专利名称：霍乱毒素b亚单位和蚓激酶融合基因及包括该基因的重组载体及宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域基因重组技术，具体涉及一种融合基因以及基因工程菌的构建 方法。
背景技术：
蚓激酶(Lumbrokinase， LK)，又称作蚯虫引纤溶酶(Earthworm plasminogen activator, EPA)， 是从蚯弼l体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶。它广泛分布于蚯蚓的消化道内腔中， 能直接降解血中纤维蛋白原并激活纤溶酶原为纤溶酶。大量研究表明蚓激酶无论静脉或口服 给药，均具有溶栓作用。顿激酶既可直接溶栓，又能激活溶栓；并能降低血小板聚集率(抑制 内源凝血功能亢进)，促进血管内皮细胞产生t-PA[Iannucci NB， Camperi SA， Cascone O， Purification of lumbrokinase from Eisenia fetida using aqueous two-phase systems and anion-exchange chromatography, Separation and Purification Technology, 2008, 64(1): 13卜134]，并抑制PAI生成(增强内源纤溶活性)， 抑制内皮素(ET)的縮血管作用(舒张平滑肌，缓解血管痉挛)，降低血液粘度(促进微循环)。作 为溶栓药物，顿激酶先后在韩国和中国上市，在脑血管血栓性疾病治疗中显示出明显的疗效。 霍乱毒素(CT)是由霍乱弧菌产生的分子量为84kD的肠毒素，由1个A亚早位(CTA)和5 个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成。CTA为毒性亚单位，CTB为无毒的受体结合 亚单位，可以和所有,有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合。A亚单位通过B亚单位的 作用进入细胞发挥其毒性作用[Sprander BD Structure and function of cholera toxin and related Escherichia coil heat lable enterotoxin [J] Microl， Rew. 1992， 56: 622-643]。 CTB具有较强的免 疫佐剂活性，特别是当其经化学方法或基因融合技术使其与不相关抗原形成偶联蛋白或融合 蛋白时，其免疫佐剂活性强于其与不相关抗原混合免疫时的佐剂活性。由于CTB可以和所有 有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合，基于此特性，研究发现CTB不仅可以用于免 疫佐剂，还能够作为有效的药物呈递载体。药物在肠道中的通透性成为药物蛋白穿过肠上皮 细胞进入血液循环系统的主要障碍。然而受体接导的口服呈递系统为药物蛋白的吸收提供了 可行的途径。为了验证CTB是否能够成为有效的蛋白药物呈递载体，Arati等人将CTB与 GFP蛋白基因，并在烟草叶绿体中实现了表达。用这种烟草喂食小鼠，并对服用这种烟草的 小鼠作了详尽的生理生化分析[Arati Limaye, Vijay Koya，l Mohtashem Samsam, and Henry Daniell. Receptor-mediated oral delivery of a bioencapsulated green fluorescent protein expressed in transgenic chloroplasts into the mouse circulatory system. 7Tze FJ5^ Jbwm" /2006， 20:37-46.]。 在这项研究中，他们发现，CTB-GFP融合蛋白能被肠道上皮细胞和肠相关淋巴组织吸收。五 聚体融合蛋白能够结合到细胞膜表面的GM1受体上，并通过胞吞作用进入吞噬小体。随后这种融合蛋白进入内质网，在此处，胞内广泛存在的Furin酶将融合蛋白切开，CTB和GFP蛋 白分开，CTB被带到细胞的基底一侧，仍然与GM1受体结合着。而GFP分子则通过高尔基 体被排除细胞外，从而进入淋巴循环，进一步进入血液循环系统。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CTB和LK融合基因。 本发明的第二个目的是提供一种构建含CTB与LK融合基因的毕赤酵母表达载体 pPIC9k-Cr5-Fw〃力-丄^。
本发明的第三个目的是提供一种含有CTB和LK融合基因工程菌。 本发明的第四个目的是提供一种CTB和LK融合基因编码的蛋白。 本发明的第五个目的是提供CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下
一种霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因，由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序 歹U，所述霍乱毒素B亚单位简写为CTB，所述蚓激酶简写为LK。
一种含CTB与LK融合基因的重组载体pPIC9k-Cr5-F^/"-i^:,由下述步骤构建而成
(1) 构建含有CTB与LK融合基因的中间载体pBluescript SK-C7^-i^r/"-^::
① 将SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽连接序列基因用全合成方 法连接，置于载体pBluescript SK-C7^;
② 将SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方法合成置于载体pUCm-T-iX;
③ 设计由SEQ ID N0.5所示的上游引物Pl，和由SEQ ID N0.6所示的下游引物P2，以 pUCm-T-i:A:质粒为模板，进行PCR扩增，获得Furin-LK融合基因，所述Furin基因序列如 SEQ ID N0.4所示；
将Furin-LK融合基因经五coRI和///"dill双酶切，将载体pBluescript SK-C715经￡coRI和 历"dIII双酶切，二者进行连接反应，得到含SEQ ID NO.l所示的CTB基因、SEQ ID N0.3 所示的柔性肽连接序列基因、SEQ ID N0.4所示的Fw/w基因和SEQ ID N0.2所示的LK基因 的中间载体pBluescript SK-Cr5-Fw〃"-ZA:;
(2) 构建表达载体pPIC9k-C7^-尸wW"-丄/::
设计由SEQ IDN0.7所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0.8所示的下游引物P4，以pBluescript SK-Cra-Fwn77-iX为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经M^I酶切，将毕赤酵母表达 载体pPIC9k经酶切，二者进行连接反应，得到含CTB与LK融合基因的重组载体 pPIC9k-C7^-F,'w-仏
一种含CTB和LK融合基因工程菌，将pPIC9k-C7^-Fw/"-Lfi:线性化后整合于毕赤酵母 GS115的基因组上。
一种由CTB和LK融合基因编码的蛋白，是序列表中SEQ IDN0.9所示氨基酸序列。一种CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。 .
