1为本发明试纸条的俯视结构示意图。
图2为图1试纸条的侧面结构示意图。图中I为支撑层，2为样品吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水层，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为印迹线。
具体实施例方式实施例1:一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒的试纸条，参见图1和图2，支撑层I以塑胶薄片条制成，样品吸附纤维层2以玻璃棉制成，金标抗体纤维层3上附着有胶体金标记的抗REV单克隆抗体的玻璃棉制成的金标抗体，纤维素膜层4为硝酸纤维素制成，吸水层5由吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层依次粘贴在支撑层I上，彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。纤维素膜层4上设有抗REV多克隆抗体IgG溶液标记检测印迹6 (代号T)，以及以羊(兔)抗小鼠IgG溶液标记出对照印迹7 (代号C);检测印迹与对照印迹的排列形式为“ I I ”。测试端保护膜8-1覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面，在测试端保护膜8-1上偏向于样品吸附纤维层2的一侧0.5cm处印有印迹线9，印迹线右端印有箭头及MAX字样，吸水层5上覆盖有其它颜色(如黄色或蓝色)的手柄端保护膜8-2。用于对照印迹的羊(兔)抗小鼠IgG抗体，及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗REV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下:
(I)羊(兔)抗小鼠IgG的制备
以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4°C冰箱内2小时，在4°C、10000 r/min离心15 min,弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33%，置4°C冰箱内2小时，在4°C、10000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜透析，换液2_3次，在4°C、10000 r/min条件下离心15min,收集上清液，以紫外分光·光度计测定其蛋白浓度。经皮下或肌肉以50 μ g 100 μ g/kg体重的剂量注射IgG至抗体阴性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20 d后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，分离制备高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊(兔)抗小鼠的IgG (其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于标记本发明试纸条的对照印迹。(2)抗REV单克隆细胞株的建立
将原核表达REV囊膜糖蛋白gp90的重组质粒PET-28a-gp90转化大肠杆菌BL-21，挑取阳性单克隆菌落，接种于5 mL LB液体培养基中，37°C摇振培养过夜。取5 mL培养物接种于100 mL LB液体培养基中，37°C摇振培养约3 h，达到对数生长期，即OD6tltl约0.8 1.2，按照每毫升培养基加入10 μ I 100 mmol/L IPTG至终浓度为1.0 mmol/L诱导表达，28°C条件下缓慢摇振培养4 5 ho在4°C、5000 r/min条件离心15 20 min,弃上清,按I g湿重菌体/2 5 ml平衡缓冲液的比例充分悬浮菌体沉淀。用超声波裂解仪裂解，直至云雾状的菌液变得比较清亮，4°C、15000 rpm离心15 min，收集上清备用。将上清液上样至用平衡缓冲液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑5 mmol/L，pH8.0)平衡的镍离子亲和层析柱，再依次分别用含30、50、75 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液(NaCl 500 mmol/L.PB 20 mmol/L, pH7.4)进行分阶段洗脱，收集各阶段洗脱液。将各阶段洗脱峰进行SDS-PAGE分析，电泳完毕后用考马斯亮蓝G2250 (甲醇:水:冰乙酸=4.5: 4.5: I)室温染色2 h，用脱色液(40%甲醇、10%冰乙酸)脱色至背景清晰，观察纯化结果表明:重组菌经IPTG诱导后有明显的与预期大小相符的目的蛋白条带，表明REV囊膜糖蛋白gp90在万.中获得了大量表达。经亲和层析的重复洗脱液中，前两次洗脱的纯化蛋白含量最大，此后洗脱液中含量迅速减少，电泳与浓度测定结果一致。洗脱液中的REVgp90表达蛋白纯度较高，可满足单抗制备免疫原的需要。将纯化的重组REV gp90表达蛋白以20 30 μ g/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠三次,每次间隔15 30天；最后一次加强免疫后3 4d,将免疫小鼠眼球放血，拉颈处死，于75%( V)的酒精溶液肿浸泡5 10 min,无菌取其脾细胞；剪碎并经 100 目尼龙网过滤，用GNK 洗液(NaCl 24g、KCl 1.2g,Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H20 2.34g、葡萄糖6g、苯酹红0.03g,混合后加双蒸水至3000 ml,115°C灭菌15min)混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将I X IO8个的脾细胞与2 X IO7 5 X IO7个的NSO骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬后，1000 r/min离心10 min弃上清，细胞沉淀于37°C的水浴中在I min内缓缓加入0.7 1.0 mL的PEG-1500 (pH8.5 pH
9.0)边加边摇，然后缓慢加入GNK洗液15 ml，以终止PEG的作用；37°C水浴5 min后补加GNK洗液至总体积为40 ml, 1000 r/min离心10 min弃上清，将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，以200 PL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37°C、5% CO2培养箱中培养7 10 d，用IFA检测杂交瘤细胞的培养上清，挑选荧光较强的阳性孔细胞克隆，有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选获得特异性抗REV的单克隆杂交瘤细胞株。(3)抗REV金标单克隆抗体和金标单克隆抗体纤维膜的制备
将筛选到的特异性抗REV的单克隆细胞扩大培养，PBS洗后1000 r/min离心10 min,收集细胞，以IX IO6 2X IO6个/只的细胞量对经产母鼠进行腹腔注射，10-20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后的上清即为所需的单克隆抗体腹水。