本发明的优点在于由CTB和LK融合而成的融合基因，通过毕赤酵母GS115能高效表达 CTB与LK融合蛋白，其表达系统的产率较高，毕赤酵母表达稳定，应用十分广泛，经纯化 的融合蛋白经检验具有生物学活性，可以制备成为融合蛋白药物，融合蛋白药物对治疗血栓 有明显功效，同时CTB作为佐剂可明显提高LK的口服吸收利用率，大大提高了LK的药效 作用。
图1 pPIC9k-C7^-Fwn力-丄咒酶切及PCR验证结果。 图2毕赤酵母菌落PCR产物电泳结果。 图3发酵粗提液SDS-PAGE蛋白质电泳结果。 图4小鼠尾部血栓长度测量结果。
具体实施例方式
实施例1
中间载体pBluescript SK-Cr5-Fwn'"-丄AT的构建
首先，将SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽连接序列基因用 全合成方法连接，置于载体pBluescript SK-Cr5;将SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方 法合成置于载体pUCm-T-丄《。其次，以pUCm-T-iX为模版，PI和P2分别为上下游引物扩 增LK片段，其反应条件为94°C， 30s， 55°C， 30s, 72°C， 90s，循环30次。在PI中引入 五coRI酶切位点(GAATTC)，在P2中引入历wdlll酶切位点(AAGCTT)。然后，PCR产物 与pBluescript SK-Cra质粒分别经&oRI和历wdUI双酶切，将二者酶切产物连接16°C，过 夜连接(2 pi 10xT4 buffer, 0.5 pi T4 DNA连接酶，5 pi载体DNA， 7.5 pi外源DNA， 5 pi ddH20)。连接产物转化￡-Co//. Z)^5ct，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行PCR 得到850bp产物，酶切鉴定得到目的条带，最后测序验证结果表明载体构建正确。 实施例2
表达载体pPIC9k-CZS-iX构建过程 首先，以pBluescript SK-CTff-fV/w-iX为模版，P3和P4分别为上下游引物扩增 Cr5-尸w/"-L^片段，其反应条件为94。C， 30s， 54°C， 30s， 72'C， 120s，循环30次。在P3 中引入A^I酶切位点(GCGGCCGC)，在P4中引入M^I酶切位点(GCGGCCGC)。然后， PCR产物与pPIC9k质粒分别经AWI单酶切，将二者酶切产物连接16。C，过夜连接(2 pi 10xT4 buffer, 0.5 lalT4DNA连接酶，5 ^载体DNA， 7.5 pi外源DNA， 5plddH20)。连接产物转 化￡-CW/. D/Z5a，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到1200bp左右产 物，酶切鉴定得到目的条带，晕后测序验证结果表明载体构建IH确。见图1，图1中，M为 Marker DNADL 10 000,右侧电泳图为Marker各条带代表片段大小示意图；1为载体使用iVo/1进行单酶切，产生l 200bp左右和9 OOObp左右片断，说明有CTB-LK大小片断连接到pPIC9k 载体上；2为使用五coRI对载体进行单酶切，产生500bp左右和9 000bp左右片断，说明目标 片断已经被正向连接到pPIC9k载体上；3为PCR扩增CTB-LK产物，获得了很清晰的1 200 bp左右的目的条带，进一步说明目的基因CTB-LK已经连接于pPIC9k载体上。 实施例3
重组酵母菌的转化、筛选及鉴定
将构建正确的重组质粒pPIC9k-Cra-Fw/"-^:用feci线性化后，用电击法转入GS115中， 涂布于MD平板上，30。C培养2-3天后，用含不同浓度(0， 0.50， 1.00， 1.50， 2.00， 2.5禾口 3.00mg/mL) G418YPD平板筛选高拷贝数的转化子，提取转化子基因组，以目的基因为引物 PCR后经核酸电泳鉴定，得到预期1200bp条带，表明目的基因已整合到酵母染色体上。如图 2，挑取的10个扭5+(由MD平板筛选)和3.00mg/mLG418抗性克隆进行菌落PCR， 1、 3、 4、 5、 7、 9和10泳道为阳性克隆，而2、 6和8泳道没有明显条带。M为Marker III，右侧 电泳图为Marker各条带代表片段大小示意图。 实施例4
重组蛋白的诱导表达
将筛选得到的重组酵母菌转化子接种到BMGY培养基中，培养至0D值6左右，离心 (4000r/min， 5min)，将菌体转接至诱导培养基BMMY中进行表达，每隔24h取样并补加甲 醇至1%，培养5天后，离心(4000r/min， 5min)，收集培养上清，取不同量的培养液上清进 行SDS-PAGE电泳结果表明，目的基因获得高效表达，得到目的蛋白条带，序列如序列表SEQ ID N0.9所示氨基酸序列。见图3，图3为发酵粗提液SDS-PAGE蛋白质电泳结果，泳道M 为蛋白Marker,右侧电泳图为Marker各条带代表片段大小示意图；泳道1为表达LK的上清 液中提取物SDS-PAGE电泳图；泳道2为表达CTB和LK融合基因编码的蛋白上清液中提取 物SDS-PAGE电泳图；泳道3为空白对照。从图3中可以看出LK分子量约为30kD， CTB 和LK融合基因编码的蛋白约为45kD，分子量与预期相符。 实施例5