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶:在50 100 mL沸腾的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2%柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径15 nm左右的胶体金。以0.1 mol/L的KfO3调胶体金pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印迹比将待印迹的抗REV单克隆抗体腹水加入pH8.5 9.5的金溶胶中，印迹10 min后，加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 终浓度达到 0.05%，4°C下、1500 3000 r/min 离心 20 min,除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000 r/min离心I h,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金印迹的抗REV单克隆抗体。将1:100 1:500稀释的胶体金印迹的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉(尼龙纤维或聚酯纤维)中，4°C下低温真空干燥，即制得抗REV金标单克隆抗体纤维膜。(4)抗REV多克隆抗体的制备
差速离心或蔗糖密度梯度离心对REV CEF细胞毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后用福氏佐剂乳化制备免疫抗原，单独多次免疫接种抗体阴性健康羊或兔。末次免疫20 d后静脉采血，以IFA检测其血清抗体效价在1:2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，分离制备高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)。
(5)试纸条的检测操作方法
a、样品液的制备无菌取病鸡的全血，以抗凝剂生理盐水作1:10 1:50倍稀释，离心分离血液淋巴细胞悬液，待检；若取病鸡的组织如胸腺、法氏囊、脾脏等，则将其剪碎、研磨，以生理盐水制成1:2 1:5倍的待检测样品悬液，反复冻融3次，置4°C澄清或离心取上清备用；
b、检测操作将该试纸条测试端插入待检测样品中，插入深度不超过印迹线(MAX)，约30 s后取出试纸条,水平放置约I 5 min,同时观察结果。C、结果判断如果在试纸条的纤维素膜上只显示出一条棕红色对照印迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出REV ;如果试纸条上的纤维素膜出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中检出REV;如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。(6)本发明试纸条的灵敏性、特异性试验
a、灵敏性试验。将REV的CEF细胞培养液用PBS (PH7.4)或双蒸水分别配制不同病毒滴度的溶液(105.° TCID5Q/mL、IO4.。TCID50/mL、IO3.0 TCID5(l/mL、IO2 0 TCID50/mL、IO1.0 TCID50/mL)，将检测试纸条测试端插入这些不同病毒滴度的溶液中，插入深度不超过印迹线(MAX)，约30 s后取出试纸条，水平放置约I 5 min,同时观察结果。插入105_° TCID5(l/mL和104_°TCID5tlAiL病毒液的检测试纸均出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T，即检测结果为阳性；插入103_° TCID5tlAiL病毒液的检测试纸出现棕红色的对照印迹C，但检测印迹T的棕红色较弱，即检测结果为弱阳性；插入102_° TCID5tlAiL和101° TCID5tZmL病毒液的检测试纸只显示出一条棕红色对照印迹C，即检测结果为阴性。由此可见，该试纸条对REV具有较高的灵敏度，可以检测REV的最低病毒滴度为103_° TCID5(l/mL。b、特异性试验。用本发明的试纸条检测其它家禽免疫抑制病病毒:马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)的病毒液，结果显示上述3种病毒液用本发明试纸条检测的结果均为阴性，说明该试纸条的特异性强，与其他同类病无交叉反应。(7)上述试纸条的检测原理
当试纸条测试端(样品吸附纤维层)插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检病鸡病毒及金标抗体纤维膜中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端的吸水层中，扩散过程中待检病毒可与该病毒相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗该病毒的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹T ;而对照印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有REV，试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C ;如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。实施例2:检测网状内皮组织增生病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于:由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着以胶体金标记的抗REV金标多克隆抗体；在硝酸纤维制成的纤维素膜层4上设有以抗REV单克隆抗体IgG溶液喷涂的检测印迹T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液喷涂的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。实施例3:检测网状内皮组织增生病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于:由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗REV金标的单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成 的纤维素膜层4上设有以对应的抗REV多克隆抗体IgG溶液标记的检测印迹T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液标记的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。实施例4:检测网状内皮组织增生病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于:由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着抗REV的金标多克隆抗体；聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上设有以对应的抗REV单克隆抗体IgG溶液标记的检测印迹T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液标记的对照印迹C。