发酵上清液中蛋白的提取
1. 毕赤酵母上清液的浓縮
(1) 大量的发酵上清液首先进行抽滤泵的抽滤，抽滤漏斗上放置三层定性滤纸，除去大量 的酵母细胞和发酵液中的杂质；
(2) 抽滤得到的发酵上清液再过0.22pm的滤膜，进一步除去发酵液中的杂质；
(3) 澄清的发酵上清液进行硫酸铵浓縮，沉淀蛋白，在发酵上清液中缓缓加入无水硫酸铵， 并用磁力搅拌器均匀搅拌，避免速度过快导致蛋白变性，直到硫酸铵达到55%的浓度，此时 绝大部分蛋白均以沉淀形式析出；
(4) 12 000 r/min， 4。C离心20min，去掉上清，沉淀用适量的PBS缓冲液溶解(pH7.2)，储 存在4'C备用。
2. 透析袋透析(1) 对透析袋进行浸泡、煮沸等预处理，由于市场所出售透析袋含有化学杂质，为了除去 这些杂质，通常用1Ommol/L的NaHC03和lmmol/L的EDTA溶液煮沸透析袋30min，煮沸 后，用双蒸水充分洗涤透析袋，洗毕，于4。C储存于lmmol/EDTA溶液中，以防微生物污染。
(2) 将透析袋的一端打两个死结，用移液管或漏斗将硫酸铵沉淀的蛋白溶液移于透析袋 中。在透析袋的另一端打两个死结，并将其放入20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)中透析过夜， 并在期间更换缓冲液，使硫酸铵充分透析掉，这个过程蛋白溶液不要超过袋体积的1/3，否则 透析过程中透析袋容易涨破。
3.冷冻干燥
(1) 将透析过的蛋白溶液置于三角瓶中，-20^迅速冷冻，锡箔纸封口，同时将锡箔纸上用 针穿一些小洞；
(2) 将已经冷冻的蛋白溶液置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥48h;
(3) 将冷冻干燥的蛋白粉末用lmL20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)溶解，储存在4。C备用。 实施例6
小鼠的饲养及血栓模型的建立验证CTB和LK融合基因编码的蛋白活性 根据文献报道，通过向小鼠背部皮下注射卡拉胶可诱发小鼠尾部形成血栓模型，此模型 可以从体表测量尾部变换的范围和程度来反映血栓形成发展的全过程。本实验采用昆明雄性
小鼠，SPF级，动物许可证号为SCXK-(军)2002001，体重20g左右，诱发血栓形成药物 卡拉胶用生理盐水配置成0.5%溶液，小鼠腰背部皮下注射。见图4，图4为小鼠尾部血栓长 度测量结果，1:灌喂水对照组；2:灌喂空载体转化的毕赤酵母提取物对照组；3:灌喂LK 蛋白提取物组；4:灌喂CTB和LK融合基因编码的蛋白提取物组。灌喂水对照组和灌喂空 载体转化的毕赤酵母提取物对照组结果比较相似，小鼠尾部血栓长度约为占整尾长度35%左 右，而灌喂LK蛋白提取物组小鼠尾部血栓长度约为占整尾长度28。/。左右，灌喂CTB和LK 融合基因编码的蛋白提取物组小鼠尾部血栓长度约为占整尾长度17%左右，二者相对于水对 照组皆有显著性差异，说明在实验中所得到的CTB和LK融合基因编码的蛋白不但具有抑制 血栓形成的作用，而且佐剂CTB可以发挥其增强LK吸收利用的效果。
<110>天津大学
<120>霍乱毒素B亚单位和弼l激酶融合基因及包括该基因的重组载体及宿主细胞
<160>10
<210>1
<211>372
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(372)<400>1
atgattaaat taaaaitttgg ggaacacctc aaaatattac ctaaatgata agata/ttttc attactttta agaatggtgc tcacaaaaaa aagcgattga gctaaagtcg aaaagttatg agtatggcaa at 372
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<212>DNA
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<220>
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〈211〉1284
〈212〉DNA
<213>人工序列
〈220〉
〈221>gene
<222〉 (1)…(1284) ' 〈400〉10
atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60 ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatatatacg 120 ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180 attactttta agaatggtgc aatttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240tcacaaa^aa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300 gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 兆0 agtatggca3 atggtgg鄉cggttcaggc gg郷tggct ctggcggtgg cggatcggaa 420 ttccgcgcta ggcggatgtt acttctcgct cttgcatcac tcgtagcagt gggctttgcc 480
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ggttgcgcttctggctatccaggagtctactccagggtcggatttcacacagcatggatc1260
accgacatcat caccaacaactaa 128权利要求
1. 一种霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因，其特征是由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述霍乱毒素B亚单位简写为CTB，所述蚓激酶简写为LK。
2. —种含CTB与LK融合基因的重组载体pPIC9k-Cra-FwWw-L^其特征是由下述步骤构建而成(1) 构建含有CTB与LK融合基因的中间载体pBluescript SK-Cra-fwn'"-L^① 将SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽连接序列基因用全合成方 法连接，置于载体pBluescript SK-Cr5;② 将SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方法合成置于载体pUCm-T-ZX;③ 设计由SEQ ID N0.5所示的上游引物Pl，和由SEQ ID N0.6所示的下游引物P2，以 pUCm-T-ZX质粒为模板，进行PCR扩增，获得Furin-LK融合基因，所述Furin基因序列如 SEQ ID N0.4所示； 将Furin-LK融合基因经￡coRI和州"dIII双酶切，将载体pBluescript SK-C775经￡coRI和 州wdIII双酶切，二者进行连接反应，得到含SEQ ID NO.l所示的CTB基因、SEQ ID N0.3 所示的柔性肽连接序列基因、SEQ ID N0.4所示的Fw/"基因和SEQ ID NO.2所示的LK基因 的中间载体pBluescript SK-C7^-Fw/"-ZX;(2) 构建表达载体pPIC9k-C7S-Fw〃'"-Z^::设计由SEQ ID N0.7所示的上游引物P3，和由SEQ ID NO.8所示的下游引物P4，以pBluescript SK-C7^-F,' -Z《为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经A^I酶切，将毕赤酵母表达 载体pPIC9k经AWI酶切，二者进行连接反应，得到含CTB与LK融合基因的重组载体pPiC9k-cr5-Fw〃力-i:A:。
3. —种含有权利要求1所述的CTB和LK融合基因工程菌，其特征在于将由权利要求2所 构建的pPIC9k-Cr5-Fwn'"-ZA:线性化后整合于毕赤酵母GS115的基因组上。
4. 一种由权利要求1所述的CTB和LK融合基因编码的蛋白，其特征是序列表中SEQ ID N0.9 所示氨基酸序列。
5. —种CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因及包括该基因的重组载体及宿主细胞，霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因是由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。本发明的优点在于由CTB和LK融合而成的融合基因，通过毕赤酵母GS115能高效表达CTB与LK融合蛋白，其表达系统的产率较高，毕赤酵母表达稳定，应用十分广泛，经纯化的融合蛋白经检验具有生物学活性，可以制备成为融合蛋白药物，融合蛋白药物对治疗血栓有明显功效，同时CTB作为佐剂可明显提高LK的口服吸收利用率，大大提高了LK的药效作用。
文档编号C12N15/62GK101434964SQ20081015423
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者关春峰, 静 季, 罡 王 申请人:天津大学