实施例5:检测网状内皮组织增生病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于:由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗REV的金标单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上设有以识别另一表位的抗REV单克隆抗体IgG溶液印制的检测印迹T，以羊(兔)抗鼠IgG溶液印制的对照印迹C，检测印迹与对照印迹的排列组合为“/ /”、“ + + ”、“1^”、“丁丁”、“ h卜”中的任意一种。实施例6:试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于: 支撑层I由不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成，纤维素膜层4用纯纤维素膜制成。实施例7:试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于:
样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4用羧化纤维素膜制成。实施例8:试纸条结构和实施例3基本相同，不同之处在于:样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯(PVDF)纤维膜制成。实施例9:试纸条结构和实施例5基本相同，不同之处在于:样品吸附纤维层2用聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4用纯纤维素膜制成。
权利要求
1.一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于:所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗REV抗体的检测印迹；所述抗REV抗体为抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7 cm处印制有样品标记线。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于:检测印迹与对照印迹的排列组合为“ Il，，、“/ /”、 “ ++”、“丄丄”、“丁丁”、“ 1- P’中的一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的试纸条，其特征在于:所述胶体金标记的抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的: 筛选抗REV的单克隆抗体细胞株，扩大培养后用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min收集细胞，以I X IO6 2X IO6个细胞/鼠的细胞量腹腔注射经产母鼠，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清,获得单克隆抗体腹水； 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶:在50 100 mL沸腾的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2% (wt)柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15 20 nm的胶体金溶胶；以0.1 mo I/L的K2CO3调节胶体金溶胶的pH值至8.5 9.5，以1:1000 I: 1300的印迹比将所述的单克隆抗体腹水加入胶体金溶胶中，印迹10 min后,加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的终浓度为 0.05%(wt), 4°C > 1500 3000 r/min 离心 20 min,除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000 r/min离心I h,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗REV单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于:所述抗REV的单克隆抗体细胞株是由以下方法建立的: 将原核表达REV囊膜糖蛋白gp90的载体重组质粒PET-28a-gp90转化大肠杆菌BL-21，挑选阳性单克隆菌培养，经IPTG诱导表达和培养，将超声波裂解后的上清液过镍柱纯化，得到纯化的REV gp90表达蛋白； 将纯化的REV gp90表达蛋白以20 30 μ g/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15 30 d ;最后一次加强免疫3 4 d后，将免疫小鼠眼球放血，拉颈处死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将I X IO8个脾细胞与2X IO7 5X IO7个NSO骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬后，.1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞沉淀于37°C水浴中并在I min内缓缓加入0.7 .1.0 mL的pH8.5 pH9.0的PEG-1500中，边加边轻轻摇晃，然后再缓慢加入GNK洗液15ml,37°C水浴5 min后补加GNK洗液至总体积为40 mL, 1000 r/min离心10 min,弃上清,将得到的细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，以200 μ /孔铺板至96孔细胞培养板，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养7 10 d，杂交瘤的培养上清用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗REV的单抗杂交瘤细胞株。
10.根据权利要求9所述的试纸条，其特征在于:所述GNK洗液是由以下方法制备的:称取 NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚红0.03g,混合后加双蒸水至3000 ml,115°C灭菌15 min。
全文摘要
本发明公开一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗REV抗体的检测印迹；抗REV抗体为抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便、快速，结果显示直观、准确，无需附加设备和试剂，检测成本较低，适合禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测；使用范围广，便于推广应用。
文档编号G01N33/569GK103235122SQ20131013317
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者张改平, 罗俊, 滕蔓, 崔治中, 邓瑞广, 江国托, 赵东, 赵鹏, 柴书军, 程娜, 胡骁飞, 职爱民, 杨苏珍, 卢清侠, 郝慧芳 申请人:河南省农业科学院